otwórz w PDF

PROBLEMATYKA:
Chromatograficzne rozdzielanie składników próbek
TEMAT ĆWICZENIA:
ROZDZIELENIE MIESZANINY WĘGLOWODORÓW TECHNIKĄ
WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
METODA:
Wysokosprawna chromatografia cieczowa
WPROWADZENIE
Chromatografia
Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania składników jednorodnych
mieszanin w wyniku ich różnego podziału między fazę ruchomą i nieruchomą układu
chromatograficznego.
Klasyfikację technik chromatograficznych można przeprowadzić według kilku
kryteriów. W zależności od użytej fazy ruchomej chromatografię dzielimy na: gazową (ang.
gas chromatography, GC), cieczową (liquid chromatography, LC), z fazą ruchomą w stanie
nadkrytycznym (supercritical fluid chromatography, SFC). W zależności od zastosowanej fazy
stacjonarnej wyróżniamy następujące układy chromatograficzne: gaz-ciecz (ang. gas-liquid
chromatography, GLC), ciecz-ciecz (ang. liquid-liquid chromatography, LLC), gaz-ciało stałe
(ang. gas-solid chromatography, GSC), ciecz-ciało stałe (ang. liquid-solid chromatography,
LSC).
Ze względu na naturę zjawiska stanowiącego podstawę procesu chromatograficznego
chromatografię dzielimy na:
• adsorpcyjną, w której rozdzielanie odbywa się w wyniku różnego powinowactwa
adsorpcyjnego składników mieszaniny do powierzchni fazy stacjonarnej, zwanej w tym
przypadku adsorbentem,
• podziałową, w której rozdzielanie odbywa się w wyniku różnych wartości
współczynników podziału składników mieszaniny pomiędzy dwie nie mieszające się
fazy, z których jedna jest fazą stacjonarną (ciecz osadzona na nośniku), a druga fazą
ruchomą (gaz, ciecz, płyn w stanie nadkrytycznym),
• jonowymienną, w której podstawą rozdzielania są różnice w sile oddziaływań
międzycząsteczkowych pomiędzy jonami próbki a jonami związanymi z fazą
stacjonarną. Faza stacjonarna zwana jest jonitem – nierozpuszczalna substancja
wielkocząsteczkowa o budowie jonowej zdolna do wymiany jonów,
• sitową (żelową, sączenie molekularne), w której o rozdzieleniu składników mieszaniny
decydują rozmiary cząstek.
Chromatografię można podzielić także pod względem techniki eksperymentalnej –
chromatografia kolumnowa i planarna (możliwa tylko w układzie, w którym fazą ruchomą jest
ciecz).
Możliwość rozdzielania chromatograficznego substancji wynika z faktu, że poszczególne
składniki próbki w niejednakowym stopniu ulegają podziałowi między dwie nie mieszające się
fazy, przy czym jedna z tych faz jest ruchoma (tzw. eluent), a druga stanowi nieruchome
wypełnienie kolumny chromatograficznej lub cienką warstwę na płytce chromatograficznej
(faza stacjonarna). Różnica we współczynnikach podziału (K) składników mieszaniny
1
pomiędzy fazę ruchomą i fazę stacjonarną warunkuje rozdzielenie tych substancji. Jeżeli cs i cm
oznaczają stężenia składnika odpowiednio w fazie stacjonarnej i ruchomej to współczynnik
podziału jest równy ich ilorazowi (1).
K=
cs
cm
(1)
K jest wielkością charakteryzującą daną substancję i zależy od fazy stacjonarnej. Między
liczbą cząsteczek związków chromatografowanych, obecnych w fazie ruchomej i nieruchomej,
ustala się równowaga dynamiczna. Naturalne przemieszczanie się substancji rozdzielanych w
kolumnie następuje tylko w fazie ruchomej, tj. za pośrednictwem gazu nośnego
(chromatografia gazowa) lub eluenta (chromatografia cieczowa). Zatem większe wartości K
oznaczają dłuższy czas przebywania w fazie stacjonarnej (większe powinowactwo do fazy
stacjonarnej) i stąd późniejsze opuszczenie kolumny, natomiast te, które mają większe
powinowactwo do fazy ruchomej szybciej opuszczają kolumnę i mają niższą wartość
współczynnika podziału.
