FLEX Monolclonal Mouse Anti-Human Progesterone

FLEX
Monolclonal Mouse
Anti-Human
Progesterone Receptor
Clone PgR 636
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR068
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciała FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Progesterone Receptor, Clone PgR 636, Ready-to-Use (Link), są
przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w urządzeniach Autostainer Link razem z zestawem do
wizualizacji EnVision FLEX+, High pH, do wykrywania ludzkiego receptora progesteronowego metodą półilościową w
utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawkach tkanek nowotworu piersi. Przeciwciała znakują
komórki posiadające receptory progesteronowe i są przydatne w ocenie statusu tych receptorów w ludzkich
komórkach nowotworu piersi.
Interpretacja kliniczna wystąpienia barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania morfologiczne z
wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z
uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy
antygenu
PR
Streszczenie
i informacje
ogólne
Rola receptorów hormonów steroidowych w przebiegu choroby nowotworowej piersi została dobrze poznana (1,2).
Brak receptorów estrogenowych (ER) i progesteronowych (PR) pozwala na przewidywanie wystąpienia wczesnych
nawrotów i niskiej przeŜywalności u pacjentów z nowotworem piersi (3-6). Z kolei obecność ER i PR w guzach
wskazuje na moŜliwość uzyskania korzyści ze stosowania tamoksyfenu i innych terapii hormonalnych. Wykrywanie
ER i PR moŜna prowadzić przy uŜyciu półilościowych metod immunohistochemicznych (IHC) lub metod
ilościowych – przy uŜyciu węgla opłaszczonego dekstranem – lub immunoenzymatycznych. Wartość korelacji
pomiędzy półilościową i ilościową oceną zawartości PR wynosiła 73–91% w zaleŜności od laboratorium i
stosowanych przeciwciał (7-9).
Patrz dokument General Instructions for Immunohistochemical Staining (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów
immunohistochemicznych) firmy Dako lub instrukcje do systemu detekcji IHC, aby poznać: 1) Zasady procedury,
2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie
odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia
metody.
Dostarczony
odczynnik
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciało monoklonalne dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko
stabilizujące z dodatkiem 0,015 mol/L NaN3.
Klon: PgR 636 (10)
Izotyp: IgG1, kappa
Immunogen
Rekombinowana forma A ludzkiego receptora progesteronowego o pełnej długości, utrwalona w formalinie (10)
Swoistość
W badaniach metodą Western blot wyciągów z całych komórek wykazano reaktywność przeciwciał Anty-PR,
PgR 636, z izoformami PR-A i PR-B, zarówno wolnymi, jak i po przyłączeniu hormonu (10). Epitop został
zmapowany do domeny N-końcowej, wspólnej dla PR-A i PR-B.
Środki ostroŜności
1.
Do badań diagnostycznych in vitro.
2.
Do stosowania przez wyszkolony personel.
3.
Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydków metali w kanalizacji.
4.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
5.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
6.
Niewykorzystany roztwór usuwać zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi.
(115570-004)
307141PL_004 s. 1/5
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie nale Ŝy uŜywać odczynników po upływie terminu waŜności podanego na
fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik powinien zweryfikować
te warunki. Nie ma wyraźnych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne. W przypadku uzyskania
nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, i gdy
podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Skrawki parafinowe: przeciwciała mogą być wykorzystywane do znakowania skrawków utrwalonych w formalinie i
zatopionych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm.
Obróbka wstępna: wymagana jest wstępna obróbka skrawków tkankowych utrwalonych w formalinie i zatopionych w
parafinie. Optymalne wyniki uzyskuje się po przeprowadzeniu na tkankach wstępnej obróbki HIER przy uŜyciu
rozcieńczonego roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004).
