elektroforeza białek - Dolina Biotechnologiczna

Najpopularniejsze
metody
stosowane w biotechnologii —
elektroforeza białek
Wraz z rozwojem nauki w zakresie budowy materii i cząsteczek pojawiła
się potrzeba rozdzielania cząstek charakteryzujących się różnymi
właściwościami i wielkością. Opracowano wiele metod wykorzystujących
różne zjawiska fizyczne, jednak najbardziej popularnymi okazały się
techniki elektroforetyczne.
Elektroforeza wykorzystuje zdolność migracji różnych biocząsteczek. Jest
zjawiskiem elektrokinetycznym, w którym pod wpływem przyłożonego pola
elektrycznego białka obdarzone ujemnym ładunkiem elektrycznym przemieszczają
się w kierunku od anody do katody w odpowiednio przygotowanych żelach,
których cząsteczki tworzą sieć ograniczającą swobodną migrację cząsteczek. W
wyniku tych „utrudnień” szybkość przemieszczających się białek lub kwasów
nukleinowych zależy od ładunku, wielkości i budowy cząsteczek.
Powszechnie stosowane metody elektroforetyczne są kombinacjami lub
pochodnymi trzech podstawowych rodzajów separacji. Pierwszym z nich jest
elektroforeza strefowa, która odbywa się w nośniku, w którym elektrolit ma w
całej objętości stałą wartość pH. Jest ona podstawowym i najszerzej stosowanym
rodzajem elektroforezy. Izotachoforeza odbywa się w nośniku,w którym występuje
nieciągłość wartości pH, co oznacza, że próbki migrują w obszarze pomiędzy
dwoma elektrolitami o różnej wartości pH i różnej ruchliwości jonów. Ostatni
rodzaj separacji to ogniskowanie izoelektryczne, w którym rozdział odbywa się w
nośniku, w którym wartość pH buforu zmienia się w sposób ciągły od wartości
najwyższej przy katodzie do najniższej przy anodzie.
Podstawowy podział odmian technik elektroforetycznych
Elektroforeza natywna prowadzona jest zwykle w poliakrylamidzie w
warunkach, w których makrocząsteczki pozostają niezdenaturowane. Zaletą tej
metody jest możliwość odzyskania aktywnych biologicznie cząsteczek białkowych,
natomiast wadą słaba rozdzielczość.
Elektroforeza w obecności SDS jest najczęściej wykorzystywana do rozdziału
białek. Zastosowanie siarczanu dodecylu sodu (SDS), substancji powierzchniowo
czynnej, przyczynia się do znacznego poprawienia rozdzielczości. Ponadto
separacja białek odbywa się zgodnie z ich masami cząsteczkowymi. Również
barwienie kompleksów białko-SDS jest znacznie wydajniejsze niż samego białka.
Elektroforeza nieciągła jest połączeniem izotachoforezy z elektroforezą
strefową. Wykorzystuje się w niej dwa kontaktujące się ze sobą elektrolity o
różnym składzie i różnej wartości pH. W górnej części znajduje się żel
zagęszczający, w którym zachodzi izotachoforeza. Uporządkowane i zagęszczone
tam cząsteczki białka przechodzą do drugiej części nośnika zwanej żelem
separującym, w którym realizuje się elektroforeza strefowa. Dzięki zastosowaniu
tych dwóch rodzajów separacji uzyskuje się ostre prążki zawierające białka o tej
samej ruchliwości elektroforetycznej, co często jest interpretowane jako białka o
tej samej masie cząsteczkowej.
Ostatnią odmianą technik elektroforetycznych jest elektroforeza 2D łącząca
dwa, a czasem nawet trzy rodzaje separacji. Procedura rozpoczyna się od
separacji białek techniką ogniskowania izoelektrycznego, które wykonuje się przy
pomocy elektroforezy rurkowej (elektroforeza pionowa) lub na paskach nośnika w
elektroforezie poziomej. Etap ten zwany jest pierwszym kierunkiem (wymiarem)
elektroforezy 1D. Następnie dokonuje się rozdziału cząsteczek według mas
cząsteczkowych. W tym celu może być stosowana elektroforeza nieciągła, czyli
izotachoforeza oraz elektroforeza strefowa, ale często stosuje się jedynie
elektroforezę strefowa. Po zakończeniu procedury 2D i wybarwieniu żelu uzyskuje
się dwuwymiarową mapę rozkładu białek. Przy zastosowaniu tej metody w łatwy
sposób można rozdzielić na jednym żelu kilka tysięcy białek. Ponadto pozwala ona
na stosunkowo łatwą analizę zmian ekspresji genu kodującego analizowane
białko.
Wizualizacja wyników
Sam rozdział nie kończy procedury separacji. Konieczna jest jeszcze wizualizacja
rozdzielonych biocząsteczek, ponieważ z reguły są one nie widoczne w białym
świetle. Białka najczęściej barwi się barwnikami takimi jak błękit kumassi (ang.
Coomassie Blue) czy czerń amidowa. Inną możliwością jest znakowanie
radioizotopowe, które odbywa się zawsze przed procesem separacji
elektroforetycznej, często na etapie syntezy. Do znakowania białek i peptydów
najczęściej wykorzystuje się izotopy jodu 125I lub 131I, rzadziej izotopy węgla
14C, wodoru 3H lub siarki 35S. Szczególnym rodzajem wizualizacji białek jest
barwienie enzymatyczne. Jego zastosowanie ograniczone jest tylko do białek
enzymatycznych, które w wyniku katalizy produkują barwny substrat.
Techniki elektroforetyczne są metodami bardzo często stosowanymi w praktyce
laboratoryjnej i trudno sobie wyobrazić wykonanie wielu eksperymentów bez ich
zastosowania.
Szczególnie zainteresowanym polecam animację.
Katarzyna Kamel
Źródło:
Metody i techniki biologii molekularnej w biotechnologii środowiskowej, A.
Raszka, A. Ziembińska, A. Wiechetek
Elektroforeza — przykłady zastosowań, pod red. B. Walkowiaka i V. Kochmańskiej
Elektroforeza
Data publikacji: 06.05.2013r.