log gazu

Pracownia dyplomowa
III rok Ochrona Środowiska Licencjat (OŚI)
Ćwiczenie 1
Analiza jakościowa w chromatografii gazowej
Wstęp
Chromatografia jest metodą fizykochemiczną metodą rozdzielania składników jednorodnych
mieszanin w wyniku ich różnego podziału między fazą ruchomą (poruszającą się
w określonym kierunku) a fazą nieruchomą (stacjonarną) układu chromatograficznego. Różny
podział składników mieszaniny pomiędzy obie fazy powoduje zróżnicowanie prędkości
migracji i rozdzielenie składników (Rys. 1).
Rys. 1. Mechanizm procesu chromatograficznego. Substancje
i
charakteryzują się
zróżnicowanymi współczynnikami retencji k.
Faza ruchoma porusza się wewnątrz kolumny, natomiast faza stacjonarna stanowi
wypełnienie
kolumny
lub
jest
osadzona
na
wewnętrznych
ściankach
kolumny.
W chromatografii gazowej (GC - gas chromatography) fazą ruchomą jest gaz; fazą
stacjonarną może być:
ciało stałe: adsorbent, wtedy mamy do czynienia z chromatografią adsorpcyjną
(GSC - gas-solid chromatography),
ciecz osadzona na stałym nośniku w postaci jednorodnego filmu (warstwy), wtedy
mamy do czynienia z chromatografią podziałową (GLC - gas-liquid chromatography).
1
Związki chemiczne z większym powinowactwem do fazy stacjonarnej są selektywnie
zatrzymywane przez fazę nieruchomą i poruszają się wzdłuż kolumny znacznie wolniej.
Związki z mniejszym powinowactwem do fazy stacjonarnej poruszają się wzdłuż kolumny
szybciej i tym samym opuszczają kolumnę, czyli eluują z kolumny, jako pierwsze.
Równowaga podziału pomiędzy fazy ma charakter dynamiczny, czyli cząsteczki substancji
nieustannie przechodzą od fazy ruchomej do stacjonarnej i z powrotem.
Podstawowym parametrem określającym podział substancji X pomiędzy dwie fazy
jest stała podziału K, którą można wyrazić równaniem Nernsta:
cs
(1)
cm
gdzie: cs − oznacza stężenie substancji X w fazie stacjonarnej, cm − oznacza stężenie
K
=
substancji X w fazie ruchomej.
Innym ważnym parametrem jest współczynnik retencji k, który jest miarą czasu,
w jakim substancja X przebywa w fazie stacjonarnej, w stosunku do czasu, w którym
przebywa ona w fazie ruchomej. Określa on, ile razy dłużej dana substancja jest
zatrzymywana przez fazę stacjonarną niż potrzebowałaby na przejście przez kolumnę
z prędkością poruszania się fazy ruchomej. Związki chemiczne charakteryzujące się różnymi
współczynnikami retencji mogą zostać rozdzielone na kolumnie chromatograficznej (Rys. 1).
k
=
liczba moli substancji X w fazie stacjonarnej
liczba moli substancji X w fazie ruchomej
(2)
Efekt rozdziału chromatograficznego jest wykreślany w postaci chromatogramu, który
przedstawia wykres wskazań sygnału uzyskanego w detektorze w funkcji czasu lub w funkcji
objętości fazy ruchomej. Zapis stężenia pojedynczej substancji w funkcji czasu ma postać
krzywej Gaussa i nosi nazwę piku (ang. peak czyli szczyt). Typowy chromatogram
przedstawiony jest na Rys. 2.
Rys. 2. Chromatogram i sposób pomiaru podstawowych wielkości chromatograficznych
2
Możemy określić na nim:
czas retencji tR - czas mierzony od momentu wprowadzenia próbki na kolumnę do
momentu pojawienia się na wyjściu z kolumny maksimum stężenia danego związku
chemicznego czyli maksimum piku
=
tR
L
u
x (1 + k )
(3)
gdzie: L - długość kolumny chromatograficznej, u - średnia, liniowa prędkość przepływu gazu
nośnego, k - współczynnik retencji,
zerowy czas retencji tM (czas „martwy”) - czas przebywania w kolumnie substancji, która
nie ma powinowactwa do fazy stacjonarnej np. metanu; czas zerowy jest równy czasowi
przepływu fazy ruchomej przez kolumnę,
zredukowany czas retencji t’R - jest różnicą pomiędzy czasem retencji a zerowym czasem
retencji
t R′ = t R − t M
(4)
współczynnik retencji k
tR − tM
(5)
tM
szerokość piku mierzoną u podstawy piku w lub szerokość piku mierzoną na określonej
k=
wysokości piku np. w połowie wysokości w1/2h,
liniową prędkość przepływu fazy ruchomej u przez kolumnę można łatwo wyznaczyć
eksperymentalnie poprzez analizę chromatograficzną substancji niezatrzymywanej na
kolumnie np. metanu i zmierzenie czasu przejścia jej przez kolumnę czyli czasu zerowego
(tM).
