Pobierz protokół

Nr. kat. EM12
Wersja zestawu: 1.2016
miRNA KIT
Zestaw do izolacji miRNA
z tkanek zwierzęcych oraz
linii komórkowych
EXTRACTME®jestzastrzeżonym
znakiemtowarowymfirmyBLIRTS.A.
miRNA KIT
www.dnagdansk.com
2
Nr. kat. EM12
I.
PRZEZNACZENIE ZESTAWU
Zestaw EXTRACTME miRNA przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji
miRNA z możliwością jednoczesnej izolacji wilekocząsteczkowego RNA oraz DNA
o wysokiej czystości z 1–10 mg tkanki (świeżej lub mrożonej) oraz 104 – 106 komórek
linii komórkowych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane
w celu osiągnięcia wysokiej wydajności i czystości izolowanego miRNA. Produkt
przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych
II.
SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU
LICZBA IZOLACJI
Nr katalogowy
10
IZOLACJI
25
IZOLACJI
100
IZOLACJI
250
3 IZOLACJE
IZOLACJI
(DEMO)
EM12-010 EM12-025 EM12-100 EM12-250
EM12-D
MiRLys Buffer*
(miRNA Lysis Buffer)
4 ml
10 ml
40 ml
100 ml
1.2 ml
MiRW Buffer ***
(Wash Buffer)
5.4 ml
13.5 ml
49.5 ml
126 ml
4.5 ml***
3 ml
7,5 ml
2x 15 ml
5x 15 ml
0.9 ml
DNA Binding Columns
(kolumny wiążące DNA)
10 szt.
25 szt.
2x 50 szt.
5x 50 szt.
3 szt.
Large RNA Binding Columns
(kolumny wiążące
wielkocząsteczkowe RNA)
10 szt.
25 szt.
2x 50 szt.
5x 50 szt.
3 szt.
MiRNA Binding Columns
(kolumny wiążące miRNA)
10 szt.
25 szt.
2x 50 szt.
5x 50 szt.
3 szt.
MiREB
(Elution Buffer)
* Bezpośrednio przed izolacją do MiRLys Buffer można dodać 100% ß-merkaptoetanolu do
końcowego stężenia 1%. Trwałość MiRLys Buffer po dodaniu ß-merkaptoetanolu wynosi
4 tygodnie w temp. 2–8°C. Stąd też, w przypadku izolacji RNA prowadzonej partiami, należy
przenieść odpowiednią do izolacji ilość MiRLys Buffer do osobnej butelki (wolnej od RNaz)
i dodać ß-merkaptoetanol. Po dodaniu ß-merkaptoetanolu zalecane jest oznaczenie butelki.
** Przed pierwszym użyciem do MiRW Buffer należy dodać odpowiednią ilość 96–100% etanolu
(informacja na etykietach oraz w tabeli na następnej stronie). Po dodaniu etanolu zalecane
jest oznaczenie butelki.
*** Uwaga: w zestawie DEMO (EM12–D) MiRW Buffer zawiera już etanol
3
miRNA KIT
LICZBA IZOLACJI
Nr katalogowy
MiRW Buffer
Etanol 96-100%
Całkowita objętość
10
IZOLACJI
25
IZOLACJI
100
IZOLACJI
250
3 IZOLACJE
IZOLACJI
(DEMO)
EM12-010 EM12-025 EM12-100 EM12-250
EM12-D
5.4 ml
13.5 ml
49.5 ml
126 ml
4.5 ml
12.6 ml
31.5 ml
115.5 ml
294 ml
–
18 ml
45 ml
165 ml
420 ml
4.5 ml
Bufory MiRLys, MiREB należy przechowywać w temp. +4°C.
Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15-25°C).
Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby
uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw
zachowuje stabilność minimum przez okres 12 miesięcy.
