FLEX Monolclonal Mouse Anti-Human Progesterone
Transkrypt
FLEX Monolclonal Mouse Anti-Human Progesterone
FLEX Monolclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor Clone PgR 636 Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS068 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Przeciwciała FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor, Clone PgR 636, Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus), są przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w urządzeniachAutostainer/Autostainer Plus razem z zestawem do wizualizacji EnVision FLEX+, High pH, do wykrywania ludzkiego receptora progesteronowego metodą półilościową w utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawkach tkanek nowotworu piersi. Przeciwciała znakują komórki posiadające receptory progesteronowe i są przydatne w ocenie statusu tych receptorów w ludzkich komórkach nowotworu piersi. Interpretacja kliniczna wystąpienia barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Synonimy antygenu PR Streszczenie i informacje ogólne Rola receptorów hormonów steroidowych w przebiegu choroby nowotworowej piersi została dobrze poznana (1,2). Brak receptorów estrogenowych (ER) i progesteronowych (PR) pozwala na przewidywanie wystąpienia wczesnych nawrotów i niskiej przeŜywalności u pacjentów z nowotworem piersi (3-6). Z kolei obecność ER i PR w guzach wskazuje na moŜliwość uzyskania korzyści ze stosowania tamoksyfenu i innych terapii hormonalnych. Wykrywanie ER i PR moŜna prowadzić przy uŜyciu półilościowych metod immunohistochemicznych (IHC) lub metod ilościowych – przy uŜyciu węgla opłaszczonego dekstranem – lub immunoenzymatycznych. Wartość korelacji pomiędzy półilościową i ilościową oceną zawartości PR wynosiła 73–91% w zaleŜności od laboratorium i stosowanych przeciwciał (7-9). Patrz dokument General Instructions for Immunohistochemical Staining (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych) firmy Dako lub instrukcje do systemu detekcji IHC, aby poznać: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Dostarczony odczynnik Gotowe do uŜycia mysie przeciwciało monoklonalne dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko stabilizujące z dodatkiem 0,015 mol/L NaN3. Klon: PgR 636 (10) Izotyp: IgG1, kappa Immunogen Rekombinowana forma A ludzkiego receptora progesteronowego o pełnej długości, utrwalona w formalinie (10) Swoistość W badaniach metodą Western blot wyciągów z całych komórek wykazano reaktywność przeciwciał Anty-PR, PgR 636, z izoformami PR-A i PR-B, zarówno wolnymi, jak i po przyłączeniu hormonu (10). Epitop został zmapowany do domeny N-końcowej, wspólnej dla PR-A i PR-B. Środki ostroŜności (117244-004) 1. Do badań diagnostycznych in vitro. 2. Do stosowania przez wyszkolony personel. 3. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek – azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydków metali w kanalizacji. 4. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować właściwe procedury postępowania. 5. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne. 6. Niewykorzystany roztwór usuwać zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi. 307142PL_004 p. 1/5 Przechowywanie Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie nale Ŝy uŜywać odczynników po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik powinien zweryfikować te warunki. Nie ma wyraźnych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne. W przypadku uzyskania nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, i gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przygotowlanie próbek oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Skrawki parafinowe: przeciwciała mogą być wykorzystywane do znakowania skrawków utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm. Obróbka wstępna: wymagana jest wstępna obróbka skrawków tkankowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Optymalne wyniki uzyskuje się po przeprowadzeniu na tkankach wstępnej obróbki HIER przy uŜyciu rozcieńczonego roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8012/K8004). Odparafinowanie, nawodnienie i odmaskowanie antygenu moŜna przeprowadzić w urządzeniu Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101/PT200). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link (PT Link User Guide). W aparacie PT Link naleŜy ustawić następujące parametry pomiarowe: temperatura wstępnego ogrzewania: 65°C; temperatura i czas odmaskowania d eterminanty antygenowej: 97°C przez 20 minut (±1 mi n); schłodzenie do 65°C. Usun ąć statyw z preparatami ze zbiornika PT i natychmiast zanurzyć preparaty w naczyniu/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) zawierającym rozcieńczony bufor EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (nr kat. K8007) o temperaturze pokojowej. Pozostawić preparaty w buforze Wash Buffer na 1–5 minut. W trakcie obróbki wstępnej oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą zostać odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania. Procedura barwienia oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX+, Mouse, High pH, (nr kat. K8012). Oprogramowanie urządzeń Dako Autostainer/Autostainer Plus zawiera wstępnie zaprogramowane etapy odczynu i czasy inkubacji, które są aktywne podczas korzystania z następujących protokołów: Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (200 µL dozowanych odczynników) lub FLEXRTU3 (300 µL dozowanych odczynników) Autoprogram: PR (bez barwienia kontrastowego) lub PRH (z barwieniem kontrastowym) Dla etapu Auxiliary (Pomocniczy) naleŜy ustawić opcję „rinse buffer” („płukanie buforem”) w programach ≤barwienia 10 preparatów. Dla etapu Auxiliary (Pomocniczy) naleŜy ustawić opcję „none” („brak”) w programach barwienia >10 preparatów. Zapewni to porównywalne czasy płukania. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje zawiera podręcznik uŜytkownika odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym urządzeniu Dako Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu odczynnika EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego środka do trwałego zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać pozytywne i negatywne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Tkankowa kontrola pozytywna powinna obejmować komórki nabłonka walcowatego, komórki nabłonka płaskiego warstwy przypodstawnej i komórki zrębu, a komórki/struktury powinny wykazywać odczyn taki, jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka działania”. Zalecana kontrola negatywna to FLEX Negative Control, Mouse, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS750). Interpretacja wybarwienia Odczyn komórkowy ma charakter jądrowy. W przypadku wystąpienia odczynu cytoplazmatycznego naleŜy go traktować jako nieswoisty. Dodatni odczyn definiuje się jako wybarwienie jąder komórkowych ≥1% komórek nowotworowych niezaleŜnie od nasilenia odczynu. Jest to zgodne z zalecaną przez ASCO/CAP wartością graniczną wynoszącą ≥1% komórek nowotworowych z odczynem dodatnim (11). Ograniczenia swoiste dla opisywanego produktu 1. 2. 3. 