Zestaw do izolacji RNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych

Zestaw do izolacji RNA z tkanek zwierzęcych oraz linii komórkowych

Nr kat. EM09
Wersja zestawu: 1.2012
Zestaw do izolacji RNA z tkanek
zwierzęcych oraz linii komórkowych
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM09
I.
PRZEZNACZENIE ZESTAWU
Zestaw EXTRACTME TOTAL RNA przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji RNA
o wysokiej czystości z 1–30 mg tkanki (świeżej lub mrożonej) oraz 104 – 107 komórek
linii komórkowych. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane
w celu osiągnięcia wysokiej wydajności i czystości izolowanego RNA. Produkt
przeznaczony jest wyłącznie do zastosowań badawczo-rozwojowych.
II.
SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU
25
100
250
3 izolacje
izolacji
izolacji
izolacji
(DEMO)
EM09-025
EM09-100
EM09-250
EM09-D
17 ml
68 ml
170 ml
2 ml
9 ml
36 ml
90 ml
2 ml***
29 ml
116 ml
290 ml
3,5 ml
2,5 ml
2 x 5 ml
5 x 5 ml
0,4 ml
RNA Homogenizing Columns H
25 szt.
2 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
RNA Purification Columns B
25 szt.
2 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
Collection Tubes (2 ml)
25 szt.
2 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
Instrukcja
1 szt.
1 szt.
1 szt.
1 szt.
Liczba izolacji
Nr katalogowy
RLys*
(RNA Tissue Lysis Buffer)
RW1 (conc.)**
(RNA Wash Buffer 1)
RW2
(RNA Wash Buffer 2)
REB
(RNA Elution Buffer)
Bezpośrednio przed izolacją do buforu RLys należy dodać 100% ß-merkaptoetanolu
do końcowego stężenia 1%. Trwałość buforu RLys po dodaniu ß-merkaptoetanolu
wynosi 4 tygodnie w temp. 2–8⁰C. Stąd też, w przypadku izolacji RNA prowadzonej
*
partiami, należy przenieść odpowiednią do izolacji ilość buforu RLys do osobnej
butelki (wolnej od RNaz) i dodać ß-merkaptoetanol. Po dodaniu ß-merkaptoetanolu
zalecane jest oznaczenie butelki.
Przed pierwszym użyciem do RW1 Buffer należy dodać odpowiednią ilość
96–100% etanolu (informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu
etanolu zalecane jest oznaczenie butelki.
**
***Uwaga: w zestawie DEMO (EM09–D) bufor RW1 zawiera już etanol.
25
100
250
3 izolacje
izolacji
izolacji
izolacji
(DEMO)
Nr katalogowy
EM09-025
EM09-100
EM09-250
EM09-D
RLys Buffer
17 ml
68 ml
170 ml
2 ml
100% ß-merkaptoetanol
170 µl
680 µl
1,7 ml
20 µl
RW1 Buffer
9 ml
36 ml
90 ml
2 ml
Etanol 96-100%
9 ml
36 ml
90 ml
-
Całkowita objętość
18 ml
72 ml
180 ml
2 ml
Liczba izolacji
Bufory RLys, RW1, REB należy przechowywać w temp. +4⁰C.
Kolumny można przechowywać w temp. +4⁰C lub pokojowej. Bufor RW2 należy
przechowywać w temp. pokojowej. Wszystkie roztwory z zestawu należy
przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku
parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez
okres minimum 12 miesięcy.
III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
www.dnagdansk.com
etanol 96–100% cz.d.a.
100% ß-merkaptoetanol
jałowe probówki wirownicze typu Eppendorf (1,5–2 ml) wolne od RNaz
pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet
(wolne od RNaz)
rękawiczki jednorazowe
mikrowirówka z rotorem na probówki o obj. 1,5–2 ml (> 10 tys. rpm)
worteks
statywy mrożeniowe (temp. <7°C) na probówki 1,5–2 ml lub kuwety
umożliwiające trzymanie probówek „na lodzie”
Nr kat. EM09
Opcjonalnie
pp nożyczki, skalpel
pp probówki w kulkami ceramicznymi wolne od RNaz
(zestaw EXTRACTME TOTAL RNA PLUS)
pp homogenizator tkankowy na probówki 2 ml
pp homogenizator nożowy
pp termomikser o orbicie ruchu min. 2 mm
pp moździerz z gładkim wylewem (50–75 ml) z dopasowanym pistonem
pp ciekły azot
pp worteks z przystawką na probówki 2 ml
pp wirówka na falkony 10–15 ml (linie komórkowe)
pp woda utleniona 3% lub roztwór podchlorynu sodu <0,5%
IV. ZASADA IZOLACJI
Zestaw EXTRACTME TOTAL RNA opiera się na zdolności złóż krzemionkowych do
wiązania kwasów nukleinowych w obecności wysokich stężeń soli chaotropowych.