Wielkości retencyjne
Efekt rozdzielenia chromatograficznego wykreślony jest w postaci krzywej elucji
(chromatogramu), przedstawiającego zależność sygnału analitycznego od czasu retencji lub
objętości retencji. Czas retencji oznacza czas przebywania substancji chromatografowanej w
kolumnie.
Całkowity czas retencji, tR, substancji chromatografowanej jest to czas od momentu
zadozowania jej do aparatu do momentu zarejestrowania maksimum piku odpowiadającego tej
substancji. Czas ten jest sumą czasu, w którym substancja oddziałuje z fazą stacjonarną i czasu,
który jest jej potrzebny do przejścia od momentu zadozowania do pojawienia się w detektorze,
gdyby takiego oddziaływania nie było. Dlatego też, substancja, która zupełnie nie oddziałuje z
wypełnieniem fazy stacjonarnej wymaga skończonego czasu na przejście przez aparat i
kolumnę od momentu wstrzyknięcia do pojawienia się sygnału na rejestratorze w postaci piku.
Czas ten definiowany jest jako zerowy czas retencji, t0, dawniej zwany też martwym czasem
retencji, tM. Natomiast czas oddziaływania substancji na fazę stacjonarną nazywany jest
zredukowanym czasem retencji, tR', i jest równy różnicy całkowitego czasu retencji i zerowego
czasu retencji.
Wykorzystując zmierzone wielkości retencyjne, można wyznaczyć kolejne wielkości
charakteryzujące rozdzielenie chromatograficzne. Jedną z nich jest współczynnik retencj, k (2)
(dawniej określany jako współczynnik pojemnościowy). Jest to stosunek czasu, w którym
substancja chromatografowana oddziałuje z wypełnieniem fazy stacjonarnej do czasu, w
którym przebywałaby ona tylko w fazie ruchomej (nie oddziałując). Współczynnik k określa
ile razy dłużej przebywa w kolumnie substancja oddziałująca z fazą stacjonarną od substancji
nie oddziałującej z tą fazą (wyraża sprawność fazy stacjonarnej).
t −t
t'
k= R 0 = R
t0
t0
(2)
Sprawność rozpuszczalnika można wyrazić ilościowo, posługując się retencją względną,
α (3) zwaną też współczynnikiem selektywności lub współczynnikiem rozdzielania.
α =
'
tR
tR 2 − t0
K2
k
2
=
=
= 2
'
K1
tR 1 − t0
k1
tR 1
(3)
Sprawność kolumny chromatograficznej mierzy się dla danej substancji liczbą pólek
teoretycznych, N, w kolumnie. Pod pojęciem półki teoretycznej należy rozumieć najmniejszą
objętość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan równowagi pomiędzy stężeniem analitu w
fazie ruchomej i stacjonarnej. Zależność (4) podaje jeden ze sposobów wyznaczenia liczby
2
półek teoretycznych, przy założeniu, że pik pochodzący od substancji ma kształt krzywej
Gaussa i szerokość przy podstawie równą w:
t 
N = 16 ⋅  R 
w
2
(4)
Wysokość równoważna półce teoretycznej, HETP (ang. height equivalent to a theoretical
plate), należy rozumieć jako najmniejszą wysokość kolumny, w której zostaje osiągnięty stan
równowagi pomiędzy stężeniem substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i
stacjonarnej. HETP definiowana jest za pomocą równania 5 (gdzie L to długość kolumny
chromatograficznej [cm]:
HETP =
L
N
(5)
Zdolność rozdzielczą pików, RS, wyznaczamy w oparciu o równanie (6). Zazwyczaj
podaje się zdolność rozdzielczą dla dwóch składników, które są najsłabiej rozdzielone.