Odparafinowanie, nawodnienie i odmaskowanie antygenu moŜna przeprowadzić w urządzeniu Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101/PT200). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link (PT Link User
Guide). W aparacie PT Link naleŜy ustawić następujące parametry pomiarowe: temperatura wstępnego ogrzewania:
65°C; temperatura i czas odmaskowania determinanty antygenowej: 97°C przez 20 minut (±1 min); schłodze nie do
65°C. Usun ąć statyw z preparatami ze zbiornika PT i natychmiast zanurzyć preparaty w naczyniu/zbiorniku (np. PT
Link Rinse Station, nr kat. PT109) zawierającym rozcieńczony bufor EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (nr kat.
K8007) o temperaturze pokojowej. Pozostawić preparaty w buforze Wash Buffer na 1–5 minut.
W trakcie obróbki wstępnej oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą zostać
odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania.
Procedura
barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Wizualizacja: zalecanym system wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8002).
Program: oprogramowanie urządzenia Autostainer Link zawiera wstępnie zaprogramowane etapy odczynu i czasy
inkubacji. Zalecana objętość uŜytego odczynnika to 1 x 200 µL lub 2 x 150 µL na szkiełko z preparatem.
Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w podręczniku
uŜytkownika urządzenia Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym systemie Autostainer Link 48,
naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy
przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
Barwienie kontrastowe: zalecanym barwnikiem kontrastowym jest EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (nr kat. K8008).
Zaleca się stosowanie niewodnego środka do trwałego zatapiania.
Próby kontrolne: równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać kontrole
pozytywne i negatywne z uŜyciem identycznego protokołu. Najlepiej, aby kontrola pozytywna obejmowała tkankę
nowotworu piersi o niskiej ekspresji PR. Alternatywnie moŜna zastosować tkankę łagodnego nowotworu szyjki
macicy. We wszystkich kontrolach pozytywnych komórki/struktury powinny wykazywać odczyn taki, jak opisany dla
tej tkanki w części „Charakterystyka działania”.
Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja
wybarwienia
Odczyn komórkowy ma charakter jądrowy. W przypadku wystąpienia odczynu cytoplazmatycznego naleŜy go
traktować jako nieswoisty. Dodatni odczyn definiuje się jako wybarwienie jąder komórkowych ≥1% komórek
nowotworowych niezaleŜnie od nasilenia odczynu. Jest to zgodne z zalecaną przez ASCO/CAP wartością graniczną
wynoszącą ≥1% komórek nowotworowych z odczynem dodatnim (11).
Ograniczenia
swoiste dla
opisywanego
produktu
1.
Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w tkankach.
JeŜeli próbki przechowywano w temperaturze pokojowej, powinny być poddane barwieniu w ciągu 2 miesięcy
od osadzenia preparatów tkankowych na szkiełkach (12).
2.
Limfocyty i komórki zrębu w przypadku znakowania przeciwciałem FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human PR,
Clone PgR 636, mogą wykazywać odczyn dodatni i nie naleŜy ich zaliczać do komórek nowotworowych
wykazujących ekspresję PR.
3.
W celu uzyskania optymalnych, powtarzalnych wyników, białko PR wymaga odmaskowania antygenu w
preparatach utrwalanych standardowo (w obojętnej buforowanej formalinie) i zatapianych w parafinie.
4.
Nie przeprowadzono weryfikacji stosowania przeciwciała Dako Anti-PR, Clone PgR 636, w przypadku tkanek
utrwalanych środkami innymi niŜ formalina.
Charakterystyka
działania
Precyzja: do badania precyzji przeznaczono serie skrawków pochodzących z 12 róŜnych bloczków tkankowych
nowotworu piersi utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, które prezentowały cały zakres nasilenia
ekspresji PR. Badanie wykonano w następujący sposób:
Precyzja w obrębie serii: zgodnie ze standardowym protokołem EnVision FLEX+, High pH, trzy skrawki z kaŜdego
bloczka tkankowego wyznakowano przeciwciałem Anti-PR, Clone PgR 636. Jednocześnie, jeden skrawek z kaŜdego
bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną.
Precyzja między seriami: powyŜszą procedurę powtarzano przez pięć nienastępujących po sobie dni, wybarwiając
jeden skrawek z kaŜdego bloczka tkankowego. Jednocześnie, jeden skrawek z kaŜdego bloku został poddany
barwieniu kontrolą ujemną.