Procedura oczyszczania RNA składa się z 6 etapów i jest przeprowadzana
z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych. Pierwszym etapem jest
homogenizacja tkanki, mająca na celu dezintegrację połączeń międzykomórkowych
(tkanki nabłonkowe) oraz fragmentację wysokocząsteczkowych białek (tkanka
mięśniowa, łączna). Następnie homogenat poddawany jest lizie chemicznej
z wykorzystaniem rodanku guanidyny oraz detergentów. Obecne w materiale
tkankowym RNazy inaktywowane są poprzez zastosowanie wysokiego
stężenia rodanku guanidyny oraz 1% ß-merkaptoetanolu. Wirowanie oraz
przepuszczenie supernatantu przez kolumnę homogenizacyjną umożliwia
eliminację niezlizowanych fragmentów tkanki/komórek. Immobilizacja RNA na
kolumnie wiążącej następuje dzięki dodatkowi etanolu. Trzyetapowe przemywanie
RNA związanego do złoża minikolumny ma na celu usunięcie pozostałych
zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone RNA
eluowane jest z minikolumny buforem o niskiej sile jonowej lub wodą wolną od
RNaz (pH 7,0–9,0) i jest gotowe do bezpośredniego wykorzystania w technikach
biologii molekularnej, takich jak RT–PCR, RT–QPCR, Northern blotting.
V.
KONTROLA JAKOŚCI
Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME TOTAL RNA testowana
jest według opracowanych procedur. Wydajność oraz efektywność izolacji
i oczyszczania RNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz
elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego RNA
sprawdzana jest w reakcji RT, a następnie z wykorzystaniem zwalidowanego
układu QPCR.
VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU
Materiał wyjściowy
pp
pp
pp
tkanka świeża lub mrożona (najlepiej w temp. -80⁰C): 1–30 mg,
tkanka przechowywana w buforach inaktywujących RNazy: 1–30 mg
linie komórkowe: 104 –107 komórek
Wydajność izolacji RNA
Przykładowe wydajności izolacji RNA ze świeżego materiału biologicznego
podane są w sekcji XIII.
Pojemność złoża
ok. 90 µg RNA
Czas izolacji
pp
pp
pp
16–20 min (po etapie lizy lub w przypadku braku homogenizacji dla linii
komórkowych)
30–60 min w przypadku homogenizacji w ciekłym azocie
30–40 min w przypadku homogenizacji mechanicznej (kulki ceramiczne)
Czystość RNA
A 260/A 280 = 1,9-2,1
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM09
VII. środki ostrożności
pp
pp
pp
pp
pp
pp
Tkanka jest biologicznym materiałem niebezpiecznym ze względu na
potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji
zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z materiałem
tkankowym należy stosować się do wymogów dotyczących biologicznych
materiałów niebezpiecznych.
Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy
bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać
ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych.
Zalecane jest używanie jałowych końcówek do pipet z filtrami wolnymi od RNaz.
Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne
związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania
buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. W przypadku rozlania
cieczy zawierającej krew, zanieczyszczoną powierzchnię zmyć najpierw
wodą z detergentem, a następnie 1% roztworem podchlorynu sodu.
Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić
śladów RNA lub zanieczyszczeń pomiędzy kolejnymi minikolumnami.
Produkt przeznaczony wyłącznie do zastosowań badawczo-rozwojowych.
VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI
Ilość materiału wyjściowego
Jeśli istnieje konieczność izolacji RNA z większej ilości materiału (>30 mg, >107
komórek), należy tak zwiększyć ilość buforu RLys oraz rozdzielić na większą
ilość minikolumn, aby nie przekroczyć maksymalnej wielkości 30 mg tkanki (lub
107 komórek) na minikolumnę. Przekroczenie tej wartości może spowodować
zatkanie się kolumny homogenizacyjnej lub/i uzyskanie zanieczyszczonego RNA.
