Instrukcja

ANALIZA I ROZDZIAŁ MIESZANINY NATURALNYCH
BARWNIKÓW ORGANICZNYCH
Cel ćwiczenia i wprowadzenie
Celem ćwiczenia jest analiza jakościowa roztworu mieszaniny barwników
syntetycznych metodą chromatografii cienkowarstwowej. W dalszej kolejności
analizowaną mieszaninę naleŜy rozdzielić na poszczególne składniki stosując
technikę chromatografii kolumnowej. Skuteczność rozdziału naleŜy potwierdzić
wykonując chromatografię cienkowarstwową zebranych frakcji.
Chlorofil jest barwnikiem obecnym we wszystkich roślinach zielonych, algach
(glonach) i bakteriach fotosyntetycznych, którego zadaniem jest generowanie
pod wpływem światła widzialnego wolnych elektronów, które są następnie
spoŜytkowywane w dalszych etapach fotosyntezy. Zielony kolor chlorofilu
spowodowany jest bardzo niską absorpcją w "zielonej" części spektrum światła.
Inne barwniki, które bardzo często znajdują się w roślinach to karotenoidy (np.
luteina, wiolaksantyna, neoksantyna itp.). Stosunki ilościowe chlorofili w
roślinach zaleŜą między innymi od warunków siedliskowych: rośliny cieniolubne
mają więcej chlorofilu b, światłolubne — chlorofilu a.
Odczynniki:
eter naftowy o twrz = 40 – 60°C
aceton
izopropanol
silica gel 60 (Merck)
NaCl
CaCO3
Na2SO4
świeŜe liście
Aparatura i szkło:
szklana kolumna chromatograficzna
komora chromatograficzna
płytki do TLC (silikaŜel 60 osadzony na folii aluminiowej)
moździerz
rozdzielacz 500 ml
rozdzielacz 100 ml
lejek z szeroką nóŜką (do sypkich ciał stałych)
cylinder miarowy 25 ml
pipeta 5 ml, 20 ml
erlenmajerki 100 ml
zlewki 100 oraz 500 ml
Wykonanie:
Ekstrakcja barwników z liści
Porcję świeŜych liści rozciera się w moździerzu z 22 ml acetonu i 3 ml eteru
naftowego i niewielką ilością CaCO3 (ok. 1 g). Po dokładnym roztarciu liści,
zabarwiony ekstrakt odsącza się. Ekstrakt przenosi się do rozdzielacza dodaje 20
ml eteru naftowego, a następnie przemywa 20 ml 10% wodnego roztworu NaCl.
Całość dokładnie wytrząsa się przez około 5 minut i odstawia do rozdzielenia.
Dolną warstwę (wodną) spuszcza się z rozdzielacza, a warstwę organiczną
przemywa 4-krotnie za pomocą 5 ml wody destylowanej. Po przemyciu ekstrakt
przenosi się do erlenmajerki i suszy za pomocą bezwodnego Na2SO4. Ciecz
odsącza się i zatęŜa do objętości 3-5 ml (Uwaga!! NaleŜy bardzo ostroŜnie
podgrzewać, ze względu na moŜliwość rozkładu barwników).
Przygotowanie eluentów
Eluentem jest mieszanina eteru naftowego, izopropanolu i wody przygotowana w
stosunku, który uznano za optymalny zgodnie z rezultatami uzyskanymi w
ćwiczeniu wykorzystującym chromatografię cienkowarstwową.
Przygotowanie zawiesiny wypełnienia kolumny (silica gel 60)
W zlewce o odpowiedniej wielkości naleŜy przygotować zawiesinę silikaŜelu w
eluencie.