Zdolność rozdzielcza dla pozostałych par składników jest co najmniej taka sama lub lepsza.
 tR − tR1
RS = 2 ⋅  2
 w1 + w 2




(6)
Aparatura
Do wykonania analiz techniką chromatografii cieczowej kolumnowej służy chromatograf
cieczowy. Schemat blokowy chromatografu cieczowego przedstawiono na rysunku 3.
Rys.3. Schemat blokowy chromatografu cieczowego: 1) zbiornik fazy ruchomej, 2) filtr, 3) pompa,
4) manometr, 5) dozownik, 6) kolumna, 7) termostat, 8) detektor, 9) wzmacniacz, 10) komputer,
11) automatyczny podajnik próbek, 12) kolektor frakcji) [1].
ZASTOSOWANIE METODY SYMPLEKSÓW W OPTYMALIZACJI PROCEDURY
ANALITYCZNEJ
Optymalizacja to proces poszukiwania najlepszego, ze względu na wybrane kryterium,
rozwiązania danego problemu, przy uwzględnieniu narzuconych ograniczeń. Przed
przystąpieniem do badań optymalizacyjnych konieczne jest przeprowadzenie dogłębnej analizy
problemu, w następujących krokach: 1) określenie przedmiotu optymalizacji, 2) zdefiniowanie
kryterium optymalizacji, 3) wyselekcjonowanie czynników, 4) wyznaczenie ograniczeń i 5)
3
optymalizacja doświadczalna. W procesie optymalizacji rozpatruje się określoną cechę Y
procedury analitycznej (np.: czułość, precyzja, dokładność, stosunek sygnału do szumu)
będącą funkcją „n” czynników x1, …, xn, które w tym procesie mogą odegrać istotną rolę. W
chromatografii cieczowej wielkościami takimi mogą być np.: skład jakościowy i ilościowy
fazy ruchomej, siła elucyjna, szybkość przepływu fazy ruchomej, temperatura pracy kolumny.
Celem optymalizacji jest znalezienie wartości czynników x1(E), …, xn(E), dla których funkcja
Y przyjmuje wartość ekstremalną (najkorzystniejszą) – Y(E). Proces optymalizacji metodą
sympleksów rozpoczyna się od zaplanowania sympleksu startowego, którego współrzędne
wierzchołków (A, B, C) wybiera się na podstawie danych literaturowych (patrz Rys. 2). W
kolejnym kroku wyznacza się wartości funkcji Y w ustalonych wierzchołkach sympleksu
startowego. Następnie, szereguje się wierzchołki według wzrastających odpowiedzi: YA < YB
< YC (YC jest najkorzystniejszą odpowiedzią). Wierzchołek A, dla którego wartość funkcji Y
była najmniej korzystna jest odbijany w „środku ciężkości” pozostałych wierzchołków (B i C)
sympleksu. Otrzymany w taki sposób nowy punkt pomiarowy D tworzy wraz z wierzchołkami
B i C nowy sympleks. Dla warunków wierzchołka D wyznacza się wartość odpowiedzi YD i
ponownie porównuje się wartości odpowiedzi w wierzchołkach analizowanego sympleksu (B,
C i D). Możliwe są następujące sytuacje:
a) YA < YB < YD < YC (odpowiedź w wyznaczonym punkcie D jest bardziej korzystna
niż w wierzchołku B i mniej korzystna niż w wierzchołku C) – operacja: odbicie wierzchołka
B (powstaje wierzchołek E);
b) YA < YB < YC < YD (odpowiedź w wyznaczonym punkcie D jest najbardziej
korzystna) – operacja: ekspansja wierzchołka D (powstaje wierzchołek G);
c) YA < YD < YB < YC (odpowiedź w wyznaczonym punkcie D jest najmniej korzystna w
nowym simpleksie BCD, ale lepsza niż dla wierzchołku A) – operacja: kontrakcja w
simpleksie BCD (powstaje wierzchołek H);
d) YD < YA < YB < YC (odpowiedź w wyznaczonym punkcie D jest najmniej korzystna w
nowym simpleksie BCD i dodatkowo gorsza niż dla wierzchołka A) – operacja: kontrakcja w
simpleksie ABC (powstaje wierzchołek I).