Pobieranie i przechowywanie prób do izolacji RNA
Kluczowym elementem dobrej jakościowo i ilościowo izolacji RNA jest
rygorystyczna procedura pobierania i przechowywania materiału biologicznego.
Materiał po uzyskaniu (pobraniu) należy utrwalić poprzez mrożenie (-80⁰C
lub w ciekłym azocie) lub przechowywać w buforach inaktywujących rozkład
RNA (np. RNAlater ®, Ambion) w temp. -20⁰C. W przypadku większości tkanek
granicznym momentem jest 30 minuta od momentu pobrania, natomiast
w przypadku tkanek bogatych w RNazy (trzustka, wątroba), tkankę należy
natychmiast utrwalić.
Najlepsze efekty izolacji RNA z linii komórkowych uzyskuje się ze świeżych
komórek. W przypadku późniejszej pracy, po odwirowaniu należy odrzucić
pożywkę znad komórek i mrozić w temp. -80⁰C lub w LN2.
Eliminacja RNaz
RNazy są bardzo aktywnymi enzymami, niewymagającymi kofaktorów do
aktywacji oraz odpornymi na autoklawowanie w temp. 121⁰C przez 15 min.
W celu wykluczenia możliwości degradacji RNA przez RNazy należy zastosować
się do następujących zaleceń:
a. Zawsze stosować jednorazowe rękawiczki lateksowe/winylowe/nitrylowe
podczas pracy. Nie należy dotykać innych rzeczy niż bezpośrednio
związanych z izolacją RNA .
b. Próby w każdym etapie izolacji (w miarę możliwości również wirówka)
powinny zachować temp. 2–8⁰C. Najlepiej korzystać ze statywów
mrożeniowych, ze względu na kontaminację lodu RNazami.
c. Plastiki zużywalne (tipsy, probówki) należy stosować wolne od RNaz, lub
też autoklawować w temp. 134⁰C przez 18–20 min.
d. Plastiki niezużywalne, szkło, porcelana: moczyć przez noc w 0,1N NaOH/
woda DEPC (lub woda wolna od RNaz), a następnie płukać wodą 0,1%
DEPC (lub wodą wolna od RNaz). Szkło i porcelanę (moździerze) w miarę
możliwości prażyć w temp. 150–240⁰C przez 2–4 h, następnie schłodzić
do temp. pokojowej.
e. Za pomocą 3% H2O2 lub <0,5% podchlorynu sodu (lub komercyjnie
dostępnych płynów inaktywujących RNazy) należy przetrzeć: blaty, pipety,
wirówkę (rotor osobno), statywy do probówek. Przed traktowaniem płynami
należy wykonać próbę, czy nie następuje reakcja z materiałami odkażanymi.
Elucja RNA ze złoża
Optymalną objętość buforu elucyjnego REB (RNA Elution Buffer) należy dobrać
w zależności od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego
poziomu stężenia RNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 30–50 μl REB przy izolacji
z 2–10 mg tkanki lub <104 komórek oraz zwiększenie objętości buforu elucyjnego
do 100 μl w przypadku izolacji z 10–30 mg tkanki lub 104 –107 komórek.
Jeśli pożądane jest otrzymanie RNA o wysokim stężeniu, objętość buforu
elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze,
że obniży to wydajność odzysku RNA . Istotne w tym przypadku jest dodanie
buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM09
W przypadku pracy z większą ilością materiału (niezalecane ze względu
na możliwość zatkania kolumn), możliwe jest odzyskanie całkowitego RNA
z minikolumny poprzez przeprowadzenie dodatkowej elucji (100 μl). W tym
przypadku należy powtórzyć punkty 12–14 Protokołu izolacji, umieszczając
minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf. Bufor elucyjny REB
nie zawiera EDTA , którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach
enzymatycznych.
Zanieczyszczenie DNA
Każdy materiał biologiczny podlegający izolacji RNA zawiera DNA. Żadna z obecnie
stosowanych metod izolacji RNA nie gwarantuje usunięcia 100% DNA bez
zastosowania metod enzymatycznych (DNaza) po izolacji RNA . Nawet śladowe
zanieczyszczenie DNA (rzędu kilku kopii gDNA na próbę) może spowodować
uzyskanie fałszywie pozytywnych wyników reakcji QPCR (po etapie odwrotnej
transkrypcji) w aspekcie analizy ilościowej transkryptu. W celu wyeliminowania
tego zagrożenia, proponujemy zastosowanie komercyjnie dostępnych metod
enzymatycznego usuwania DNA po izolacji RNA. W przypadku Eukaryota zalecamy
projektowanie układów QPCR niewrażliwych na zanieczyszczenia DNA (startery
obejmujące sąsiednie egzony lub z intronem >1,5 kpz).