Precyzja między urządzeniami: powyŜsza procedura była wykonywana w trzech róŜnych urządzeniach Autostainer
przez trzech róŜnych operatorów i obejmowała wybarwienie łącznie trzech skrawków z kaŜdego bloczka tkankowego.
Jednocześnie, jeden preparat z kaŜdego bloku został poddany barwieniu kontrolą ujemną.
(115570-004)
307141PL_004 s. 2/5
W testach dokładności przeprowadzonych w jednej serii, pomiędzy seriami oraz pomiędzy urządzeniami z uŜyciem
przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636, uzyskano zgodność wyników. W badaniu utrzymywano stałe warunki
wykonywanych testów, a pomiędzy testami odczynniki przechowywano w temperaturze 2–8°C.
Tkanki prawidłowe: w tabeli 1 przedstawiono podsumowanie immunoreaktywności przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636,
w odniesieniu do zalecanych tkanek prawidłowych. Wszystkie preparaty tkankowe zostały utrwalone w formalinie i
zatopione w parafinie, a następnie wybarwione z uŜyciem przeciwciał Anti- PR, Clone PgR 636, zgodnie z zaleceniami
zawartymi w ulotce dołączonej do opakowania. W kilku róŜnych składnikach komórkowych, w tym nabłonka
powierzchniowego, zrębu, komórkach śródmiąŜszowych i komórkach tkanki zapalnej, wyznakowanych przeciwciałem
Anti-PR, Clone PgR 636, obserwowano odczyn cytoplazmatyczny. Pomimo wystąpienia odczynu cytoplazmatycznego
nie uznano go za odczyn diagnostyczny z uwagi na przeznaczenie tego przeciwciała.
Tabela 1: Podsumowanie reaktywności przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636, w tkankach prawidłowych
Rodzaj tkanki
(liczba badanych
przypadków)
Składniki tkankowe
wykazujące odczyn dodatni
Rodzaj tkanki
(liczba badanych
przypadków)
Składniki tkankowe
wykazujące odczyn dodatni
Nadnercza (3)
1/3 Komórki warstwy kłębkowatej
(50%), jądrowy
1/3 Komórki warstwy kłębkowatej
(50%), jądrowy
0/3
Nerwy obwodowe (3)
0/3
Jajniki (3)
2/3 Komórki nabłonka
gruczołowego (50–90%), jądrowy
0/3
Przytarczyce (3)
3/3 Komórki zrębu (50–70%),
jądrowy
2/3 Komórki wysp Langerhansa
(50–90%), jądrowy
3/3 Komórki nabłonka
gruczołowego (1-10%), jądrowy
3/3 Komórki części gruczołowej
przysadki (1–40%), jądrowy
3/3 Komórki zrębu (30-80%),
jądrowy
3/3 Komórki nabłonka
gruczołowego(<1% – 60%), jądrowy
0/3
Szpik kostny (3)
Gruczoły sutkowe (3)
MóŜdŜek (3)
Mózgowie (3)
Szyjka macicy (3)
Jelito grube (3)
Przełyk (3)
Nerki (3)
Wątroba (3)
Płuca (3)
Komórki międzybłonka
(2)
Mięsień sercowy (3)
Mięśnie szkieletowe
(3)
Trzustka (3)
Przysadka mózgowa
(3)
Gruczoł krokowy (3)
1/3 Komórki oponowe (100%),
jądrowy
3/3 Komórki nabłonka (50–90%),
jądrowy
3/3 Komórki zrębu, w tym komórki
tkanki zapalnej (50%), jądrowy
1/3 Komórki limfoidalne/tkanki
zapalnej (<10%), jądrowy
1/3 Komórki limfoidalne/tkanki
zapalnej (10%), jądrowy
1/3 Komórki podścieliska (50%),
jądrowy
3/3 Komórki śródmiąŜszowe (1-5%),
jądrowy
0/3
2/3 Komórki śródmiąŜszowe
(1-10%), jądrowy
2/3 Komórki tkanki zapalnej
(1-10%), jądrowy
0/2
Ślinianki (3)
Skóra (3)
Jelito cienkie (3)
Śledziona (3)
śołądek (3)
3/3 Komórki zrębu i komórki tkanki
