FluoroSpheres

FluoroSpheres
Nr kat. K0110
Wydanie 6
Kulki kalibracyjne do codziennego monitorowania cytometru przepływowego.
Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 40 kalibracji.
(108651-004)
SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 1/9
Spis treści
Strona
Przeznaczenie .............................................................................................................................. 3
Streszczenie i wyjaśnienia ............................................................................................................ 3
Zasada oznaczenia....................................................................................................................... 3
Odczynniki.................................................................................................................................... 4
A. Materiały dostarczone.......................................................................................................... 4
B.
Materiały wymagane, lecz nie dostarczone...................................................................... 4
Środki ostroŜności ........................................................................................................................ 4
Przechowywanie........................................................................................................................... 4
Procedura oznaczania oraz akwizycji danych ............................................................................... 4
Analiza danych, Krzywa kalibracyjna ............................................................................................ 5
A. Definicje............................................................................................................................... 6
B. Ręczna kalibracja. Dotyczy urządzeń wyraŜających MFI w jednostkach
liniowych.............................................................................................................................. 6
C. Ręczna kalibracja. Dotyczy urządzeń wyraŜających MFI w numerach
kanałów ............................................................................................................................... 7
(108651-004)
SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 2/9
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Produkt FluoroSpheres jest przeznaczony do monitorowania wydajności cytometru
przepływowego.
Streszczenie i wyjaśnienia
Zestaw zawiera tzw. „ślepe kulki” Blank Beads oraz kulki kalibracyjne Calibration Beads o
średnicy 3,2 µm. Kulki kalibracyjne Calibration Beads są mieszaniną 5 rodzajów kulek
posiadających róŜne właściwości fluorescencyjne oraz jednego rodzaju kulek nie posiadających
właściwości fluorescencyjnych. Fluorescencyjne kulki zawierają połączenie wielu unikalnych
fluorochromów, które mogą być wzbudzane światłem o dowolnej długości fali z zakresu od 365
do 650 nm. PoniewaŜ fluorochromy z kulek róŜnią się od fluorochromów zazwyczaj stosowanych
w cytometrii przepływowej, róŜne są teŜ ich właściwości spektralne. Dlatego teŜ kulki nie mogą
zostać uŜyte do ustalenia kompensacji fluorescencyjnej. Dzięki przypisanym konkretnym
rodzajom kulek fluorescencyjnym wartości cząsteczek równowaŜnego fluorochromu (ang.
Molecules of Equivalent Fluorochrome - MEF), stosowanie produktu FluoroSpheres pozwala na
zamianę arbitralnych jednostek przeciętnego natęŜenia fluorescencji (ang. Mean Fluorescence
Intensity - MFI) na bezwzględne jednostki słuŜące do zapewnienia jakości oraz raportowania
danych cytometrii przepływowej.
Zasada oznaczenia
1.
Najpierw analizowane są ślepe kulki Blank Beads w celu ustalenia optymalnych ustawień
aparatur dla wszystkich badanych kanałów.
2.
Następnie analizowane są kulki kalibracyjne Calibration Beads. Dane zostają uŜyte do
stworzenia krzywej kalibracyjnej, gdzie na jednej osi zostają umieszczone wartości MFI a na
drugiej wartości MEF.
Krzywa kalibracyjna oraz skojarzone parametry statystyczne są uŜywane do oceny liniowości
działania aparatu. Ponadto dzięki krzywej kalibracyjnej moŜna równieŜ określić granicę detekcji
oraz zakres dynamiczny aparatu.
Kalibrację przy pomocy kulek FluoroSpheres moŜna przeprowadzić na jeden z dwóch sposobów:
Stałe ustawienie aparatu.
Przy wykorzystaniu tej metody wszystkie ustawienia urządzenia pozostają niezmienione z
upływem czasu. Wartości MFI dla róŜnych pików są monitorowane a wyniki zostają
wyświetlone jako data kalibracji a wartość MFI.
Stała odpowiedź aparatu.
Przy uŜyciu tej metody napięcie PMT jest regulowane tak, Ŝeby wartość MFI jednego z
wysoce fluorescencyjnych pików była wyświetlana za kaŜdym razem w dokładnie tym
samym kanale. Wynik zostają wyświetlone jako data kalibracji a napięcie PMT.
(108651-004)
SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 3/9
Odczynniki
A. Materiały dostarczone
Fiolka 1
1,7 mL
W 0,02% azydku sodu, 0,01% NP40
Fiolka 2
1.7 mL
Zawiera ślepe kulki Blank Beads oraz 5 rodzajów kulek posiadających
róŜne ilości fluorochromów wyraŜone w wartościach MEF odpowiednio
dla FITC, RPE, RPE-TxRed, Cy5 oraz APC. W przypadku wartości MEF
swoistych dla danej partii, prosimy o zapoznanie się z dołączonym
Arkuszem wartości analitycznych. W 0,02% azydku sodu, 0,01% NP40.