III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
etanol 96–100% cz.d.a.
jałowe probówki wirownicze typu Eppendorf (1,5–2 ml) wolne od RNaz
pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet (wolne od RNaz)
rękawiczki jednorazowe
mikrowirówka z rotorem na probówki o obj. 1,5–2 ml (> 11 tys. x g)
worteks
statywy mrożeniowe (temp. <7°C) na probówki 1,5–2 ml lub kuwety
umożliwiające trzymanie probówek w warunkachchłodniczych
Opcjonalnie:
pp 100% ß-merkaptoetanol (ß-ME)
pp nożyczki, skalpel
pp probówki z kulkami ceramicznymi wolne od RNaz (nr kat. HPLM100)
pp homogenizator tkankowy na probówki 2 ml homogenizator nożowy
pp
pp
pp
pp
pp
pp
www.dnagdansk.com
termomikser o orbicie ruchu min. 2 mm
moździerz z gładkim wylewem (50–75 ml) z dopasowanym pistonem
ciekły azot
worteks z przystawką na probówki 2 ml
wirówka na falkony 10–15 ml (linie komórkowe)
woda utleniona 3% lub roztwór podchlorynu sodu <0,5%
4
Nr. kat. EM12
IV. ZASADA IZOLACJI
Zestaw EXTRACTME miRNA opiera się na zdolności złóż krzemionkowych do
wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych.
Procedura oczyszczania miRNA składa się z 7 etapów i jest przeprowadzana
z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych.
Pierwszym etapem jest homogenizacja tkanki, mająca na celu dezintegrację
połączeń międzykomórkowych (tkanki nabłonkowe) oraz fragmentację białek
wysokocząsteczkowych (tkanka mięśniowa, łączna).
Następnie homogenat poddawany jest lizie chemicznej z wykorzystaniem rodanku
guanidyny oraz detergentów. Obecne w materiale tkankowym RNazy inaktywowane
są poprzez zastosowanie wysokiego stężenia rodanku guanidyny oraz opcjonalnie
1% ß-merkaptoetanolu.
Kolejnym etapem jest usunięcie DNA poprzez wiązanie na pierwszej minikolumnie.
Następnie selektywnie immobilizowane zostaje wielkocząsteczkowe RNA
na kolumnie wiążącej. W następnym kroku następuje wiązanie miRNA do
przeznaczonej specjalnie do tego celu minikolumny.
Trzyetapowe przemywanie miRNA związanego do złoża minikolumny ma na celu
usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych.
Oczyszczone miRNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution
Buffer) lub wodą wolną od RNaz (pH 7,0–9,0) i jest gotowe do bezpośredniego
wykorzystania w technikach biologii molekularnej, takich jak RT–PCR, RT–qPCR
i Northern blotting.
5
miRNA KIT
V.
KONTROLA JAKOŚCI
Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME miRNA testowana jest według
opracowanych procedur. Wydajność oraz efektywność izolacji i oczyszczania RNA
analizowane są metodami spektrofotometrycznymi, oraz elektroforetycznymi.
Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego miRNA sprawdzana jest w reakcji
qPCR poprzedzonej reakcją odwrotnej transkrypcji.
VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU
MATERIAŁ WYJŚCIOWY
pp
pp
pp
tkanka świeża lub mrożona (najlepiej w temp. -80°C): 1–10 mg,
tkanka przechowywana w buforach inaktywujących RNazy: 1–10 mg
linie komórkowe: 104 –106 komórek
WYDAJNOŚĆ IZOLACJI RNA
Przykładowe wydajności izolacji RNA ze świeżego materiału biologicznego
podane są w sekcji XIII.
POJEMNOŚĆ ZŁOŻA
ok. 90 μg RNA
CZAS IZOLACJI
pp
pp
pp
25-30 min (po etapie lizy lub w przypadku braku homogenizacji dla linii
komórkowych)
35-70 min w przypadku homogenizacji w ciekłym azocie
35-50 min w przypadku homogenizacji mechanicznej (kulki ceramiczne)
CZYSTOŚĆ RNA
A260/A280 = 1.9 – 2.1
www.dnagdansk.com
6
Nr. kat. EM12
VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
pp
pp
pp
pp
pp
pp
Tkanka jest biologicznym materiałem niebezpiecznym ze względu na potencjalną
zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu,
bądź życiu człowieka. Przy pracy z materiałem tkankowym należy stosować
się do wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych.
Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy
bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać
ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych.
Zalecane jest używanie jałowych końcówek do pipet z filtrami wolnymi od RNaz.
Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki
w połączeniu z substancjami utleniającymi.
W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem.