Napełnianie kolumny
Sposób napełniania kolumny ma decydujący wpływ na poprawny rozdział
substancji z uŜyciem chromatografii kolumnowej. Czystą i suchą kolumnę
umieszcza się na statywie w pozycji pionowej. Przy wylocie kolumny naleŜy
umieścić zlewkę do odbierania eluentu. Następnie zawiesinę w zlewce naleŜy
zamieszać i zdecydowanie, ale niezbyt szybko wlać do kolumny do około 2/3
wysokości. W trakcie napełniania kran powinien być nieznacznie otwarty, aby
umoŜliwić sączenie się rozpuszczalnika z kolumny. Zawiesinę naleŜy wlewać pod
pręcie szklanym na ściankę kolumny, aby zminimalizować obecność pęcherzyków
powietrza i turbulencję. Po napełnieniu pozostawić kran minimalnie otwarty, aby
umoŜliwić upakowanie poprawne upakowanie fazy nieruchomej.
Po rozdzieleniu się części stałej i ciekłej, ostroŜnie wsypać przez lejek piasek,
który ma chronić przed powstawaniem turbulencji w trakcie dodawania świeŜej
porcji eluentu. Pozostawić w kolumnie tyle rozpuszczalnika, aby sięgał 1 mm
powyŜej powierzchni piasku. Bardzo waŜne jest, aby nie dopuścić do wysuszenia
kolumny, tzn. poziom cieczy nie moŜe obniŜyć się poniŜej powierzchni piasku.
Rozdzielanie substancji na kolumnie chromatograficznej
Przy uŜyciu pipety 10 ml ekstraktu z liści dodaje się ostroŜnie na warstwę piasku.
Następnie eluent dodaje się powoli tak, aby nie spowodować wzajemnego
mieszania się. Po dodaniu eluentu naleŜy otworzyć kran. Faza ruchoma zaczyna
przepływać przez kolumnę, na cząsteczkach adsorbentu zachodzi „rozwijanie
chromatogramu”. W trakcie przepływu fazy ruchomej następuje rozdział
składników ekstraktu. Wypływającą fazę ruchomą naleŜy zbierać, w
erlanmajerkach, które naleŜy zmieniać, jeśli następuje zmiana koloru
wypływającej fazy ruchomej. W trakcie rozdzielania substancji naleŜy
utrzymywać stały przepływ eluentu przez fazę nieruchomą (silica gel 60), m. in.
poprzez utrzymywanie stałego poziomu eluentu ponad wypełnieniem kolumny.
Analiza
jakościowa
cienkowarstwowej
próbki
metodą
chromatografii
Analizę wykonuje się w podobny sposób jak w przypadku ćwiczenia „Dobór
składu eluentu do rozdziału barwników zawartych w liściach roślin”. Jedyna
róŜnica polega na fakcie, iŜ poszczególne próbki pobrane z kolejnych kolb
umieszcza się na jednej płytce. Chromatogram rozwija się jednocześnie dla
wszystkich próbek. Odległość pomiędzy kolejnymi naniesionymi próbkami
powinna wynosić ok. 1 – 1,5 cm.
Wyniki i dyskusja
W trakcie eksperymentu faza ruchoma (eluent) przepływa pomiędzy
wypełnieniem kolumny, dzięki istnieniu sił grawitacji, a dzięki róŜnicom w sile
adsorbcji i desorbcji następuje rozdział składników. Dlatego odpowiednio
dobierając skład fazy ruchomej istnieje moŜliwość rozdziału praktycznie
dowolnych substancji. Zasada rozdziału substancji jest identyczna jak w
przypadku chromatografii cienkowarstwowej.
Przykładowe barwniki, które mogą występować w liściach.
Barwnik
kolor
karoteny
złoty
chlorofil A
niebieskozielony
chlorofil B
Ŝółtozielony
luteina
Ŝółty
wiolaksantyna
Ŝółty
neoksantyna
Ŝółty
Opracowanie wyników
Zagadnienia,
które
naleŜy
poruszyć
przygotowując
sprawozdanie
z
wykonywanego ćwiczenia:
W sprawozdaniu naleŜy omówić proces podziału substancji pomiędzy faza
ruchomą a fazą nieruchomą.
Opis wykonywanego ćwiczenia (włącznie z zamieszczeniem schematów
chromatogramów).
Omówienie skuteczności rozdziału barwników przy uŜyciu chromatografii
kolumnowej na podstawie wykonanej analizy TLC.