Cwiczenie 7 - kw. fosfataza

Ćwiczenie 7
ENZYMY. KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH
Część doświadczalna obejmuje:
- wyznaczenie optimum pH dla reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę
- wyznaczenie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę
WPROWADZENIE
Fosfataza kwaśna (EC 3.1.3.2) – „enzym znacznikowy” lizosomów, głównego miejsca trawienia
wewnątrzkomórkowego
Fosfatazy to grupa enzymów naleŜących do klasy hydrolaz (klasa 3 – obejmuje enzymy rozszczepiające wiązania z udziałem cząsteczki wody, Tabela 1), podklasy enzymów hydrolizujących
wiązania estrowe (esterazy), podpodklasy hydrolaz monoestrów fosforanowych.
Tabela 1. Klasy enzymów (wg Koolman i Röhm 2005)
1
Enzymy te katalizują odszczepienie reszty fosforanowej od cukrowców, białek, tłuszczowców,
nukleotydów i wielu innych naturalnych estrów kwasu fosforowego według poniŜszej reakcji:
R-O-PO3H¯ + H2O
fosfataza
R-OH + H2PO4¯
Poza naturalnymi substratami, hydrolazy monoestrów fosforanowych rozszczepiają takŜe estry fosforanowe fenoli, np. p-nitrofenylofosforan.
Fosfatazy działają w pH alkalicznym, z optymalnym pH w zakresie 9,0 – 11,0, jak równieŜ w pH
kwaśnym i obojętnym, w zakresie 4,5 – 7,0. Te ostatnie są typowe dla komórek roślinnych, chociaŜ
nie brakuje ich takŜe w komórkach zwierzęcych, gdzie występują przede wszystkim w lizosomach,
niewielkich błonowych pęcherzykach będących głównym miejscem trawienia wewnątrzkomórkowego. Lizosomy zawierają specyficzny zestaw hydrolaz, optymalnie aktywnych w środowisku
kwaśnym, uczestniczących w rozkładzie organelli komórkowych i wszystkich rodzajów makrocząsteczek dostarczanych do komórki róŜnymi drogami. Wiodącym enzymem jest tu kwaśna fosfataza
uznawana za tzw. „enzym znacznikowy” lizosomów. Kwaśne środowisko światła lizosomu (pH ~
5) jest utrzymywane dzięki działaniu błonowej H+-ATPazy, pompującej H+ z cytozolu do wnętrza
lizosomu(Ryc. 1).
Ryc. 1. Schemat lizosomu (wg Alberts i wsp. 1999)
W obojętnym pH cytoplazmy (pH 7 – 7,3), hydrolityczne enzymy lizosomalne wykazują niską aktywność. Jest to przypuszczalnie mechanizm obronny przed samoistnym strawieniem komórki, w
2
przypadku, gdyby enzymy dostały się do cytoplazmy. W komórkach roślin i grzybów rolę lizosomów pełni wakuola komórkowa. Kwaśny odczyn wnętrza wakuoli, istotny dla aktywności występujących tam enzymów hydrolitycznych, jest utrzymywany dzięki działaniu dwóch pomp protonowych (H+-ATPazy i H+-PPazy) zlokalizowanych w błonie otaczającej wakuolę, tzw. tonoplaście.
Podstawy kinetyki enzymatycznej
Kinetyka enzymatyczna stanowi dział enzymologii zajmujący się zagadnieniami związanymi z
szybkością reakcji katalizowanych enzymatycznie. Szybkość reakcji enzymatycznej (V), która
jest miarą aktywności, czyli katalitycznego działania enzymu, mierzy się podobnie jak szybkość
reakcji chemicznych. Jest ona w pewnym zakresie proporcjonalna do stęŜenia substancji reagujących; wyznacza ją przyrost stęŜenia produktu reakcji w czasie. Miarą szybkości reakcji w danym
momencie jest więc wzrost stęŜenia produktu, jaki następuje w jednostce czasu.
Aktywność enzymatyczną wyraŜamy w dwóch standardowych jednostkach. Są to: jednostka
enzymatyczna (U) oraz katal (kat). Jednostka enzymatyczna (U) jest to taka ilość enzymu, która
katalizuje przekształcenie 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty, w warunkach optymalnych dla danego enzymu. Katal (kat) jest jednostką aktywności enzymatycznej obowiązującą w układzie SI i jest
definiowany jako aktywność katalityczna, która zwiększa szybkość reakcji o 1 mol na sekundę, w
warunkach optymalnych.
Przy stałym stęŜeniu enzymu i substratu szybkość powstawania produktu reakcji powinna być
wprost proporcjonalna do czasu reakcji. W rzeczywistości tylko w początkowej fazie reakcja ta jest
reakcją pierwszego rzędu (Ryc. 2), co znaczy, Ŝe szybkość działania enzymu jest liniową funkcją
czasu – jest to tzw. szybkość początkowa reakcji enzymatycznej (V0).
