pobierz plik - Wydział Biologii UW

mgr Agata Kodroń
Instytut Genetyki i Biotechnologii
Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego
Autoreferat rozprawy doktorskiej pt.
Podłoże molekularne dziedzicznej neuropatii wzrokowej Lebera
Promotor:
Prof. dr hab. Ewa Bartnik
Instytut Genetyki i Biotechnologii
Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
Recenzenci:
Prof. nadzw. dr hab. Beata Burzyńska
Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki,
Polska Akademia Nauk
Prof. dr hab. n. med. Rafał Płoski
Zakład Genetyki Medycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny
Mutacje w genomie mitochondrialnym (mtDNA) powodują choroby genetyczne,
których objawy zwykle dotyczą tkanek o największym zapotrzebowaniu energetycznym –
mięśniowej i nerwowej. Jedną z nich jest forma ślepoty zwana Dziedziczną Neuropatią
Wzrokową Lebera (LHON - ang. Leber’s Hereditary Optic Neuropathy) opisana po raz
pierwszy w 1871 r. przez Theodora von Lebera. Choroba w 90% - 95% przypadków
powodowana jest przez jedną z 3 mutacji w genomie mitochondrialnym: m.11778G>A/ND4,
m.3460G>A/ND1 lub m.14484T>C/ND6. Mężczyźni chorują dużo częściej niż kobiety
(choruje 50% mężczyzn i około 10% kobiet z mutacją). Z powodu niepełnej penetracji
choroby jak również wyraźnej dysproporcji między chorymi kobietami a mężczyznami
postuluje się, że dodatkowe czynniki genetyczne (niezidentyfikowane geny jądrowe)
i środowiskowe wpływają na ekspresję choroby. Patofizjologia LHON jest wciąż nieznana
i nie ma żadnej skutecznej metody leczenia ten choroby.
Dotychczas wysunięto kilka hipotez tłumaczących wpływ mutacji mitochondrialnych
na funkcjonowanie komórek pacjentów z LHON. Jedna z nich zakłada, że mutacje w mtDNA
zwiększają poziom apoptozy w komórkach zwojowych siatkówki, co prowadzi do degeneracji
nerwu wzrokowego. Istnieją również hipotezy, że degeneracja nerwu wzrokowego w LHON
spowodowana jest wzrostem poziomu wolnych rodników. Reaktywne formy tlenu są stale
produkowane w mitochondriach jako produkt uboczny działania łańcucha oddechowego,
jednak w zaburzeniach kompleksu I stwierdzano gwałtowny wzrost ich produkcji. Ponadto
zakłada się, że mutacje mitochondrialne powodują spadek produkcji ATP prowadzący do
zaburzenia transportu mitochondriów wzdłuż aksonów komórek zwojowych siatkówki do
mających
duże
zapotrzebowanie
energetyczne
synaps,
co
prowadzi
do
kryzysu
energetycznego i degeneracji komórek.
W ramach niniejszej pracy doktorskiej spróbowano zbadać podstawy molekularne
LHON poprzez analizę różnych procesów metabolicznych na trzech różnych modelach
komórkowych oraz powiązać otrzymane wyniki z obserwowanymi zmianami w nerwie
wzrokowym. Analizy genetyczne i biochemiczne przeprowadzono na liniach komórkowych
wyprowadzonych od osób zdrowych oraz od pacjentów z LHON, u których wcześniej
w Instytucie Genetyki i Biotechnologii zidentyfikowano kombinację dwóch mutacji
„leberowskich”: m.11778G>A i m.3460G>A. Występowanie u jednego pacjenta dwóch
mutacji powodujących chorobę jest niezwykle rzadkie. W literaturze opisano jedynie kilka
przypadków rodzin z dwiema mutacjami charakterystycznymi dla LHON i we wszystkich
przypadkach były to mutacje m.11778G>A i m.14484T>C. Do badań wykorzystano
unieśmiertelnione wirusem Epsteina-Barr limfocyty B oraz fibroblasty skóry. Trzecim
wykorzystanym modelem były hybrydy transmitochondrialne (cybrydy), które skonstruowano
poprzez fuzję pozbawionych jądra komórkowego fibroblastów z pozbawionymi genomu
mitochondrialnego komórkami rho 0. Model cybrydowy posłużył do określenia wpływu
mutacji
w
mtDNA
na
fizjologię
komórek
przy
ujednoliconym
tle
jądrowym.