W przypadku rozlania cieczy zawierającej krew, zanieczyszczoną powierzchnię
zmyć najpierw wodą z detergentem, a następnie 1% roztworem podchlorynu sodu.
Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladów
RNA lub zanieczyszczeń pomiędzy kolejnymi minikolumnami.
VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI
Ilość materiału wyjściowego
Jeśli istnieje konieczność izolacji całkowitego RNA z większej ilości materiału
(>10 mg, >106 komórek), należy tak zwiększyć ilość buforu RLys oraz rozdzielić na
większą ilość minikolumn, aby nie przekroczyć maksymalnej wielkości 10 mg tkanki
(lub 106 komórek) na minikolumnę. Przekroczenie tej wartości może spowodować
zatkanie się kolumny lub/i uzyskanie zanieczyszczonego miRNA.
Pobieranie i przechowywanie prób do izolacji RNA
Kluczowym elementem dobrej jakościowo i ilościowo izolacji RNA jest
rygorystyczna procedura pobierania i przechowywania materiału biologicznego.
Materiał po uzyskaniu (pobraniu) należy utrwalić poprzez mrożenie (-80°C lub
w ciekłym azocie) lub przechowywać w buforach chroniących RNA (np. RNAlater®,
Ambion) w temp. -20°C. W przypadku większości tkanek granicznym momentem
jest 30 minuta od momentu pobrania, natomiast w przypadku tkanek bogatych
w RNazy (trzustka, wątroba), tkankę należy natychmiast utrwalić.
Najlepsze efekty izolacji miRNA z linii komórkowych uzyskuje się ze świeżych
komórek. W przypadku późniejszej pracy, po odwirowaniu należy odrzucić pożywkę
znad osadu komórek i mrozić w temp. -80°C lub w ciekłym azocie (LN2).
7
miRNA KIT
Eliminacja RNaz
RNazy są bardzo aktywnymi enzymami, niewymagającymi kofaktorów do
aktywacji oraz odpornymi na autoklawowanie w temp. 121°C przez 15 min. W celu
wykluczenia możliwości degradacji RNA przez RNazy należy zastosować się do
następujących zaleceń:
a.
Zawsze stosować jednorazowe rękawiczki lateksowe/winylowe/nitrylowe
podczas pracy. Nie należy dotykać innych rzeczy niż bezpośrednio związanych
z izolacją RNA.
b. Próby na każdym etapie izolacji (w miarę możliwości również wirówka)
powinny zachować temp. 2–8°C. Najlepiej korzystać ze statywów
mrożeniowych, ze względu na kontaminację lodu RNazami. Wyizolowane
RNA należy obowiązkowo niezwłocznie wstawić do statywu mrożeniowego.
c. Plastiki zużywalne (tipsy, probówki) należy stosować wolne od RNaz, lub też
autoklawować w temp. 134°C przez 18–20 min.
d. Plastiki niezużywalne, szkło, porcelana: moczyć przez noc w roztworze
0,1 N NaOH/0,1% woda DEPC (lub woda wolna od RNaz), a następnie płukać
wodą DEPC lub wodą wolną od RNaz. Szkło i porcelanę (moździerze) w miarę
możliwości prażyć w temp. 150–240°C przez 2–4 h, następnie schłodzić do
temp. pokojowej.
e. Za pomocą 3% H2O2 lub <0,5% podchlorynu sodu (lub komercyjnie
dostępnych płynów inaktywujących RNazy) należy przetrzeć: blaty, pipety,
wirówkę (rotor osobno), statywy do probówek. Przed traktowaniem płynami
należy wykonać próbę, czy nie następuje reakcja z materiałami odkażanymi.
Elucja RNA ze złoża
Optymalną objętość buforu elucyjnego MiREB (Elution Buffer) należy dobrać
w zależności od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu
stężenia RNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 30–50 μl MiREB. Jeśli pożądane
jest otrzymanie RNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można
zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że obniży to wydajność
odzysku RNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie
na powierzchnię złoża.