4. Charakterystyka działania Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w tkankach. JeŜeli próbki przechowywano w temperaturze pokojowej, powinny być poddane barwieniu w ciągu 2 miesięcy od osadzenia preparatów tkankowych na szkiełkach (12). Limfocyty i komórki zrębu w przypadku znakowania przeciwciałem FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human PR, Clone PgR 636, mogą wykazywać odczyn dodatni i nie naleŜy ich zaliczać do komórek nowotworowych wykazujących ekspresję PR. W celu uzyskania optymalnych, powtarzalnych wyników, białko PR wymaga odmaskowania antygenu w preparatach utrwalanych standardowo (w obojętnej buforowanej formalinie) i zatapianych w parafinie. Nie przeprowadzono weryfikacji stosowania przeciwciała Dako Anti-PR, Clone PgR 636, w przypadku tkanek utrwalanych środkami innymi niŜ formalina. Precyzja: do badania precyzji przeznaczono serie skrawków pochodzących z 12 róŜnych bloczków tkankowych nowotworu piersi utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, które prezentowały cały zakres nasilenia ekspresji PR. Badanie wykonano w następujący sposób: Precyzja w obrębie serii: zgodnie ze standardowym protokołem EnVision FLEX+, High pH, trzy skrawki z kaŜdego bloczka tkankowego wyznakowano przeciwciałem Anti-PR, Clone PgR 636. Jednocześnie, jeden skrawek z kaŜdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną. (117244-004) 307142PL_004 p. 2/5 Precyzja między seriami: powyŜszą procedurę powtarzano przez pięć nienastępujących po sobie dni, wybarwiając jeden skrawek z kaŜdego bloczka tkankowego. Jednocześnie, jeden skrawek z kaŜdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną. Precyzja między urządzeniami: powyŜsza procedura była wykonywana w trzech róŜnych urządzeniach Autostainer przez trzech róŜnych operatorów i obejmowała wybarwienie łącznie trzech skrawków z kaŜdego bloczka tkankowego. Jednocześnie, jeden preparat z kaŜdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną. W testach dokładności przeprowadzonych w jednej serii, pomiędzy seriami oraz pomiędzy urządzeniami z uŜyciem przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636, uzyskano zgodność wyników. W badaniu utrzymywano stałe warunki wykonywanych testów, a pomiędzy testami odczynniki przechowywano w temperaturze 2–8°C. Tkanki prawidłowe: w tabeli 1 przedstawiono podsumowanie immunoreaktywności przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636, w odniesieniu do zalecanych tkanek prawidłowych. Wszystkie preparaty tkankowe zostały utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie, a następnie wybarwione z uŜyciem przeciwciał Anti- PR, Clone PgR 636, zgodnie z zaleceniami zawartymi w ulotce dołączonej do opakowania. W kilku róŜnych składnikach komórkowych, w tym nabłonka powierzchniowego, zrębu, komórkach śródmiąŜszowych i komórkach tkanki zapalnej, wyznakowanych przeciwciałem Anti-PR, Clone PgR 636, obserwowano odczyn cytoplazmatyczny. Pomimo wystąpienia odczynu cytoplazmatycznego nie uznano go za odczyn diagnostyczny z uwagi na przeznaczenie tego przeciwciała. Tabela 1: Podsumowanie reaktywności przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636, w tkankach prawidłowych Rodzaj tkanki (liczba badanych przypadków) Składniki tkankowe wykazujące odczyn dodatni Rodzaj tkanki (liczba badanych przypadków) Składniki tkankowe wykazujące odczyn dodatni Nadnercza (3) 1/3 Komórki warstwy kłębkowatej (50%), jądrowy 1/3 Komórki warstwy kłębkowatej (50%), jądrowy 0/3 Nerwy obwodowe (3) 0/3 Jajniki (3) 3/3 Komórki zrębu (50–70%), jądrowy 2/3 Komórki wysp Langerhansa (50–90%), jądrowy 3/3 Komórki nabłonka gruczołowego (1–10%), jądrowy 3/3 Komórki części gruczołowej przysadki (1–40%), jądrowy 3/3 Komórki zrębu (30–80%), jądrowy 3/3 Komórki