Ryc. 2. Wzrost ilości produktu reakcji enzymatycznej w czasie
NaleŜy pamiętać, Ŝe w analizach in vitro stęŜenie substratu maleje w czasie reakcji i przy dłuŜszym
czasie inkubacji zaleŜność pomiędzy przyrostem produktu, a czasem reakcji nie będzie funkcją
3
liniową (Ryc. 2). RównieŜ enzym w trakcie wykonywania oznaczeń moŜe ulegać denaturacji, co
pogłębia powyŜszy efekt. Wartość V0 uzyskuje się przez wykreślenie linii prostej stycznej do
początkowego odcinka krzywej, poczynając od czasu zerowego (Ryc. 2). Nachylenie tej prostej
ma wartość V0. Dla badań kinetyki enzymów in vitro niezwykle waŜne jest więc określenie czasu
reakcji, w którym przyrost produktu reakcji enzymatycznej jest wprost proporcjonalny do czasu.
produkt (µmole)
V0 =
czas (min)
Szybkość reakcji enzymatycznej zaleŜy od wielu czynników fizycznych i chemicznych, takich jak:
stęŜenie enzymu, stęŜenie substratu, temperatura, pH, stęŜenie aktywatorów i inhibitorów. Większość enzymów wykazuje maksymalną aktywność w środowisku o określonym stęŜeniu jonów
wodorowych (w określonym pH). Wynika to stąd, Ŝe w katalizie enzymatycznej biorą udział, między innymi, zjonizowane grupy funkcyjne centrum aktywnego. Odsetek cząsteczek enzymu, w
których grupy kwasowe lub zasadowe znajdują się w formie jonowej, zaleŜy od pK tych grup i stęŜenia jonów wodorowych w roztworze. ZaleŜność aktywności enzymatycznej od pH przyjmuje najczęściej postać krzywej w kształcie dzwonu (Ryc. 3).
Ryc. 3. ZaleŜność aktywności enzymu od pH (wg Koolman i Röhm 2005)
Rozpiętość optimum pH, czyli takiej wartość pH, przy której aktywność jest maksymalna, jest bardzo duŜa. Dla wielu enzymów optimum pH znajduje się w pobliŜu pH komórki (pH 7,0), ale np.
pepsyna (EC 3.4.23.1) występująca w kwaśnym środowisku Ŝołądka wykazuje najwyŜszą aktywność
4
w pH około 2,0, a arginaza (EC 3.5.3.1.) w pH powyŜej 10,0. Optymalną wartość pH, która jest jedną z wartości liczbowych charakteryzujących dany enzym, wyznacza się z wykresu zaleŜności aktywności od pH.
WYKONANIE
Zasada metody
W ćwiczeniu, do wyznaczenia optimum pH, podobnie jak w wyznaczaniu szybkości początkowej
reakcji, stosuje się metodę, w której naturalny substrat kwaśnej fosfatazy zostaje zastąpiony
sztucznym substratem – p-nitrofenylofosforanem (analogiem naturalnego substratu). Enzym
hydrolizując p-nitrofenylofosforan, uwalnia p-nitrofenol, który w środowisku zasadowym tworzy
Ŝółto zabarwiony anion p-nitrofenolanowy.
O
O2 N
O
P
fosfataza
OH + H2O
O2 N
OH + H 3 PO4
OH
p-nitrofenylofosforan (pNPP)
p-nitrofenol (pNP)
NatęŜenie barwy mierzone przy λ = 405 nm jest proporcjonalne do ilości zhydrolizowanego substratu. Ryc. 4 przedstawia widmo absorpcyjne p-nitrofenylofosforanu (pNPP) i p-nitrofenolu (pNP).
Ryc. 4. Widmo absorpcyjne p-nitrofenylofosforanu (pNPP) i p-nitrofenolu (pNP)
w środowisku alkalicznym
Odczynniki:
1. 8mM p-nitrofenylofosforan w H2O
2. 0,1M NaOH
5
3. 0,9% NaCl
4. 0,5M bufory Tris-octan o pH 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5
Wyciąg z ziemniaka: obrany i umyty ziemniak zetrzeć na tarce, przesączyć przez warstwę nylonu.
Odstawić do lodówki.
Wyznaczanie optimum pH kwaśnej fosfatazy
Do probówek napipetować po: 0,25 ml 8mM p-nitrofenylofosforanu i 0,25 ml odpowiedniego
buforu, kolejno od pH 4,0 do 6,5. Próby wykonać w dwóch powtórzeniach dla kaŜdego pH. Starannie wymieszać zawartość probówek i wstawić je do łaźni wodnej o temp. 300C. Wyciąg z ziemniaka zawierający kwaśną fosfatazę rozcieńczyć w cylinderku miarowym na 25 ml 250x uŜywając
0,9% roztworu NaCl.