B. Materiały wymagane, lecz nie dostarczone
Ogólny sprzęt laboratoryjny wymagany przy procedurach cytometrii przepływowej.
Papier graficzny półlogarytmiczny i podwójnie logarytmiczny dla 5 cykli.
Kalkulator.
Oprogramowanie dla analizy danych cytometrii przepływowej.
Programy typu arkusz kalkulacyjny, jak np. Excel firmy Microsoft. Programy te są opcjonalne.
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej
postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako
niebezpieczne, moŜe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi,
powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą
ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
Przechowywanie
Przechowywać zestaw w temperaturze 2-8 °C. Nie u Ŝywać po dacie waŜności podanej na
etykiecie fiolek. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej,
uŜytkownik musi zweryfikować takie warunki. Jeśli wystąpią nieoczekiwane wyniki, których nie
moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, Ŝe przyczyną
moŜe być problem z niniejszym zestawem, naleŜy niezwłocznie skontaktować się z działem
Pomocy technicznej.
Procedura oznaczania oraz akwizycji danych
1. Mocno zmieszaj kulki przy pomocy mieszadła lub ręcznie - potrząsając.
2. Do kaŜdej z dwóch probówek dodaj 0,5 mL odpowiedniego buforu rozcieńczającego, np.
roztworu soli fizjologicznej zbuforowanego fosforanem, o pH 7,2. Dodaj jedną kroplę z
Fiolki 1, z kulkami ślepymi Blank Beads, do pierwszej probówki oraz jedną kroplę z Fiolki 2, z
kulkami kalibracyjnymi Calibration Beads, do drugiej probówki. Wymieszaj przy pomocy
mieszadła, aby uzyskać jednorodną zawiesinę kulek.
3. Przed akwizycją danych, wybierana jest amplifikacja logarytmiczna dla badanych detektorów
fluorescencji a kompensacja fluorescencji dla wszystkich parametrów jest ustawiana na zero.
(108651-004)
SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 4/9
4. UŜyj z cytometrem przepływowym probówki z kulkami Blank Beads.
5. Wyreguluj napięcia PMT, Ŝeby umoŜliwić pojawienie się piku kulek Blank Beads w pierwszej
dekadzie histogramu.
6. Stosując rozproszenie przednie (FSC) przeciwko rozproszeniu bocznemu (SSC), ustaw
aktywną bramkę na singletach kulek (patrz Rysunek 1).
7. Uzyskaj minimalnie 5 000 bramkowanych zdarzeń pochodzących od kulek Blank Beads.
8. UŜyj z cytometrem przepływowym probówki z kulkami Calibration Beads i uzyskaj dane dla
co najmniej 5 000 bramkowanych zdarzeń.
9. W badanym kanale fluorescencji powinno być widocznych sześć róŜnych pików natęŜeń
fluorescencji (patrz Rysunek 2).
Analiza danych, Krzywa kalibracyjna
Analiza wyników jest ograniczona do bramkowanych singletów kulek wolnych od resztek, w
sposób określony na wykresie punktowym rozproszenia przedniego (FSC) na rozproszenie
boczne (SSC) (patrz Rysunek 1).
Do określenia kaŜdego z 6 rodzajów kulek Calibration Beads stosuje się indywidualne markery
lub obszary (patrz Rysunek 2). Obszarów uŜywa się do określenia MFI kaŜdego rodzaju kulek.
Rysunek 1. Rozproszenie przednie (FSC) na rozproszenie boczne (SSC) kulek Blank Beads. Bramka została ustawiona pod kątem
zbierania singletów pochodzących od kulek.
(108651-004)
SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 5/9
855
R5
R6
R3
R4
641
R2
R1
Counts
427
213
0
100
1 01
102
FL1-H
103
104
Rysunek 2. Histogram rodzajów kulek FluoroSpheres.
A. Definicje
Log offset
Przesunięcie logarytmiczne reprezentuje wartość fluorescencji w kanale 0. Kanał 0 jest
zazwyczaj reprezentowany w oprogramowaniu producenta przy pomocy wartości arbitrarnych,
np. 1 w przypadku większości programów firmy Becton Dickinson oraz 0,1 w przypadku
programów firmy Coulter.
AvgRes%
Procent średnich resztek (ŚredResz%) jest niewaŜoną miarą liniowości odpowiedzi urządzenia.
Jest wyliczane przez określenie średniego bezwzględnego procentu, o który linia regresji róŜni
się od punktów rzeczywistych.
2
r
Współczynnik determinacji (r2) jest waŜoną miarą liniowości. Najbardziej przydatny jest przy
analizowaniu danych logarytmicznych.
Próg detekcji
ChociaŜ ślepe kulki Blank Beads nie posiadają wewnątrz fluorochromów, nadal wytwarzają one
pewien sygnał. Sygnał ten reprezentuje szum tła i tym samym poziom detekcji urządzenia.