nabłonka gruczołowego(<1% – 60%), jądrowy 0/3 Szpik kostny (3) Gruczoły sutkowe (3) MóŜdŜek (3) Mózgowie (3) Szyjka macicy (3) Jelito grube (3) Przełyk (3) Nerki (3) Wątroba (3) Płuca (3) Komórki międzybłonka (2) Mięsień sercowy (3) Mięśnie szkieletowe (3) 2/3 Komórki nabłonka gruczołowego (50–90%), jądrowy 0/3 1/3 Komórki oponowe (100%), jądrowy 3/3 Komórki nabłonka (50–90%), jądrowy 3/3 Komórki zrębu, w tym komórki tkanki zapalnej (50%), jądrowy 1/3 Komórki limfoidalne/tkanki zapalnej (<10%), jądrowy 1/3 Komórki limfoidalne/tkanki zapalnej (10%), jądrowy 1/3 Komórki podścieliska (50%), jądrowy 3/3 Komórki śródmiąŜszowe (1–5%), jądrowy 0/3 2/3 Komórki śródmiąŜszowe (1–10%), jądrowy 2/3 Komórki tkanki zapalnej (1–10%), jądrowy 0/2 3/3 Miocyty (30%), okołojądrowy Trzustka (3) Przytarczyce (3) Przysadka mózgowa (3) Gruczoł krokowy (3) Ślinianki (3) Skóra (3) Jelito cienkie (3) Śledziona (3) śołądek (3) 3/3 Komórki zrębu i komórki tkanki zapalnej (30–50%), jądrowy 0/3 Grasica (3) Tarczyca (3) 1/3 Komórki śródmiąŜszowe (20%), jądrowy 3/3 Komórki śródmiąŜszowe (5–80%), jądrowy 0/3 0/3 Migdałki (3) 0/3 Macica (2) 2/2 Komórki nabłonka gruczołowego(100%), jądrowy 2/2 Komórki zrębu warstwy mięśniowej macicy (100%), jądrowy Jądra (3) 0/3 Porównanie metod: przeciwciała Monoclonal Mouse Anti-Human PR, Clone PgR 636, badano metodą EnVision FLEX+ i oceniono je zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP (wartość graniczna ≥1%) (11). Badania przeciwciałAnti-PR (Clone 1294) przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu Dako ER/PR pharmDx Kit i oceniono je według wytycznych skali Allreda opisanych w ulotce dołączonej do opakowania. Dane z porównania metod przedstawiono w tabeli 2. Na podstawie wymienionych metod oceny wykazano zgodność przeciwciał Monoclonal Mouse AntiHuman PR, Clone PgR 636, z przeciwciałami Anti-PR z zestawu Dako ER/PR pharmDx Kit, co potwierdzają uzyskane wartości zgodności wszystkich wyników, wyników dodatnich i ujemnych wynoszące odpowiednio 94,5%, 95,8% i 93,1%. Tabela 3 przedstawia porównanie obu testów ocenionych zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP. (117244-004) 307142PL_004 p. 3/5 Tabela 2: Zgodność przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636 (ASCO/CAP), z przeciwciałami Anti-PR z zestawu ER/PR pharmDx Kit (wg. skali Allreda) Przeciwciała Anti-PR z zestawu ER/PR pharmDx Kit Przeciwciała Monoclonal Mouse AntiHuman PR, Clone PgR 636 Dodatnie Ujemne Razem Dodatnie 115 8 123 Ujemne 5 108 113 Razem 120 116 236 Procentowa zgodność wyników dodatnich = 95,8% (95% CI: 91,1–96,8) Procentowa zgodność wyników ujemnych = 93,1% (95% CI: 90,5–96,7) Procentowa zgodność wszystkich wyników = 94,5% (95% CI: 90,8–96,8) Tabela 3: Zgodność przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636 (ASCO/CAP), z przeciwciałami Anti-PR z zestawu ER/PR pharmDx Kit (ASCO/CAP) Przeciwciała Anti-PR z zestawu ER/PR pharmDx Kit Przeciwciała Monoclonal Mouse AntiHuman PR, Clone PgR 636 Dodatnie Ujemne Razem Dodatnie 115 8 123 Ujemne 1 112 113 Razem 116 120 236 Procentowa zgodność wyników dodatnich = 99,1% (95% CI: 93,0–98,0) Procentowa zgodność wyników ujemnych = 93,3% (95% CI: 92,8–98,0) Procentowa zgodność wszystkich wyników = 96,2% (95% CI: 93,0–98,0) Odtwarzalność między laboratoriami: badanie odtwarzalności z uŜyciem przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636, przeprowadzono w trzech laboratoriach badawczych przez pięć nienastępujących po sobie dni z uŜyciem 21 skrawków tkanek nowotworu piersi i oceniono je zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP (wartość graniczna ≥1%), wykonując łącznie 315 testów. W tabelach 4, 5 i 6 przedstawiono odtwarzalność pomiędzy ośrodkami. Obliczenia średniej procentowej zgodności wyników dodatnich, ujemnych i wszystkich wyników potwierdzają wysoką odtwarzalność testu PR (PgR 636) stosowanego w celu określenia statusu PR w warunkach klinicznych. Tabela 4: Porównanie ośrodka 1 z ośrodkiem 2 w ramach badania odtwarzalności pomiędzy laboratoriami z uŜyciem przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636 Ośrodek 1 Dodatnie Ośrodek 2 Ujemne Razem Dodatnie 55 0 55 Ujemne 4 46 50 Razem 59 46 105 Średnia procentowa zgodność wyników dodatnich = 96,5% Średnia procentowa zgodność wyników ujemnych = 95,8% Tabela 5: Porównanie ośrodka 1 z ośrodkiem 3 w ramach badania odtwarzalności pomiędzy laboratoriami z uŜyciem przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636 Ośrodek 1 Dodatnie Ośrodek 3 Ujemne Razem Dodatnie 59 1 60 Ujemne 0 45 45 Razem 59 46 105 Średnia procentowa zgodność wyników dodatnich = 99,2% Średnia procentowa zgodność wyników ujemnych = 98,9% (117244-004) 307142PL_004 p. 4/5 Tabela 6: Porównanie ośrodka 2 z ośrodkiem 3 w ramach badania odtwarzalności pomiędzy laboratoriami z uŜyciem przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636 Ośrodek 2 Dodatnie Ośrodek 3 Ujemne Razem Dodatnie 55 5 60 Ujemne 0 45 45 Razem 55 50 105 Średnia procentowa zgodność wyników dodatnich = 95,7% Średnia procentowa zgodność wyników ujemnych = 94,7% Piśmiennictwo 1. Henderson C.Breast cancer. In: Harrison’s principles of internal medicine, 12th edition, Wilson JD, Braunwald E, Isselbacher KJ, Petersdorf RG, Martin JB, Fauci AS, Root RK (eds). McGraw-Hill, Inc. New York, 1991 2. Fuqua SAW. Estrogen and progesterone receptors and breast cancer. Diseases of the Breast, Harris et al, eds. Lippincott-Raven, 1996. p. 261. 3. McGuire WL, Clark GM. The prognostic role of progesterone receptors in human breast cancer. Sem Oncol 1983;10:2. 4. Clark GM, McGuire WL, Hubay CA, Pearson OH, Marshall JS. Progesterone receptors as prognostic factor in stage II breast cancer. N Engl J Med 1983;39:1343. 5. Ravdin PM, Green S, Dorr TM, McGuire WL, Fabian C, Puch RP, et al. Prognostic significance of progesterone receptor levels in estrogen receptor-positive patients with metastatic breast cancer treated with tamoxifen: Results of a prospective southwest oncology group study. JCO 1992;10:1284. 6. Chevallier B, Heintzmann F, Mosseri V, Dauce JP, Bastit P, Graic Y, Brunelle P, Basuyay JP, Comoz M, Asselain B. Prognostic value of estrogen and progesterone receptors in operable breast cancer: Results of a univariate and multivariate analysis. Cancer 1988; 62:2517 7. Page DL, Jensen RA, Simpson JF. Routinely available indicators of prognosis in breast cancer. Breast Can Res Treat 1998;51:195. 8. Allred DC, Harvey JM, Berardo M, Clark GM. Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis. Mod Pathol 1998;11:155. 9. Fitzgibbons PL, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer. College of American Pathologists consensus statement. Arch Pathol Lab Med 2000;124:966. 10. Press M, Spaulding B, Groshen S, Kaminsky D, Hagerty M, Sherman L, et al. Comparison of different antibodies for detection of progesterone receptor in breast cancer. Steroids 2002; 67:799. 11. Hammond MEH, Hayes DF, Dowsett M, Allred C, Hagerty KL, Badve S, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2010;134:907–22. 12. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5)- CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400. Wayne, PA 19087-1898 USA 1999. Wydanie 11/15 (117244-004) 307142PL_004 p. 5/5