Do preinkubowanych prób, zawierających napipetowany substrat i bufor, ogrzanych w łaźni
wodnej do temp. 300C dodawać, w odstępach co 30 sekund, po 0,5 ml rozcieńczonego roztworu enzymu. Próby inkubować 15 minut w temperaturze 300C, po czym reakcję przerwać dodając do kaŜdej z nich, znowu w odstępach co 30 sekund i w kolejności takiej jak dodawano enzym, po 5 ml
0,1M roztworu NaOH,.
Próbę kontrolną (zerową) wykonać równolegle z próbami badanymi postępując następująco:
do probówki napipetować 0,25 ml buforu o pH 5,0 oraz 0,25 ml roztworu p-nitrofenylofosforanu.
Mieszaninę inkubować 15 minut w łaźni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodać 5 ml
0,1M roztworu NaOH, a dopiero na końcu dodać 0,5 ml enzymu (enzym w takich warunkach juŜ
nie będzie działał, poniewaŜ roztwór zawiera wysokie stęŜenie NaOH).
NatęŜenie barwy zmierzyć wobec próby zerowej przy λ = 405 nm. Wykreślić krzywą zaleŜności
szybkości hydrolizy p-nitrofenylofosforanu (wyraŜoną jako absorbancja przy 405nm) od pH.
Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji
Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji hydrolizy pNPP wykonujemy uŜywając 4 lub 5
róŜnych rozcieńczeń wyciągu z ziemniaka (róŜne stęŜenie enzymu). KaŜda para ćwiczeniowa
przygotowuje jedno z wybranych rozcieńczeń wyciągu, np. 10x, 50x, 100x lub 250x (wyciąg naleŜy
rozcieńczyć 0,9% roztworem NaCl w cylindrze miarowym na 25 ml) i wykonuje oznaczenie szybkości początkowej dodając do mieszaniny reakcyjnej wyciąg o określonym rozcieńczeniu (kaŜda
para inne rozcieńczenie!).
Do suchych probówek napipetować po 0,25 ml buforu octanowego o pH optymalnym dla aktywności kwaśnej fosfatazy (zwykle jest to pH 5,5) i 0,25 ml roztworu substratu (próby wykonać w
6
dwóch powtórzeniach). KaŜda próba zawiera zatem po 0,5 ml mieszaniny inkubacyjnej o pH optymalnym dla fosfatazy kwaśnej. Próby wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 300C. Reakcję enzymatyczną rozpocząć dodając do kaŜdej próby, w odstępach co 30 sekund, po 0,5 ml ekstraktu
ziemniaczanego o odpowiednim rozcieńczeniu (10x, 50x, 100x lub 250x). Próby inkubować: 2,
4, 6, 8, 10 i 12 minut. Reakcję przerwać dodając, znowu w 30 sekundowych odstępach, po 5 ml
0,1M roztworu NaOH w kolejności takiej jak dodawano enzym.
Próby zerowe naleŜy przygotować następująco: do probówki napipetować 0,25 ml buforu o pH
5,5 oraz 0,25 ml p-nitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubować 12 minut w łaźni wodnej razem z
próbami badanymi, po czym dodać 5 ml 0,1M roztworu NaOH i na koniec 0,5 ml enzymu o danym
rozcieńczeniu.
Dokonać pomiaru absorbancji przy λ = 405 nm wobec próby zerowej. Na podstawie otrzymanych wyników naleŜy wykreślić zaleŜność szybkości hydrolizy p-nitrofenylofosforanu (wyraŜonej
jako wartości absorbancji przy 405 nm) od czasu inkubacji, dla odpowiedniego rozcieńczenia enzymu.
Wszystkie pary ćwiczeniowe wymienią się wynikami, a następnie kaŜda osoba wykona jeden
wykres, który będzie przedstawiał wyniki uzyskane przez całą grupę ćwiczeniową. Proszę przeanalizować przebieg krzywych zaleŜności dla poszczególnych rozcieńczeń enzymu!
Zagadnienia do przygotowania:
- podstawy katalizy enzymatycznej (zbliŜenie i orientacja substratu, eliminacja wody, stabilizacja
stanu przejściowego, przenoszenie grup funkcyjnych)
- kinetyka reakcji enzymatycznych (aktywność enzymatyczna, jednostki aktywności, teoria wysyceniowa Michaelisa-Menten, szybkość początkowa, szybkość maksymalna )
- enzymy izosteryczne i allosteryczne
- klasyfikacja i nomenklatura enzymów
Piśmiennictwo:
1, Alberts B, Bray D, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P – Podstawy biologii komórki. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999.
2, Berg JM, Tymoczko, JL, Stryer L – Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005.
3, Koolman J, Röhm K-H – Biochemia. Ilustrowany przewodnik. Wydawnictwo Lekarskie PZWL,
Warszawa 2005.
4, Witwicki J, Ardelt W – Elementy enzymologii. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa
1984.
7