MEF
Ang. Molecules of Equivalent Fluorochrome (czyli cząsteczki równowaŜnego fluorochromu), co
jest wartością fluorochromu na jedną kulkę.
Log dekady
Log (logarytm) dekady jest skalibrowanym zakresem pełnoskalowym lub zakresem
dynamicznym kalibrowanego parametru fluorescencji. Cytometry przepływowe są zazwyczaj
wyposaŜone we wzmacniacze o zakresie dynamicznym 3,5 lub 4 log dekady, w zaleŜności od
producenta. Zmniejszona wydajność cytometru przepływowego będzie mieć wpływ na log
dekady.
B. Ręczna kalibracja. Dotyczy urządzeń wyraŜających MFI w jednostkach liniowych
Tworzenie krzywej kalibracyjnej:
(108651-004)
SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 6/9
1.
Określ MFI dla kaŜdego z 6 rodzajów kulek FluoroSpheres Calibration Beads.
2.
Umieść na wykresie log MFI oraz odpowiadający log MEF dla róŜnych pików. Wylicz linię
prostą „o najlepszym dopasowaniu” według następującego wzoru:
log (MEF) = a x log (MFI) + b
gdzie a to nachylenie natomiast b jest miejscem przecięcia z osią Y, zwane równieŜ
„przesunięciem logarytmicznym” lub „wartością kanału zero”.
Wylicz skojarzone parametry statystyczne SredResz% oraz r2 krzywej kalibracyjnej.
4.
Zakres dynamiczy wzmacniacza jest wyraŜany w log dekady. Log decady moŜe zostać
wyliczony z linii regresji przez odjęcie log (MEFmin) od log (MEFmax). Log (MEFmin) i log
(MEFmax) są pochodnymi odpowiednio najniŜszej i najwyŜszej wartości MFI. W bieŜącym
przypadku MFI dla MEFmin oraz MEFmax wynoszą odpowiednio 100 i 104.
MEF (skala logarytmiczna)
3.
Próg detekcji
(MEF kulki 1)
1 (ślepa)
Przesunięcie logarytmiczne
(wartość kanału zero)
MFI (wartości liniowe)
Rysunek 3. Krzywa kalibracyjna (linia regresji) oparta na kulkach FluoroSpheres.
Przykład wyliczenia:
log
log
log
log
dekady = log (MEFmax) - log (MEFmin)
dekady = log (188 735) - log (30,8)
dekady = 5,28 – 1,49
dekady = 3,79
Liczba kanałów na dekadę:
PoniewaŜ liczba kanałów wynosi 1024, liczba kanałów na dekadę wynosi:
1024/3,79 = 270
C. Ręczna kalibracja. Dotyczy urządzeń wyraŜających MFI w numerach kanałów
Tworzenie krzywej kalibracyjnej:
1.
Określ MFI dla kaŜdego z 6 rodzajów kulek FluoroSpheres Calibration Beads.
2.
Umieść na wykresie MFI oraz logarytm (MEF) i wylicz linię prostą „o najlepszym
dopasowaniu” według następującego wzoru:
log (MEF) = a x MFI + b
gdzie a to nachylenia natomiast b to miejsce przecięcia z osią Y.
3.
Wylicz skojarzone parametry statystyczne SredResz% oraz r2 krzywej kalibracyjnej.
(108651-004)
SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 7/9
Zakres dynamiczy wzmacniacza jest wyraŜany w log dekady. Log decady moŜe zostać
wyliczony z linii regresji przez odjęcie log (MEFmin) od log (MEFmax). Log (MEFmin) i log
(MEFmax) są pochodnymi odpowiednio najniŜszej i najwyŜszej wartości MFI. W bieŜącym
przypadku MFI dla MEFmin oraz MEFmax wynoszą odpowiednio 0 i 1023.
MEF (skala logarytmiczna)
4.
Próg detekcji
(MEF kulki 1)
1 (ślepa)
Przesunięcie logarytmiczne
(wartość kanału zero)
MFI (numer kanału)
Rysunek 4. Krzywa kalibracyjna (linia regresji) oparta na kulkach FluoroSpheres.
Przykład wyliczenia:
log
log
log
log
dekady = log (MEFmax) - log (MEFmin)
dekady = log (188 735) - log (30,8)
dekady = 5,28 – 1,49
dekady = 3,79
Liczba kanałów na dekadę:
PoniewaŜ liczba kanałów wynosi 1024, liczba kanałów na dekadę wynosi:
1024/3,79 = 270
(108651-004)
SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 8/9
Objaśnienia symboli
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Zawiera ilość materiału
wystarczającą do <n> badań
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
Wyprodukowano przez:
Dako Denmark A/S
Produktionsvej 42
DK-2600 Glostrup
Denmark
Tel. +45 44 85 95 00
Fax +45 44 85 95 95
(108651-004)
SSK0110CE_02/PL/2015.12 s. 9/9