Laboratorium nr 3

LABORATORIUM 3
Temat: WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK I KWASÓW NUKLEINOWYCH.
REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE.
Zadanie 1. Wykrywanie aminokwasów w reakcji z ninhydryną.
Reakcja aminokwasów z ninhydryną jest wykorzystywana do jakościowego i ilościowego
oznaczania aminokwasów i wolnych grup NH3. Aminokwasy reagują z ninhydryną przy
wartościach pH powyżej 4, dając produkty o barwie niebieskofioletowej. Intensywność barwy
jest proporcjonalna do zawartości wolnych grup α- NH3 w próbie. W reakcji bierze udział
zarówno grupa aminowa jak i karboksylowa. Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają
utlenieniu- poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego
o 1 atom węgla. Następnie w wyniku kondensacji 2 cząsteczek ninhydryny: zredukowanej
i utlenionej z amoniakiem powstaje fioletowoniebieskie zabarwienie, którego natężenie jest
proporcjonalne do zawartości azotu α- aminowego aminokwasów. Dwa aminokwasy, prolina
i hydroksyprolina nie posiadają wolnych grup NH3, reagują więc inaczej niż pozostałe, dając
produkt o barwie żółtej.
·
Wykonanie:
Do probówek odmierzyć kolejno po 1 ml:
- 1 % hydrolizatu białka,
- 1% roztworu glicyny,
- 1% roztworu proliny,
- 1% roztworu żelatyny.
-Następnie do wszystkich probówek wlać po 0,5 ml etanolowego roztworu ninhydryny.
-Ogrzewać przez 3 minuty we wrzącej łaźni wodnej.
Po zakończeniu reakcji pojawia się intensywne zabarwienie fioletowe lub żółte w próbach
zawierających aminokwasy lub jasnoniebieskie w obecności białka.
Zanotować wyniki i zinterpretować je.
Zadanie 2. Wykrywanie białek i aminokwasów aromatycznych metodą
ksantoproteinową.
Podczas ogrzewania w środowisku stężonego kwasu azotowego aminokwasów
aromatycznych i białek zawierających w swoim składzie aminokwasy aromatyczne dochodzi
do utworzenia pochodnych nitrowych (związki aci- nitrowe), które w środowisku alkalicznym
dają intensywne żółtopomarańczowe zabarwienie.
· Wykonanie:
Do probówek odmierzyć kolejno po 1 ml:
- 1 % hydrolizatu białka,
- 2% roztworu albuminy,
-
1% roztworu tryptofanu
1% roztworu glicyny.
-Do każdej próby dodać po 1ml stężonego kwasu azotowego.
-Ogrzewać przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej.
-Po ochłodzeniu probówek należy bardzo ostrożnie (reakcja silnie egzotermiczna!!!), małymi
porcjami, stale mieszając, dodawać 3,5 ml 20% roztworu NaOH.
Po zalkalizowaniu próby pojawia się barwa żółtopomarańczowa.
Zanotować wyniki i zinterpretować je.
Zadanie 3. Wytrącanie białek jonami metali ciężkich.
Jeżeli wartość pH jest większa od pI, cząsteczki białka stają się anionami i mogą
reagować z kationami. Kationy metali ciężkich (Fe3+, Cu2+, Hg2+, Pb2+) dają z białkami
nierozpuszczalne kompleksy, powodując duże zmiany strukturalne w obrębie cząsteczki
białka. Wytrącają się osady denaturowanego białka nierozpuszczalne w wodzie ani
w nadmiarze soli.
·
Wykonanie:
-Do dwóch probówek odmierzyć po 1ml 0,2% roztworu albuminy.
-Do 1 probówki - dodać parę kropel octanu ołowiu - (CH2COO)2Pb (trucizna).
-Do 2 probówki - parę kropel chlorku rtęciowego- HgCl2 (trucizna).
Zanotować wynik i wyjaśnić przyczyny obserwowanego zjawiska.
Zadanie 4. Wytrącanie białek etanolem.
