Promotory

Wykład VI
Regulacja ekspresji genów w terapii genowej
Promotory
Konstytutywne
Wirusowe
SV40
CMV
eukariotyczne
Indukowalne
Promotory
Naturalne
Wirusowe
złożone (chimerowe)
Eukariotyczne
Promotor
Konstytutywne, indukowalne
genu
o szerokim zakresie
terapeutycznego
działania
Promotory
tkankowo-specyficzne
Promotory
Naturalne
Złożone (chimerowe)
Regulowane przez antybiotyki
Regulowane przez
doksycyklinę
Regulowane przez
rapamycynę
Regulowane przez
hormony
progesteron
ekdyzon
Regulacja ekspresji genów
Clontech
Tet-off/Tet-on strategy in vitro (1)
Tet-off/Tet-on strategy in vitro (2)
Tet-off/Tet-on strategy in vitro (3)
Tet-off/Tet-on strategy in vitro (4)
Modyfikacje systemu ekspresji zależnej od doksycykliny
-gen tTA lub rtTA znajduje się pod kontrolą promotora tkankowospecyficznego
Wykorzystanie systemu ekspresji regulowanej przez doksycyklinę
w innych wektorach
-Retrowirusowe
-Adenowirusowe
-AAV
Hypoxia inducible factor – a crucial mediator of
hypoxia-induced gene expression
Erythropoiesis
& iron metabolism
Erythropoietin
Transferrin
Transferrin receptor
Ceruloplasmin
Heme oxygenase-1
O2
VEGF
VEGFR-1
HIF
Vasomotor control
NOS II
Cell proliferation
& viability
IGF-1
IGFBP-1&3
TGFβ3
NOS II
Angiogenesis
Energy metabolism
GLUT1,2 & 3
PEPCK
LDH A
PGK3
Aldolase A & C
PFK L & C
Pyruvate kinase
Enolase
Hypoxia-dependent promoters
Hamowanie ekspresji genów
za pomocą kwasów nukleinowych
Terapia genowa
Wzmacniająca
Substytucyjna
Hamująca
wzmocnienie
ekspresji genów
wprowadzenie
brakującego genu
hamowanie ekspresji
genów
1. Nowotwory
2. Miażdżyca
Strategies aimed at block of gene expression
Block of transcription
- sense strategy
binding of regulatory proteins, e.g. transcription factors, by oligonucleotides
decoy strategy)
- antigene strategy
triple helix formation between oligonucleotides and double-stranded DNA
Block of translation
- ribozymes
specifically targeted degradation of mRNA
- antisense strategy
binding of oligonucleotides to mRNA
- RNA interference
Functional inactivation of proteins
-interfering peptides or protein
Oligonukleotydy antysensowe
Krótkie fragmenty syntetycznych, chemicznie zmodyfikowanych
kwasów nukleinowych, zaprojektowanych tak, by hybrydyzowały
z komplementarnymi sekwencjami mRNA i blokowały syntezę białek
kodowanych przez takie docelowe transkrypty
Antisense oligonucleotides
- 13-25 nucleotides long
- hybridize to corresponding RNA
- act by: a) modulation of splicing
b) inhibition of protein translation by disruption of
protein assembly
c) utilise RNAse H enzymes
Losy oligonukletydów in vivo
1.Degradacja przez nukleazy surowicy
2. Pobieranie przez komórki wątroby (pobieranie niespecyficzne)
3. Pobieranie przez komórki nerki i wydzielanie z moczem
Antisense strategy - problems
1. Stability vs binding affinity
2. Delivery to target cells
3. Non-antisense effect
a) immune stimulation - CpG motifs
- phosphporotiate backbone
4. Well tolerated, side effects are dose dependent
5. Side effects: thrombocytopenia
hypotension
fever
asthenia
increase liver enzymes
complement activation
Clinical application of antisense oligonucleotides
Vitravene - CMV-induced retinitis
Bcl2 antisense - melanoma
Clinical trials with antisense oligonucleotides
Ribozymes
Small RNA molecules which allow sequence-specific endoribonucleolytic
cleavage in a catalytic manner
Processing of rRNA in Tetrahymena
Self-cleaving RNAs from:
- bacteriophages
- plant satellite virusoids
- satellite tobacco ringspot virus
- human delta hepatitis virus
RNA components of a polysaccharide branching enzyme and RNAse P
Discovered in the begining of 80’s by Thomas Cech and Sydney Altman
Rybozymy typu „hammerhead”
-występują w genomach wiroidów i wirusoidów, małych,
jednoniciowych RNA patogenów roślin
-zbudowane są z trzech helis połączonych pętlami
- w zmodyfikowanych rybozymach występuje tylko jedna pętla
- konieczna jest obecność sekwencji UH
Rybozymy typu „hammerhead”
H- A, C lub U
Delivery of ribozymes to target cells
- exogenous - ribozymes must be chemically modified
- endogenous - coding sequences for ribozymes are delivered
with viral vectors
Degradation of ribozymes in the serum
Prevention by modification – removal of 2’hydroxyl group, which is
required for the RNAses to cleave
Ribozymes - application
1. Inhibition of gene expression
HIV
HBV
HCV
CML - chronic myelogenous leukemia
tumors - ANGIOZYME
2. Correction of mutations
Ribozyme Pharmaceuticals Inc.
Sirna Therapeutics, Inc. (NASDAQ: RNAI), formerly Ribozyme Pharmaceuticals, Inc.
Interferencja RNA
RNA interference
PSTG – post-transciptional gene silencing
Specific inhibition of gene expression by double-stranded RNA,
which stimulates the degradation of a target mRNA
RNA interference
specialized type of RNA degradation – evolutionary ancient
defence mechanism
Functions: plants – protection from viruses
-Other organisms – protection from transposons replicating
via RNA intermediates
Several ways to obtain siRNA
1. Chemical synthesis of RNA
2. Synthesis of DNA oligos, annealing, adding T7 polymerase
promoter, transcription in vitro
3. Additing T7 polymerase promoter, transcription in vivo
4. Cloning of sequence coding antisense RNA into plasmid,
transfection and expression in cells
5. Cloning into adenoviral/AAV/retroviral vectors
Designing the RNAi oligos
www.ambion.com
Silencer siRNA construction kit (Ambion)
Application of RNAi in gene therapy
Inhibition of the expression of:
a)
b)
c)
d)
oncogenes
viral genes
apoptotic genes
Other genes – eg anti-angiogenic therapy in cancer
Different ways of inhibition of gene expression
DNA decoys
Pułapki oligonukleotydowe
DNA decoys
DNA decoys