Pienienie buforu RLys
Ze względu na zawartość detergentów niejonowych w buforze lizującym może
dojść do pienienia, co jest zjawiskiem normalnym dla tego typu buforów podczas
etapu homogenizacji, po worteksowaniu lub intensywnym pipetowaniu. W celu
usunięcia piany, probówkę należy wirować 1 min przy 10 tys. rpm (11 tys. x g).
IX. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI
1.
2.
3.
Każdy z odczynników zestawu należy dobrze wymieszać. Nie należy mieszać
zbyt intensywnie buforu RLys.
Należy upewnić się czy do buforu RW1 został dodany etanol. Jeśli nie,
należy dodać odpowiednią ilość 96–100% etanolu (ilości podane są na
etykietach oraz w tabeli w sekcji II).
Bezpośrednio przed izolacją do buforu RLys należy dodać 100%
ß-merkaptoetanolu do końcowego stężenia 1%. Trwałość buforu RLys
po dodaniu ß-merkaptoetanolu wynosi 4 tygodnie w temp. 2–8⁰C. Stąd
też, w przypadku izolacji RNA prowadzonej partiami, należy przenieść
odpowiednią do izolacji ilość buforu RLys do osobnej butelki (wolnej od
RNaz) i dodać ß-merkaptoetanol.
4.
W przypadku wytrącenia się osadu w buforach RLys lub RW1, butelkę
z roztworem należy ogrzać do temp. 50°C (RLys) lub 37°C (RW1) i inkubować,
5.
aż do całkowitego rozpuszczenia się osadu, mieszając co kilka minut,
a następnie schłodzić do temp. pokojowej.
Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem
mikrowirówki Eppendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach
rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.
X.
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
A. TKANKA STAŁA ŚWIEŻA LUB MROŻONA
Ilość: 1–30 mg
Materiał: tkanki zwierzęce, tkanki ludzkie
Procedura ogólna niezależna od stosowanej metody homogenizacji
Tkankę podzielić za pomocą pęsety i nożyczek lub skalpela na jak najmniejsze
fragmenty. Przejść do wyboru metod homogenizacji (poniżej) lub przejść do
pkt. 1 Protokołu izolacji (sekcja XI).
Ciekły azot (LN2)
1. Zamrożoną w LN2 tkankę umieścić w jałowym, uprzednio schłodzonym
moździerzu i za pomocą schłodzonego pistonu delikatnie lecz zdecydowanie
rozbić na małe fragmenty, następnie rozetrzeć.
2. Otrzymany proszek przenieść do probówki (2 ml) zawierającej 600 μl buforu
RLys i przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
Jeśli po roztarciu powstaje cienka kleista warstwa zamiast proszku,
zhomogenizowaną tkankę zawiesić dodając do moździerza 600 μl buforu
RLys i poprzez staranne pipetowanie zebrać całość i przenieść do probówki
(2 ml), nie zapominając o starannym przemyciu pistonu z resztek tkanki.
Homogenizacja z użyciem homogenizatora nożowego
1. Umieścić tkankę w probówce (2 ml), dodać 100 μl buforu RLys,
homogenizować ostrożnie sterylną końcówką homogenizatora.
2. Po uzyskaniu homogenatu, opłukać końcówkę nożową za pomocą 500 μl
buforu RLys, a następnie przenieść całość do nowej probówki (2 ml).
3. Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM09
Homogenizacja z wykorzystaniem kulek ceramicznych (polecamy zestaw
EXTRACTME TOTAL RNA PLUS, w skład którego wchodzą dodatkowo probówki
z kulkami)
1. Do probówki zawierającej kulki ceramiczne dodać 200 μl buforu RLys
2.
3.
4.
i przenieść pociętą tkankę.
Następnie umieścić w homogenizatorze tkankowym i rozdrabniać przez
30 s przy 5–6 tys. rpm. Procedurę powtórzyć w razie konieczności.