Rozpuszczalniki organiczne, w tym etanol czy aceton, powodują dehydratację otoczki
wodnej wokół cząsteczki białka zmniejszając tym samym jej rozpuszczalność (wypadanie
białka z roztworu) oraz wywołując zmiany denaturacyjne w jej obrębie. Jeżeli rozpuszczalniki
te działają krótko i w niskiej temperaturze (poniżej 0 0C), białko nie ulega denaturacji i można
je rozpuścić. Wytrącanie w temperaturze pokojowej przy długotrwałym działaniu
rozpuszczalników organicznych, prowadzi do denaturacji białka i staje się ono
nierozpuszczalne.
Wykonanie:
-Odmierzyć do dwóch probówek po:
- 2 ml etanolu
- i dodać po 0,5 ml roztworu białka jaja kurzego.
-Natychmiast po wytrąceniu osadu:
- do jednej probówki dodać 10 ml wody,
- a drugą probówkę pozostawić na 30 minut. Po tym czasie dodać do niej również 10 ml
wody.
Zanotować wynik, porównać efekt w obu probówkach i wyjaśnić przyczyny obserwowanego
zjawiska.
Zadanie 5. Wysalanie białek
Białka rozpuszczalne w wodzie można wytrącić z roztworu dużym stężeniem soli.
Proces ten nazywamy wysalaniem. Sole wiążące wodę pozbawiają cząsteczki białka płaszcza
wodnego, co zmniejsza ich rozpuszczalność i prowadzi do wytrącania z roztworu. Najczęściej
do wysalania stosuje się (NH4)2SO4, Na2SO4 lub MgSO4. Wysalanie jest procesem
odwracalnym. Po zmniejszeniu stężenia soli, można ponownie rozpuścić wytrącone białko.
Wykazuje ono swoje rodzime właściwości, ponieważ wysalanie nie powoduje denaturacji.
Albuminy można oddzielić od globulin wykorzystując ich różną rozpuszczalność w
stężonych roztworach soli. Globuliny tracą wodę hydratacyjną już przy 50% nasyceniu
(NH4)2SO4, albuminy wysalają się dopiero po całkowitym nasyceniu roztworu (NH4)2SO4.
·
Wykonanie
1) Do probówki odmierzyć 2 ml roztworu białka jaja kurzego i dodać 2 ml
nasyconego roztworu siarczanu amonowego.
Wytrąca się kłaczkowaty osad globulin.
Zaobserwować wynik.
Następnie dodać około 10 ml wody. Osad ulega rozpuszczeniu.
2) Do 50 ml erlenmajerki odmierzyć 10 ml roztworu białka jaja kurzego
i dodać taką samą ilość nasyconego roztworu siarczanu amonowego (10 ml),
wymieszać. Wytrąceniu ulegają globuliny.
Próbę przesączyć przez sączek bibułowy do suchej probówki.
Pobrać 2 ml przesączu i dodawać małymi porcjami siarczan amonowy
w substancji do uzyskania nasyconego roztworu aż na dnie probówki
pozostanie kilka nierozpuszczonych kryształów siarczanu amonu.
W tych warunkach wypadają wysolone albuminy.
3) Wytrącony osad albumin zebrać na sączku bibułowym (przesączyć próbę),
a otrzymany przesącz zbadać w celu stwierdzenia obecności białek. W tym
celu do przesaczu należy dodać kroplę 1 % kwasu octowego i wstawić do
wrzącej łaźni na parę minut.
Brak osadu świadczy o nieobecności białek w roztworze.
Zadanie 6. Próba Taubera z benzydyną na pentozy - pokaz
Próba Taubera z benzydyną jest charakterystyczna dla pentoz wolnych i związanych
w kwasach nukleinowych. Pentozy wielocukrowców dają reakcję dopiero po hydrolizie.
W obecności lodowatego CH3COOH furfural powstaje z pentoz dużo łatwiej niż
hydroksymetylofurfural z heksoz przez co próba Taubera jest uważana za ujemną dla heksoz,
a dodatnia dla pentoz.
·
Wykonanie:
Do 1 ml 4 % roztworu benzydyny w lodowatym CH3COOH wprowadzić po 2-3 krople
roztworu pentozy, heksozy i kwasu nukleinowego. Ogrzać do wrzenia (nie za długo) i
oziębić, dodać 2 ml wody. Powstaje czerwone zabarwienie w próbach zawierających pentozy.
Heksozy dają zabarwienie żółtobrązowe.