zapalnej (30–50%), jądrowy
0/3
Grasica (3)
Tarczyca (3)
1/3 Komórki śródmiąŜszowe (20%),
jądrowy
3/3 Komórki śródmiąŜszowe
(5-80%), jądrowy
0/3
0/3
Migdałki (3)
0/3
Macica (2)
2/2 Komórki nabłonka
gruczołowego(100%), jądrowy
2/2 Komórki zrębu warstwy
mięśniowej macicy (100%), jądrowy
Jądra (3)
3/3 Miocyty (30%), okołojądrowy
0/3
Porównanie metod: przeciwciała Monoclonal Mouse Anti-Human PR, Clone PgR 636, badano metodą EnVision
FLEX+ i oceniono je zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP (wartość graniczna ≥1%) (11). Badania przeciwciał Anti-PR
(Clone 1294) przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu Dako ER/PR pharmDx Kit i oceniono je według
wytycznych skali Allreda opisanych w ulotce dołączonej do opakowania. Dane z porównania metod przedstawiono w
tabeli 2. Na podstawie wymienionych metod oceny wykazano zgodność przeciwciał Monoclonal Mouse Anti-Human
PR, Clone PgR 636, z przeciwciałami Anti-PR z zestawu Dako ER/PR pharmDx Kit, co potwierdzają uzyskane
wartości zgodności wszystkich wyników, wyników dodatnich i ujemnych wynoszące odpowiednio 94,5%, 95,8% i
93,1%. Tabela 3 przedstawia porównanie obu testów ocenionych zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP.
Tabela 2: Zgodność przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636 (ASCO/CAP), z przeciwciałami Anti-PR z zestawu
ER/PR pharmDx Kit (wg. skali Allreda)
Przeciwciała Anti-PR z zestawu ER/PR pharmDx Kit
Przeciwciała Monoclonal
Mouse Anti-Human PR,
Clone PgR 636
Dodatnie
Ujemne
Ogółem
Dodatnie
115
8
123
Ujemne
5
108
113
Razem
120
116
236
Procentowa zgodność wyników dodatnich = 95,8% (95% CI: 91,1–96,8)
Procentowa zgodność wyników ujemnych = 93,1% (95% CI: 90,5–96,7)
Procentowa zgodność wszystkich wyników = 94,5% (95% CI: 90.8–96,8)
(115570-004)
307141PL_004 s. 3/5
Tabela 3: Zgodność przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636 (ASCO/CAP), z przeciwciałami Anti-PR z zestawu
ER/PR pharmDx Kit (ASCO/CAP)
Przeciwciała Anti-PR z zestawu ER/PR pharmDx Kit
Przeciwciała Monoclonal
Mouse Anti-Human PR,
Clone PgR 636
Dodatnie
Ujemne
Ogółem
Dodatnie
115
8
123
Ujemne
1
112
113
Razem
116
120
236
Procentowa zgodność wyników dodatnich = 99,1% (95% CI: 93,0–98,0)
Procentowa zgodność wyników ujemnych = 93,3% (95% CI: 92,8–98,0)
Procentowa zgodność wszystkich wyników = 96,2% (95% CI: 93,0–98,0)
Odtwarzalność między laboratoriami: badanie odtwarzalności z uŜyciem przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636,
przeprowadzono w trzech laboratoriach badawczych przez pięć nienastępujących po sobie dni z uŜyciem
21 skrawków tkanek nowotworu piersi i oceniono je zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP (wartość graniczna ≥1%),
wykonując łącznie 315 testów. W tabelach 4, 5 i 6 przedstawiono odtwarzalność pomiędzy ośrodkami. Obliczenia
średniej procentowej zgodności wyników dodatnich, ujemnych i wszystkich wyników potwierdzają wysoką
odtwarzalność testu PR (PgR 636) stosowanego w celu określenia statusu PR w warunkach klinicznych.