Na wyprowadzonych modelach komórkowych określono poziom mutacji mitochondrialnych
z wykorzystaniem metody last cycle hot PCR-RFLP oraz przeprowadzono pomiary:
- procesu apoptozy analizując międzynukleosomalną fragmentację DNA, aktywność kaspaz
wykonawczych 3 i 7 oraz profil proteolizy polimerazy poli (ADP-rybozy)-1
-
stresu
oksydacyjnego,
przez
analizę
produkcji
wolnych
rodników
tlenowych
z zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej
- procesu autofagii, przez określenie poziomu charakterystycznych białek markerowych tego
procesu: białka LC3 izoformy I i II oraz białka p62, a także przez analizę formowania się
autofagosomów z zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej
- poziomu oddychania komórkowego z wykorzystaniem oksygrafu
Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że mutacje powodujące LHON
mogą modulować metabolizm komórek innych niż komórki nerwu wzrokowego, a ważnym
parametrem wpływającym na intensywność różnych zmian metabolicznych jest poziom
heteroplazmii danej mutacji. Z przeprowadzonych eksperymentów wynika, że:
1. W komórkach z dwiema mutacjami LHON występuje podwyższona produkcja
wolnych rodników tlenowych, w szczególności rodników ponadtlenkowych,
w stosunku do komórek bez mutacji w mtDNA, a intensywność stresu oksydacyjnego
zależy od poziomu mutacji. Zwiększony poziom ROS w badanych komórkach może
wynikać z zakłóconego przepływu elektronów między kompleksem I i ubichinonem.
2. W komórkach z mutacjami LHON zostają uruchomione różne mechanizmy
kompensujące produkcję ATP na zasadzie wzmożonej glikolizy oraz podwyższenia
tempa
oddychania
komórkowego
i
zwiększenia
wydolności
oddechowej.
Od wydajności systemów kompensujących produkcję ATP może zależeć zdolność
komórek do przezwyciężenia negatywnych skutków mutacji.
3. Wydolność oddechowa komórek jest uzależniona od rodzaju i poziomu mutacji
i wzrasta wprost proporcjonalnie do rosnącego poziomu m.11778G>A.
4. Stres metaboliczny wywołany hodowlą komórek z mutacjami LHON na pożywce
zmuszającej je do produkcji ATP z fosforylacji oksydacyjnej (galaktoza) bądź
wywołany hodowlą z inhibitorem kompleksu I (rotenon) wpływa na zmniejszenie
aktywacji kaspaz. Możliwe, że inaktywacja kaspaz odbywa się na drodze
oksydacyjnej modyfikacji tych enzymów, bądź jest spowodowana niedostateczną
produkcją ATP do przeprowadzenia apoptozy zależnej od tych proteaz, wynikającą
z niewydolności łańcucha oddechowego lub systemów kompensujących niedobory
energii w komórkach.
5. Polimeraza poli (ADP-rybozy)-1 nie bierze czynnego udziału w przebiegu apoptozy
niezależnej od aktywności kaspaz w komórkach z mutacjami LHON.
W pracy poszukiwano także nowych mutacji przyczyniających się do rozwoju LHON
poprzez analizę sekwencji wybranych genów lub pełnych genomów mitochondrialnych
u pacjentów z zanikiem nerwu wzrokowego oraz ich krewnych, u których wcześniejsze
analizy wykluczyły obecność najczęstszych mutacji odpowiedzialnych za tę chorobę.
Przeprowadzone analizy pozwoliły na zidentyfikowanie dwóch rzadkich mutacji z ustalonym
bądź potencjalnym statusem patogennym (m.3635G>A/ND1 i m.13042G>A/ND5). Bardzo
rzadka mutacja m.13042G>A została zidentyfikowana we wszystkich analizowanych
tkankach pacjenta, podczas gdy w tkankach matki była nieobecna. Jest to pierwsze
doniesienie o mutacji de novo w tej pozycji.
Uzyskane wyniki wskazują, które procesy metaboliczne mogą mieć potencjalnie
istotniejszy wpływ na ekspresję LHON, co stanowi podstawę do dalszych badań. Co więcej,
zaprojektowano dwa proste testy oparte o technikę PCR-RFLP w celu określenia poziomu
mutacji m.3635G>A i m.13042G>A, które mogą zostać włączone do diagnostyki genetycznej
u kolejnych pacjentów z zanikiem nerwu wzrokowego.
Na przeprowadzenie
badań wykorzystałam
środki z
grantu
PRELUDIUM
2011/03/N/NZ3/00655 przyznane mi przez Narodowe Centrum Nauki, a uzyskane wyniki
zostały opublikowane w dwóch artykułach w czasopiśmie The Journal of Clinical Pathology,
oraz zostały zaprezentowane na licznych konferencjach krajowych oraz międzynarodowych.