Ćwiczenie nr 2
Transkrypt
Ćwiczenie nr 2
Badanie właściwości fizyko-chemicznych białek Właściwości amfoteryczne białek Przygotować 2 kolbki. a) Do kolbki odmierzyć 5 ml 0,5% roztwory żelatyny, dodać 2-3 krople zieleni bromokrezolowej i zawartość dobrze wymieszać. Następnie miareczkować 0,01 M HCl aż do żółtego zabarwienia, co następuje przy pH roztworu ok. 3. b) Powtórzyć doświadczenie używając jako wskaźnika błękit bromotymolowy i 0,01 M NaOH. Miareczkować do uzyskania barwy niebieskiej, co następuje przy pH roztworu ok. 8,9. Na podstawie przeprowadzonego miareczkowania porównać ilość HCl i NaOH zużytych do zmiany zabarwienia roztworu żelatyny przy zastosowaniu obu składników. Denaturacja cieplna białek Ogrzać do zagotowania 2 ml roztworu białka jaja kurzego. Tworzy się biały osad wytrąconego białka. Osad jest wyraźniejszy po dodaniu odrobiny NaCl lub zakwaszeniu kwasem octowym. Denaturacja białek stężonym kwasem azotowym Do probówki odmierzyć około 1 ml stężonego roztworu HNO3 i następnie po ściance nachylonej probówki dodać wolno około 1 ml roztworu białka jaja kurzego tak, aby nie ulegając zmieszaniu nawarstwił się na roztwór kwasu. Na granicy obu cieczy powstaje biały pierścień zdenaturowanego i skoagulowanego białka. Działanie etanolu na białko Do probówki dodać 1 ml roztworu białka jaja kurzego i 2 ml 96% etanolu. Po godzinie rozcieńczyć zawartość probówki wodą. Strąt nie rozpuszcza się. Strącanie białka za pomocą kationów (soli metali ciężkich) a) Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli 1% FeCl3. Wytrąca się brunatny osad białczanu żelazowego, który rozpuszcza się w nadmiarze odczynnika. b) Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli CuSO4. Powstaje jasnobłękitny osad białczanu miedziowego rozpuszczający się w roztworze 0,01 M NaOH, dając kolor fioletowy (reakcja biuretowa). Strącanie białka za pomocą anionów a) Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml 10% CCl3COOH (TCA). b) Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać kilka kropli 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego. Właściwości ochronne koloidów hydrofilowych Do 2 probówek odmierzyć po 1 ml 0,01 M roztworu AgNO3 i kilka kropli rozcieńczonego HNO3. Do pierwszej dodać 1 ml 0,5% roztworu żelatyny, a do drugiej 1 ml wody. Po zmieszaniu do obu probówek należy wprowadzić kroplami 2 ml 0,01 M roztworu NaCl. W probówce z żelatyną nie wytrąca się osad AgCl. 1 Oznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny Białka są amfoterami wieloelektrolitowymi, stąd zmiany pH roztworu powodują zmiany jonizacji grup funkcyjnych łańcuchów białkowych, co wpływa na ich rozpuszczalność. W pH różnym od pI cząsteczki białka posiadają ładunek, co zmniejsza ich wzajemne przyciąganie, a w następstwie zwiększa się ich rozpuszczalność. Natomiast w punkcie izoelektrycznym, kiedy cząsteczki pozbawione są ładunku elektrycznego, przyciąganie pomiędzy nimi jest największe, co prowadzi do ich wytrącania z roztworu. Kazeina charakteryzuje się najmniejszą rozpuszczalnością w punkcie izoelektrycznym. Odpowiednio dobierając stężenia CH3COOH i CH3COONa przygotowuje się szereg probówek z roztworami o różnych wartościach pH. Dodaje się do nich jednakową ilość kazeiny. Wartość pH w probówce, w której wystąpi najobfitszy osad, odpowiada pI kazeiny. Wykonanie Przygotować 9 suchych probówek. Do pierwszej odmierzyć 3,2 ml 1 M roztworu CH 3COOH i 6,8 ml H2O, a do następnych ośmiu – po 5 ml H2O. Po dokładnym wymieszaniu zawartości w probówce pierwszej, przenieść z niej 5 ml do drugiej, a z tej, po wymieszaniu, 5 ml do trzeciej itd. Do każdej probówki dodać po 1 ml roztworu kazeiny i wymieszać. Obserwować roztwory natychmiast po zamieszaniu i po 30 minutach. Wynik wpisać do tabelki: Nr próbki 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Liczba ml 1 M CH3COOH pH roztworu 1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0,05 0,025 0,012 0,006 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6 5,9 Zmętnienie Osad 2 Dializa roztworu kazeiny i glicyny W odróżnieniu od związków niskocząsteczkowych, białka jako koloidy nie przechodzą przez błony półprzepuszczalne. W trakcie oczyszczania białka bądź przygotowania materiału biologicznego do różnego typu oznaczeń, zachodzi często konieczność usunięcia z roztworu białka na przykład nadmiaru soli (odsolenie) lub niskocząsteczkowych związków organicznych. Do oczyszczania stosuje się przeważnie dializę, wykorzystując zdolność przechodzenia jonów i związków niskocząsteczkowych do wody lub buforu, znajdującego się po drugiej strony błony, w naczyniu dializacyjnym (np.: w zlewce). Dializa jest procesem długotrwałym, niedającym całkowitego oczyszczenia, po pewnym czasie ustala się bowiem równowaga Gibbsa-Donnana. W celu przyśpieszenia dializy i możliwie maksymalnego oczyszczenia białka od niskocząsteczkowych związków zmienia się często roztwór do którego próbka jest dializowana, a także stosuje mieszanie. Wykonanie Do woreczka dializacyjnego odmierzyć po 20 ml roztworu kazeiny i glicyny. Woreczek zawiesić na bagietce umocowanej poziomo i zanurzyć w zlewce tak, by nie dotykał do dna. Przygotować dwa statywy oznaczone symbolami I i II, w każdym po 12 probówek oznaczonych symbolami 1N, 1B, 2N, 2B.......6N, 6B. Do zlewki wlać wodę destylowaną tak, aby jej poziom nieznacznie przekraczał poziom cieczy w woreczku dializacyjnym. W czasie 0, 15, 30, 45, 60 i 90 minut od początku dializy pobierać pipetą po 3ml roztworu z woreczka dializacyjnego i po 3ml ze zlewki. Przenieść każdorazowo połowę pobranej próby (tj. 1,5 ml) do probówki oznaczonej literą N, a drugą połowę do probówki oznaczonej literą B. Roztwór z woreczka dializacyjnego przenieść do probówek w statywie I, a roztwór ze zlewki do probówek w statywie II. Po zakończeniu doświadczenia do probówek z literą N dodać po 0,3 ml ninhydryny i gotować we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Do probówek oznaczonych literą B dodać 0,2 ml 10% NaOH i po 3 krople 0,5% CuSO4. Wynik reakcji zaznaczyć zależnie od powstającego zabarwienia na +, ++, +++, ++++. Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia uzupełnić następującą tabelę: 1 Analiza dializatu I r. ninhydrynowa N r. biuretowa B Analiza dializatu II r. ninhydrynowa N r. biuretowa B 2 3 4 5 6 Zalecana literatura: 1. Ćwiczenia z biochemii pod redakcją Kłyszejko-Stefanowicz L., str: 232-246 2. Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej z ćwiczeniami. Kędryna T., Gałka-Walczak M., Ostrowska B., str. 29-46. 3