Rys. 2. Kroki optymalizacyjne w zmodyfikowanej metodzie sympleksów [3].
Współrzędne punktu D po odbiciu (a,b) znajdujemy za pomocą wzoru:
(7)
gdzie K wynosi 2. W przypadku punktu piątego wartość K wynosić może 2 (odbijanie - E), >2
(ekspansja – G), 1,5 (kontrakcja 1 – H), 0,5 (kontrakcja 2 – I).
4
ZAGADNIENIA DO KOLOKWIUM
1-4. Wyjaśnij pojęcia (każdy student będzie musiał zdefiniować na kolokwium dwa spośród
wymienionych pojęć): chromatografia, całkowity czas retencji, zerowy czas retencji,
zredukowany czas retencji, współczynnik podziału, współczynnik retencji, współczynnik
selektywności, wysokość równoważna półce teoretycznej, szereg eluotropowy, eluent,
faza stacjonarna, chromatograf, chromatogram, chromatografia w normalnym układzie
faz, chromatografia w odwróconym układzie faz, sympleks.
5.
Jakie wymagania muszą spełniać rozpuszczalniki używane jako fazy ruchome w
chromatografii cieczowej?
6.
Wymień detektory stosowane w chromatografii cieczowej i wyjaśnij zasadę działania
dwóch wybranych.
7.
Narysuj schemat blokowy chromatografu cieczowego i zwięźle wyjaśnij rolę wszystkich
elementów.
8.
Dokonaj podziału metod chromatograficznych ze względu na zjawisko stanowiące
podstawę procesu chromatograficznego.
9-12. Techniką HPLC rozdzielano substancję A, B, C na kolumnie o długości 20* cm.
Przepływ fazy ruchomej wynosił 0,5* ml·min-1, a zerowy czas retencji 2,0 min. Czasy
retencji pików tR i szerokości pików w wynoszą:
Substancja
A
B
C
tR* [min]
5,4
13,4
16,2
w* [min]
0,4
0,8
1
Oblicz:
a) liczbę półek teoretycznych, N (dla składnika C)
b) współczynnik retencji, k (dla składnika B)
c) zdolność rozdzielczą, Rs (dla pików A i B)
d) współczynnik selektywności, α (dla pików B i C)
* - dane przykładowe
LITERATURA OBOWIĄZUJĄCA
1.
2.
3.
W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 2004,
255-268, 301-320, 345-357.
Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 2005, 167-261.
A. Parczewski, Zastosowanie metody sympleksów w optymalizacji procedur
analitycznych, Chemia analityczna 26 (1981) 771.
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA
CEL ĆWICZENIA
Celem ćwiczenia jest optymalizacja procesu rozdzielenia techniką HPLC mieszaniny
węglowodorów aromatycznych: toluenu, etylobenzenu, ksylenów i mezytylenu
z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody sympleksów.
5
PRZYRZĄDY, NACZYNIA I ODCZYNNIKI
•
•
•
•
•
•
wysokosprawny chromatograf cieczowy: Agilent Technologies 1220
kolumna: Allsphere ODS o dług. 10 cm, śred.4,6 mm, śred. ziarna 5 µm (Alltech);
acetonitryl, woda ultraczysta (Milipore);
roztwory poszczególnych analitów (stężenia wg opisu na fiolkach);
zestaw pipet automatycznych z odpowiednimi końcówkami;
strzykawka o pojemności 10 ml, mikrostrzykawka do wprowadzania próbek.
SPOSÓB WYKONANIA
WAŻNE: Po zmianie fazy ruchomej należy przepłukiwać zestaw HPLC ok. 10-15 min.
Podczas pracy zestawu należy często sprawdzać poziom rozpuszczalników w butlach ze
składnikami fazy ruchomej, aby nie doprowadzić do zassania powietrza przez pompę.