Tabela 4: Porównanie ośrodka 1 z ośrodkiem 2 w ramach badania odtwarzalności pomiędzy laboratoriami z
uŜyciem przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636
Ośrodek 1
Dodatnie
Ośrodek
2
Ujemne
Ogółem
Dodatnie
55
0
55
Ujemne
4
46
50
Razem
59
46
105
Średnia procentowa zgodność wyników dodatnich = 96,5%
Średnia procentowa zgodność wyników ujemnych = 95,8%
Tabela 5: Porównanie ośrodka 1 z ośrodkiem 3 w ramach badania odtwarzalności pomiędzy laboratoriami z
uŜyciem przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636
Ośrodek 1
Dodatnie
Ośrodek
3
Ujemne
Ogółem
Dodatnie
59
1
60
Ujemne
0
45
45
Razem
59
46
105
Średnia procentowa zgodność wyników dodatnich = 99,2%
Średnia procentowa zgodność wyników ujemnych = 98,9%
Tabela 6: Porównanie ośrodka 2 z ośrodkiem 3 w ramach badania odtwarzalności pomiędzy laboratoriami z
uŜyciem przeciwciał Anti-PR, Clone PgR 636
Ośrodek 2
Dodatnie
Ośrodek
3
Ujemne
Ogółem
Dodatnie
55
5
60
Ujemne
0
45
45
Razem
55
50
105
Średnia procentowa zgodność wyników dodatnich = 95,7%
Średnia procentowa zgodność wyników ujemnych = 94,7%
(115570-004)
307141PL_004 s. 4/5
Piśmiennictwo
1.
Henderson C.Breast cancer. In: Harrison’s principles of internal medicine, 12th edition, Wilson JD, Braunwald
E, Isselbacher KJ, Petersdorf RG, Martin JB, Fauci AS, Root RK (eds). McGraw-Hill, Inc. New York, 1991
2.
Fuqua SAW. Estrogen and progesterone receptors and breast cancer. Diseases of the Breast, Harris et al,
eds. Lippincott-Raven, 1996. p. 261.
3.
McGuire WL, Clark GM. The prognostic role of progesterone receptors in human breast cancer. Sem Oncol
1983;10:2.
4.
Clark GM, McGuire WL, Hubay CA, Pearson OH, Marshall JS. Progesterone receptors as prognostic factor in
stage II breast cancer. N Engl J Med 1983;39:1343.
5.
Ravdin PM, Green S, Dorr TM, McGuire WL, Fabian C, Puch RP, et al. Prognostic significance of progesterone
receptor levels in estrogen receptor-positive patients with metastatic breast cancer treated with tamoxifen:
Results of a prospective southwest oncology group study. JCO 1992;10:1284.
6.
Chevallier B, Heintzmann F, Mosseri V, Dauce JP, Bastit P, Graic Y, Brunelle P, Basuyay JP, Comoz M,
Asselain B. Prognostic value of estrogen and progesterone receptors in operable breast cancer: Results of a
univariate and multivariate analysis. Cancer 1988; 62:2517
7.
Page DL, Jensen RA, Simpson JF. Routinely available indicators of prognosis in breast cancer. Breast Can
Res Treat 1998;51:195.
8.
Allred DC, Harvey JM, Berardo M, Clark GM. Prognostic and predictive factors in breast cancer by
immunohistochemical analysis. Mod Pathol 1998;11:155.
9.
Fitzgibbons PL, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer.
College of American Pathologists consensus statement. Arch Pathol Lab Med 2000;124:966.
10.
Press M, Spaulding B, Groshen S, Kaminsky D, Hagerty M, Sherman L, et al. Comparison of different
antibodies for detection of progesterone receptor in breast cancer. Steroids 2002; 67:799.
11.
Hammond MEH, Hayes DF, Dowsett M, Allred C, Hagerty KL, Badve S, et al. American Society of Clinical
Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of
Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2010;134:907–22.
12.
Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry;
Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5)- CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400.
Wayne, PA 19087-1898 USA 1999.
Wydanie 11/15
(115570-004)
307141PL_004 s. 5/5