u =
L
(6)
tM
Wielkość, którą można łatwo wyznaczyć, a która zależy od rodzaju rozdzielanych
substancji i rodzaju fazy ruchomej jest retencja względna ra,s (zwana inaczej względnym
czasem
retencji).
Określa
się
ją
jako
stosunek
retencji
dwóch
substancji
chromatografowanych, z których jedna jest wzorcem (s), a retencja drugiej (a) jest zbliżona
do retencji wzorca:
ra,s = t’Ra / t’Rs = ka/ ks
(7)
Wartość ra,s może być większa lub mniejsza od 1. Im bardziej ra,s jest różne od 1, tym lepiej
dwie substancje rozdzielają się.
Kolejnym ważnym parametrem chromatograficznym jest współczynnik rozdzielania
3
(zwany także współczynnikiem selektywności), który jest miarą rozdzielenia dwóch
sąsiednich pików na chromatogramie, dla których t’R2 > t’R1:
α=
K 2 k 2 t R2 − t M
=
=
K1 k 1 t R1 − t M
(8)
Współczynnik rozdzielania ma zawsze wartość większą od 1.
1.2. Analiza jakościowa
Analiza jakościowa dotyczy identyfikacji sygnałów chromatograficznych odpowiadających
poszczególnym składnikom próbki i opiera się na:
a) wielkościach retencyjnych,
b) fizykochemicznego badania frakcji z zastosowaniem detektorów jakościowych
c) wydzieleniu poszczególnych składników mieszaniny (chromatografia preparatywna)
w celu ustalenia ich struktury innymi metodami (metoda najrzadziej stosowana).
1.2.1. Analiza jakościowa w oparciu o wielkości retencyjne
W trakcie analizy jakościowej opartej na wielkościach retencyjnych porównuje się czas
retencji
piku
identyfikowanej
chromatografowanych
w
substancji
jednakowych
z
czasem
warunkach.
retencji
Badania
zwykle
piku
wzorca,
polegają
na
potwierdzeniu lub wykluczeniu obecności danego związku w analizowanej mieszaninie.
Jeżeli na chromatogramie substancji badanej nie występuje pik o czasie retencji równym
retencji substancji wzorcowej oznacza to iż związek wzorcowy jest nieobecny
w analizowanej mieszaninie. Z kolei jeśli taki sygnał występuje obecność substancji
wzorcowej nie jest przesądzona, gdyż wiele związków należących do różnych klas związków
chemicznych może mieć identyczny lub prawie identyczny czas retencji. Potwierdzeniem
obecności takiego związku wzorcowego w analizowanej mieszaninie jest wykonanie analizy
na innych wypełnieniach kolumn.
Innym dogodnym rozwiązaniem jest korzystanie ze względnych czasów retencji,
opisanych wzorem (7). Względny czas retencji zmienia się tylko ze zmianą temperatury lub
fazy stacjonarnej, ale jest niezależny od wielu warunków eksperymentu. Najkorzystniej gdy
analit i wzorzec występują w tej samej próbce.
Wadą powyższych metod jest to, że niektóre wzorce mogą być trudno dostępne.
4
Często do analizy jakościowej używa się indeksów retencji zwanych indeksami
Kováts’a. Indeks retencji Kováts’a substancji badanej jest równy 100 x liczba atomów węgla
hipotetycznego n-alkanu mającego taki sam zredukowany czas retencji jak badana substancja
(wzór 9 i 10). Zgodnie z konwencją alkany mają w każdej temperaturze i dla każdej fazy
ciekłej indeks równy licznie atomów węgla x 100, a więc np. dla n-pentanu 500, n-oktanu
800. Do określenia indeksów retencji związku wybiera się dwa n-alkany, których czasy
retencji leżą poniżej i powyżej czasu retencji nieznanej substancji. Te alkany dodaje się
następnie do próbki i razem z nią analizuje. Jeżeli analiza alkanów i próbki musi przebiegać
oddzielnie, należy przeprowadzać obydwa badania bezpośrednio jedno po drugim.