• Przygotować wodę ultraczystą i acetonitryl, poddać je 5-minutowemu działaniu
ultradźwięków w celu odgazowania;
• Przygotować aparat pomiarowy do pracy: przemyć pętlę dozownika oraz przepłukać
zestaw fazą zawierającą H2O i ACN w stosunku objętościowym 20:80;
• Przygotować próbkę o stężeniu wskazanym przez asystenta zawierającą 4 węglowodory
aromatyczne (toluen, etylobenzen, ksyleny i mezytylen) rozpuszczone w mieszaninie
H2O i ACN (20:80, v/v);
• Przeprowadzić
optymalizację
rozdzielenia
chromatograficznego
mieszaniny
węglowodorów stosując zmodyfikowaną metodę sympleksów z dwoma czynnikami
odgrywającymi rolę (a) skład fazy ruchomej i (b) prędkość przepływu (patrz Rys.2):
− poszczególnym wierzchołkom sympleksu startowego przypisać punkty (a,b) według
wskazówek asystenta;
− następnie postępować według wytycznych opisanych w punkcie „Zastosowanie
metody sympleksów w optymalizacji procedury analitycznej”;
− przy
ocenie
skuteczności
rozdzielania
węglowodorów
aromatycznych
w poszczególnych wierzchołkach sympleksów za funkcję odpowiedzi Y1 przyjąć RS.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
• Na podstawie zarejestrowanych chromatogramów wyznaczyć parametry opisujące układ
chromatograficzny: selektywność (α), zdolność rozdzielczą RS (obydwa parametry
obliczyć dla dwóch najmniej rozdzielonych pików), sprawność kolumny (HETP, N). W
obliczeniach współczynnika selektywności, jako czas martwy proszę przyjmować
wartość o 1,5 min mniejszą od czasu retencji dla toluenu (wyniki obliczeń zestawić w
tabelach dla każdego punktu pomiarowego osobno);
• Uwzględniając wyniki uzyskane zmodyfikowaną metodą sympleksów z funkcją
odpowiedzi RS wybrać optymalny skład i prędkość przepływu fazy ruchomej, wybór
uzasadnić;
• Proszę porównać wyniki uzyskane dla dwóch funkcji odpowiedzi Y1 i Y2
(uwzględniającej również czas analizy) opisanych równaniami 7 i 8 (odpowiednio):
Y1 = R s
(7)
6
R s2 ⋅ H max
(8)
t R,ost ⋅ w max
gdzie: RS – rozdzielczość najgorzej rozdzielonych pików, Hmax – wysokość najwyższego
piku, tR,ost – czas retencji ostatniego piku, wmax – szerokość przy podstawie najszerszego
piku.
Y2 =
Proszę napisać, jak uwzględnienie czasu analizy, intensywności i szerokości pików
wpływa na wyniki i czy cały proces optymalizacji zmodyfikowaną metodą sympleksów
przebiegałby tak samo (czy do odbicia wybralibyśmy ten sam punkt sympleksu wyjściowego),
dla funkcji odpowiedzi Y2. Czy wybrana funkcja odpowiedzi ma istotne znaczenie? Jaki byłby
optymalny skład i prędkość przepływu fazy ruchomej wybrany na podstawie zmodyfikowanej
metody sympleksów z funkcją odpowiedzi Y2.
OSTRZEŻENIA DOTYCZĄCE EWENTUALNYCH
NIEBEZPIECZEŃSTW
Niebezpieczne odczynniki chemiczne: acetonitryl oraz węglowodory aromatyczne:
toluen, etylobenzen, ksyleny i mezytylen (na ćwiczeniu używane w postaci rozcieńczonych
roztworów) są cieczami:
1) wysoce łatwopalnymi,
2) działającymi toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki,
3) działającymi drażniąco lub szkodliwie w następstwie wdychania, po połknięciu, w kontakcie
ze skórą lub oczami.
Z tego względu należy:
ad.1. Przechowywać wspomniane odczynniki z dala od źródeł ciepła / iskrzenia / otwartego
ognia / gorących powierzchni. Palenie wzbronione.
ad.2. Unikać uwolnienia do środowiska.
ad.3. Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. Stosować rękawice
ochronne/ odzież ochronną. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać
wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal
płukać.
7