W przypadku braku możliwości oceny stopnia rozdrobnienia tkanki
spowodowanej pienieniem buforu probówkę zwirować przez 2 min przy
10 tys. rpm (11 tys. x g).
W przypadku braku homogenizatora próbkę można rozdrobnić
korzystając z odpowiedniej przystawki do worteksu; minimum 5 min przy
maksymalnych obrotach.
Dodać 400 μl buforu RLys i wymieszać przez pipetowanie.
Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
B. LINIE KOMÓRKOWE
Ilość: 104 –107
Materiał: świeże lub mrożone (-80°C lub -196°C) linie komórek adherentnych
lub zawiesinowych.
1.
2.
3.
4.
Zamrożone komórki rozmrozić w 37°C. Komórki w pożywce lub PBS
zwirować w falkonie (15 ml) lub probówce (2 ml) przez 5 min przy 5 tys. rpm
(ok. 3 tys. x g). W przypadku, gdy nie tworzy się zwarty osad komórkowy
należy komórki dwukrotnie przemyć przy pomocy 1 ml zimnego PBS.
Dodać 600 μl buforu RLys. Wymieszać przez intensywne worteksowanie
30 s, a następnie pipetowanie.
Dla części komórek, szczególnie tworzących syncytia (mioblasty)
i połączenia zwarte (kom. nabłonkowe) oraz komórek w dużej ilości (~107)
mogą wystąpić trudności z rozpuszczeniem osadu w buforze RLys. Należy
wtedy rozpipetować ostrożnie z wykorzystaniem pipety z końcówką >1000
ml lub jałową strzykawką. Nie stosować w tym celu końcówek z filtrem.
Całość przenieść do nowej probówki (2 ml).
Przejść do pkt. 2 Protokołu izolacji (sekcja XI).
XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI
1. Rozdrobniony materiał biologiczny umieścić w probówce (2 ml).
Dodać 600 μl buforu RLys. Worteksować przez 60 s.
W przypadku pienienia roztworu należy go zwirować przez 1-2 min przy
10 tys. rpm (11 tys. x g). Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi.
2. Wirować 2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g).
3. S upernatant (ok. 600 μl) przenieść do minikolumny
homogenizacyjnej H umieszczonej w probówce odbierającej
(2 ml) i wirować 2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. x g).
Zachować przesącz.
W przypadku homogenizacji z wykorzystaniem kulek ceramicznych
należy ostrożnie pobrać odpowiednią ilość supernatantu wprowadzając
końcówkę pipety o poj. 200 μl pomiędzy kulki (uwaga: końcówki 1 ml mogą
ulec zatkaniu kulkami) i delikatnie odciągnąć supernatant. Resztki tkanki
powinny być widoczne na jednej ze ścianek lub na dnie probówki.
W przypadku pozostania niezwirowanego płynu w górnej części
minikolumny, należy powtórzyć wirowanie przez 2 min przy prędkości
≥14 tys. rpm (≥ 21 tys. x g). Jeśli to nie pomaga, prawdopodobnie materiał nie
uległ poprawnej homogenizacji lub trawienie było zbyt krótkie, lub wyjściowego
materiału tkankowego było zbyt dużo.
4. Do przesączu dodać 600 μl 96% EtOH. Wymieszać przez
pipetowanie lub worteksowanie 5 s.
5. Przenieść do minikolumny wiążącej B umieszczonej w probówce
odbierającej (2 ml) i wirować 1 min przy 12 tys. rpm (15 tys. x g).
6. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml).
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM09
7. Do minikolumny dodać 650 μl buforu płuczącego RW1 i wirować
1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g).
8. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej
z powrotem minikolumnę.
9. Do minikolumny dodać 650 μl buforu płuczącego RW2 i wirować
30 s przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g).
10. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej
z powrotem minikolumnę.
11. Do minikolumny dodać 500 μl buforu płuczącego RW2 i wirować
1 min przy 10-12 tys. rpm (11-15 tys. x g).
12. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej
i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf.
13. Nanieść na środek 50-100 μl buforu elucyjnego REB. Inkubować
przez 3 min w temp. pokojowej.
Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie
20-200 µl. Więcej wskazówek na temat elucji znajduje się w sekcji VIII.
Szczególne zalecenia i uwagi.