www.dnagdansk.com
8
Nr. kat. EM12
Zanieczyszczenie DNA
Każdy materiał biologiczny podlegający izolacji RNA zawiera DNA. Żadna z obecnie
stosowanych metod izolacji RNA nie gwarantuje usunięcia 100% DNA bez
zastosowania metod enzymatycznych (DNaza) po izolacji RNA. Nawet śladowe
zanieczyszczenie DNA (rzędu kilku kopii gDNA na próbę) może spowodować
uzyskanie fałszywie pozytywnych wyników w reakcji qPCR (po etapie odwrotnej
transkrypcji). W celu wyeliminowania tego zagrożenia, proponujemy zastosowanie
komercyjnie dostępnych metod enzymatycznego usuwania DNA po izolacji RNA
(np. termolabilna dsDNaza, nr kat. EN32). W przypadku Eukaryota zalecamy
projektowanie układów qPCR niewrażliwych na zanieczyszczenia DNA (startery
obejmujące sąsiednie egzony lub z intronem >1,5 kpz).
Pienienie buforu MiRLys
Ze względu na zawartość detergentów niejonowych w buforze lizującym może
dojść do pienienia, co jest zjawiskiem normalnym dla tego typu buforów podczas
etapu homogenizacji, po worteksowaniu lub intensywnym pipetowaniu. W celu
usunięcia piany, probówkę należy wirować 1 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g).
IX. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI
1.
2.
3.
4.
5.
Każdy z odczynników zestawu należy dobrze wymieszać. Nie należy mieszać
zbyt intensywnie MiRLys Buffer.
Należy upewnić się czy do MiRW Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy
dodać odpowiednią ilość 96–100% etanolu (ilości podane są na etykietach
oraz w tabeli w sekcji II).
W przypadku wytrącenia osadu w buforach MiRLys lub MiRW, butelkę
z roztworem należy ogrzać do temp. 37°C (MiRW Buffer) lub temp. 50°C
(MiRLys Buffer) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając
co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej.
Przygotować statyw mrożeniowy, odpowiednie plastiki wolne od RNaz oraz
pozostałe elementy stanowiska do pracy z RNA.
Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem
mikrowirówki Eppendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach
rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.
9
miRNA KIT
X. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA
Ilość: 1–10 mg
Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie
Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji
Tkankę podzielić za pomocą pęsety i nożyczek lub skalpela na jak najmniejsze
fragmenty. W zależności od stopnia fragmentacji oraz rodzaju tkanki, przejść do
wyboru metod homogenizacji (poniżej) lub przejść do pkt. 1 Protokołu izolacji
(sekcja XI).
Ciekły azot (LN2)
1. Zamrożoną w LN2 tkankę umieścić w jałowym, uprzednio schłodzonym
moździerzu i za pomocą schłodzonego pistonu delikatnie lecz zdecydowanie
rozbić na małe fragmenty, następnie rozetrzeć.
2. Otrzymany proszek przenieść do probówki (2 ml) zawierającej 400 μl MiRLys
Buffer i przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
Jeśli po roztarciu powstaje cienka kleista warstwa zamiast proszku,
zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 400 μl MiRLys Buffer
i poprzez staranne pipetowanie zebrać całość i przenieść do probówki (2 ml),
nie zapominając o starannym przemyciu pistonu z resztek tkanki.
Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego
1. Umieścić tkankę w probówce (2 ml), dodać 100 μl MiRLys Buffer, homo­
genizować ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora.
2. Po uzyskaniu homogenatu, opłukać końcówkę nożową za pomocą
300 μl MiRLys Buffer, a następnie przenieść całość do nowej probówki (2 ml).
3. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
www.dnagdansk.com
10
Nr. kat. EM12
Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych
1.
2.
3.
4.
Do probówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 100 μl MiRLys Buffer
i przenieść pociętą tkankę.
Następnie umieścić w homogenizatorze tkankowym i rozdrabniać przez 30 s
przy 5–6 tys. rpm. Procedurę powtórzyć w razie konieczności.
W przypadku braku możliwości oceny stopnia rozdrobnienia tkanki
spowodowanej pienieniem buforu, probówkę zwirować przez 2 min przy 10 tys.
rpm (11 tys. x g).
W przypadku braku homogenizatora próbkę można rozdrobnić korzystając
z odpowiedniej przystawki do worteksu; minimum 5 min przy maksymalnych
obrotach.
Dodać 300 μl MiRLys Buffer i wymieszać przez pipetowanie.
Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
B. LINIE KOMÓRKOWE
Ilość: 104 –106 komórek
Materiał: świeże lub mrożone (-80°C lub -196°C) linie komórek
adherentnych lub zawiesinowych.