14. Wirować 2 min przy 8-10 tys. rpm (7-11 tys. x g).
15. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane RNA przechowywać
w temp. -80°C do czasu dalszych analiz.
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE
Problem
Prawdopodobna przyczyna
Rozwiązanie
Niska wydajność
izolacji RNA.
Tkanka
nieprawidłowo rozdrobniona.
Upewnić się, że tkanka została odpowiednio
zhomogenizowana w buforze RLys. Tkankę
należy uprzednio pokroić na jak najmniejsze
fragmenty, a następnie dobrać odpowiednią
metodę homogenizacji.
Tkanka źle przechowywana lub
utrwalona – degradacja RNA .
Przechowywać tkankę w -80°C nie dłużej niż rok.
W przypadku utrwalania upewnić się co do jakości
utrwalacza oraz warunków przechowywania.
Zbyt mała ilość materiału.
Zwiększyć ilość materiału wyjściowego.
Obecność RNaz.
Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi,
Eliminacja RNaz.
Zatkana minikolumna.
Patrz problem z zatkaną minikolumną.
Niskie stężenie RNA.
Zbyt duża objętość
buforu elucyjnego.
Zmniejszyć objętość buforu elucyjnego REB do
20-50 μl.
Zatkana minikolumna
H lub B.
Przeładowanie
minikolumny.
Nie przekraczać zalecanej ilości
materiału wyjściowego.
Wadliwa homogenizacja tkanki.
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji.
Przeniesienie osadu
komórkowego na kolumnę H.
Ostrożnie przenieść supernatant bez naruszania
resztek komórek (osadu).
Tkanka zbyt stara.
Używać tkanek świeżych/odpowiednio utrwalonych.
Tkanka kilkukrotnie rozmrażana.
Unikać cykli zamrażanie-rozmrażanie.
RNA fizycznie zdegradowane/
zbyt gwałtowna homogenizacja.
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji.
Obecność RNaz.
Patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi,
Eliminacja RNaz.
Niewłaściwa
homogenizacja.
Dobrać odpowiednie warunki homogenizacji.
Opcjonalne trawienie DNazą po izolacji RNA .
Zbyt duża ilość
materiału wyjściowego.
Zmniejszyć ilość materiału wyjściowego. Opcjonalne
trawienie DNazą po izolacji RNA .
Zdegradowane RNA.
Kontaminacja DNA.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM09
XIII. PRZYKŁADOWE WYDAJNOŚCI IZOLACJI RNA ZE ŚWIEŻEGO
MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO MATERIAŁ
Masa/ilość
V elucji
Stężenie RNA
A 260/A 280
Ilość RNA
Linie komórkowe
HCT116
107
100 μl
947,2 ng/μl
2,09
94,72 μg
Linie komórkowe
HCT116
104
100 μl
328,3 ng/μl
2,03
32,83 μg
nerka
30 mg
100 μl
923,6 ng/μl
2,07
92,36 μg
nerka
10 mg
100 μl
319,3 ng/μl
1,88
31,93 μg
Rak nerki
30 mg
100 μl
534,6 ng/μl
2,04
53,46 μg
Rak nerki
15 mg
100 μl
467,9 ng/μl
1,91
46,79 μg
Jelito grube
10 mg
100 μl
168,8 ng/μl
2,14
16,88 μg
Rak jelita grubego
30 mg
100 μl
603,7 ng/μl
2,06
60,37 μg
XIV. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM
RLys Buffer
Niebezpieczeństwo
H314, H315, H319, H335, H412,
H302+H312+H332
RW1 Buffer
Niebezpieczeństwo
H225, H314, H315, H319, H335, H412,
H302+H312+H332
RW2 Buffer
Niebezpieczeństwo
H225, H319, H336
H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H314
BLIRT S.A ., ul. Trzy Lipy 3/1.38, 80–172 Gdańsk, www.dnagdansk.com
T: +48 58 739 61 50 F: +48 58 739 61 51 E: [email protected]
Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. H315 Działa drażniąco
na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H335 Może powodować podrażnienie
dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty
głowy. H412 Działa szkodliwie na organizmy wodne, powodując długotrwałe
skutki. H302+H312+H332 Działa szkodliwie po połknięciu, w kontakcie ze skórą
lub w następstwie wdychania. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/
iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261
Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P273 Unikać
uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/
ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ
DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe,
jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P310 Natychmiast skontaktować
się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub lekarzem.
www.dnagdansk.com