1.
2.
3.
4.
11
Zamrożone komórki rozmrozić w temp. 37°C lub RT. Komórki w pożywce lub PBS
zwirować w falkonie (15 ml) lub probówce (2 ml) przez 5 min przy 5 tys. rpm
(ok. 3 tys. x g). Odrzucić supernatant. W przypadku, gdy nie tworzy się zwarty osad
komórkowy należy komórki dwukrotnie przemyć przy pomocy 1 ml zimnego PBS.
Dodać 400 μl MiRLys Buffer. Wymieszać przez intensywne worteksowanie 30 s,
a następnie pipetowanie.
Dla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty) i połączenia
zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~107) mogą wystąpić
trudności z rozpuszczeniem osadu w MiRLys Buffer. Należy wtedy rozpipetować
ostrożnie osad z wykorzystaniem pipety z końcówką ≥1000 ml lub jałową
strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem do pipet.
Całość przenieść do nowej probówki (2 ml).
Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
miRNA KIT
XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI
1.
Rozdrobniony materiał biologiczny umieścić w probówce (2ml).
Dodać 400 μl MiRLys Buffer. Worteksować przez 60 s.
2.
Wirować przez 2 min przy 15-21 tys. x g.
3. Supernatant przenieść do minikolumny wiążącej DNA
umieszczonej w probówce odbierającej (2 ml) i wirować 2 min
przy 15-21 tys. x g. Zachować przesącz.
Minikolumnę zachować w celu dalszego oczyszczania DNA.
W przypadku pozostania niezwirowanego płynu w górnej części
minikolumny, należy powtórzyć wirowanie przez 2 min przy prędkości
≥14 tys. rpm (≥ 21 tys. x g). Jeśli to nie pomaga, prawdopodobnie materiał
nie uległ poprawnej homogenizacji lub trawienie było zbyt krótkie lub
wyjściowego materiału tkankowego było zbyt dużo.
4. Przesącz po kolumnie (≥400 μl) przenieść do wolnej od RNaz
probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml.
5. Dodać 0,5 objętości 96-100% etanolu i wymieszać
przez pipetowanie.
Na przykład do 400 µl supernatantu należy dodać 200 µl etanolu.
6. Roztwór przenieść do minikolumny wiążącej wielkocząsteczkowe
RNA umieszczonej w probówce odbierającej (2 ml) i wirować
2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g). Zachować przesącz.
Minikolumnę zachować w celu dalszego oczyszczania
wielkocząsteczkowego RNA.
Minikolumnę ze związanym wielkocząsteczkowym RNA należy
przechowywać nie dłużej niż 15 minut w temperaturze 4-8°C.
7.
Przesącz przenieść do wolnej od RNaz probówki typu Eppendorf
o pojemności 1,5-2 ml.
8. Do przesączu dodać 1 objętość 96-100% etanolu i wymieszać
przez pipetowanie.
Na przykład do 600 µl przesączu należy dodać 600 µl etanolu.
9. Przenieść 650 µl roztworu do minikolumny wiążącej miRNA
umieszczonej w probówce odbierającej (2 ml) i wirować 2 min
przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g). Wylać przesącz z probówki
odbierającej i ponownie umieścić w niej kolumnę.
www.dnagdansk.com
12
Nr. kat. EM12
10. Przenieść pozostałą część roztworu do minikolumny wiążącej
miRNA umieszczonej w probówce odbierającej (2 ml) i wirować
2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g). Wylać przesącz.
11. Przygotować minikolumny ze związanym DNA,
wielkocząsteczkowym RNA i miRNA.
12. Do przygotowanych minikolumn dodać 500 μl MiRW
Buffer i wirować 1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g).
Wylać przesącz z probówek odbierających i ponownie
umieścić w nich minikolumny.
13. Ponownie dodać 500 μl MiRW Buffer do minikolumn i wirować
1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g). Wylać przesącz
z probówek odbierającej i ponownie umieścić w nich minikolumny.
14. Ponownie dodać 500 μl MiRW Buffer do minikolumn i wirować
1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g). Wylać przesącz
z probówek odbierającej i ponownie umieścić w nich minikolumny.
15. Wirować 3 min przy 12 tys. rpm (15 tys. x g).
16. Ostrożnie wyjąć suche minikolumny z probówek odbierających
i umieścić je w jałowych, wolnych od RNAaz probówkach 1,5 ml
typu Eppendorf.
17. Nanieść 30-100 μl buforu elucyjnego MiREB centralnie na złoże
w minikolumnie.
Możliwe jest zmniejszenie objętości buforu elucyjnego.
Więcej wskazówek na temat elucji znajduje się w sekcji VIII.
Szczególne zalecenia i uwagi.
18. Inkubować minikolumny z buforem przez 2 min.
19. Wirować 2 min przy 8-10 tys. rpm (7-11 tys. x g).
20. Minikolumny usunąć, a wyizolowane kwasy nukleinowe umieścić
w statywie mrożeniowym. Wyizolowane RNA i DNA przechowywać
w temp. -80°C lub -20°C do czasu dalszych analiz.
13
miRNA KIT
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE
Problem
Prawdopodobna przyczyna
Rozwiązanie
Niska wydajność
izolacji miRNA
Tkanka źle przechowywana
lub utrwalona –
degradacja RNA.
Przechowywać tkankę w -80°C nie dłużej niż rok.
W przypadku stosowania buforu utrwalającego do
przechowywania tkanek, upewnić się, że jest on dobrej
jakości, a warunki przechowywania odpowiednie.
Zbyt mała ilość
materiału wyjściowego.
Pipette the supernatant carefully, without disturbing
the tissue or cell pellet.
Tkanka nieprawidłowo
rozdrobniona.
Upewnić się, że tkanka została odpowiednio
zhomogenizowana w MiRLys Buffer. Tkankę
należy uprzednio pokroić na jak najmniejsze
fragmenty, a następnie dobrać odpowiednią
metodę homogenizacji.
Zatkana minikolumna.
Patrz zatkana minikolumna.
Obecność RNaz.
Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi,
Eliminacja RNaz.
Niskie stężenie
RNA
Zbyt duża objętość
buforu elucyjnego.
Zmniejszyć objętość buforu elucyjnego
MiREB do 20-50 μl.
Zatkana
minikolumna
Materiał niewystarczająco
rozdrobniony.
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji.
Przeładowanie minikolumny
Nie przekraczać zalecanej ilości materiału wyjściowego.
Tkanka zbyt stara.
Używać tkanek świeżych lub odpowiednio utrwalonych.
Tkanka kilkukrotnie
rozmrażana.
Unikać cykli zamrażanie-rozmrażanie.
RNA fizycznie zdegradowane/
zbyt gwałtowna homogenizacja.
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji.
Obecność RNaz.
Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi,
Eliminacja RNaz.
Zbyt duża ilość materiału
wyjściowego.
Zmniejszyć ilość materiału wyjściowego.
Opcjonalne trawienie DNazą po izolacji RNA.
Niewłaściwa homogenizacja.
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji.
Opcjonalne trawienie DNazą po izolacji RNA.
Zdegradowane
RNA
Kontaminacja
DNA
www.dnagdansk.com
14
Nr. kat. EM12
XIII. PRZYKŁADOWE WYDAJNOŚCI IZOLACJI RNA ZE ŚWIEŻEGO MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO
MATERIAŁ
V elucji
Stężenie RNA
104
100 μl
328.3 ng/μl
2.03
32.83 μg
Nerka
10 mg
100 μl
319.3 ng/μl
1.88
31.93 μg
Jelito grube
10 mg
100 μl
168.8 ng/μl
2.14
16.88 μg
Linie komórkowe HCT116
Masa/ilość
A260/A280
Ilość RNA
XIV. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM
MiRLys Buffer
Niebezpieczeństwo
H302+H312+H332, H315,
P273, P30+P352, P280, P305+P351+P338, P304+P340
MiRW Buffer
Niebezpieczeństwo
H225, H319, H336
P210, P280, P305+P351+P338
H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H336 Może wywoływać uczucie
senności lub zawroty głowy. H302+H312+H332 Działa szkodliwie po połknięciu, w kontakcie ze skórą i po wdychaniu. P210 Przechowywać
z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P273 Unikać uwolnienia do środowiska.
P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ
DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać.
15
www.dnagdansk.com