Indeks retencji Kováts’a substancji analizowanych w warunkach izotermicznych
oblicza się zgodnie z poniższym równaniem:
RI X = 100 z + 100
log t ' R ( X ) − log t ' R ( z )
log t ' R ( z +1) − log t ' R ( z )
(9)
gdzie :
t’R(x) – zredukowany czas retencji substancji badanej
t’R(z) – zredukowany czas retencji n-alkanu o (z) atomach węgla w łańcuchu
t’R(z+1) – zredukowany czas retencji n-alkanu o (z+1) atomach węgla w łańcuchu
Z wzoru wynika, że t’R(z) < t’R(x) < t’R(z+1)
Indeks retencji w programowanej temperaturze oblicza się stosując poniższe równanie:
LTPRI X = 100 z + 100
t ' R ( X ) −t ' R ( z )
t ' R ( z +1) −t ' R ( z )
(10)
Indeks retencji Kováts’a jest w znacznym stopniu niezależny od warunków analizy
i przez to jest parametrem charakterystycznym dla danego związku w danej temperaturze
i w obecności określonej fazy ciekłej. Podczas wyznaczania indeksów retencji należy
zachować stały przepływ gazu nośnego, niską temperaturę początkową oraz stosować taką
ilość dozowanej próbki, aby pik analitu był symetryczny. W przypadku wyznaczania indeksu
w programowanej temperaturze wielkość ta zależy jedynie od fazy stacjonarnej, a nie zależy
od parametrów kolumny, czasu retencji analitu, zakresu programowania temperatury
i natężenia przepływu gazu nośnego. Warunki chromatograficzne: początkowa i końcowa
temperatura kolumny, wartość liniowego narostu temperatury oraz natężenie przepływu gazu
5
nośnego, powinny być tak dobrane, aby odstępy czasowe pomiędzy kolejnymi n-alkanami
były jednakowe.
Praktyka laboratoryjna wskazuje, że wartości indeksów Kovats’a wyznaczone dla
substancji na fazach niepolarnych różnią się o 1 jednostkę, podczas gdy z zastosowaniem faz
polarnych o 2 - 3 jednostki, a nawet 5 dla faz najbardziej polarnych. Błędy te wynikają
głównie z ograniczonej stabilności faz ciekłych.
W szeregach homologicznych obserwuje się zależność pomiędzy parametrami retencji
i wielkościami takimi jak liczba atomów węgla, liczba grup CH2 i temperatura wrzenia. Jeżeli
wykreśli się zależność logarytmu zredukowanego czasu retencji w funkcji liczby atomów
węgla, to otrzymane proste są charakterystyczne dla każdego szeregu homologicznego
związków analizowanych w warunkach izotermicznych w danej temperaturze i dla danej fazy
ciekłej (Rys. 2). W przypadku analiz w programowanej temperaturze zachodzi prostoliniowa
zależność zredukowanego czasu retencji w funkcji liczby atomów węgla.
Rys. 2. Zależność pomiędzy zredukowanym czasem retencji i liczbą atomów węgla w szeregu
homologicznym.
W sprzyjających warunkach, na podstawie wyznaczonego indeksu substancji badanej,
można przyporządkować nieznany związek do danego szeregu homologicznego, a tym
samym dokonać jego identyfikacji. Pewność wyniku można osiągnąć przez porównanie
uzyskanych wartości retencji z wynikami otrzymanymi na kolumnie o innej polarności.
Wykonując analizę jakościową należy pamiętać, że retencja może zmieniać się nawet
przy małych zmianach warunków analizy. W niektórych przypadkach zmiana ta nie jest
jednakowa dla wszystkich składników próbki i położenie jednych w stosunku do drugich
6
może ulegać zmianie. Analizując nowe próbki trzeba mieć pewność, że wszystkie składniki
poprzednio chromatografowanej próbki zostały usunięte z kolumny. Piki takich substancji
można łatwo rozpoznać, ponieważ są znacznie szersze niż piki sąsiednie. Piki odpowiadające
substancjom, które nie występują w badanej próbce, mogą pochodzić z zanieczyszczeń
układu chromatograficznego lub rozpuszczalnika użytego do sporządzenia roztworu próbki.
W tym ostatnim przypadku należy sprawdzić czystość rozpuszczalnika, analizując jego ilość
odpowiadającą tej, którą wprowadza się do kolumny z próbką.
1.2.2. Analiza jakościowa oparta na fizykochemicznym badaniu frakcji z
zastosowaniem detektorów jakościowych
Połączenie chromatografii gazowej z metodami spektroskopowymi:
a) spektrometrią mas - zestaw GC-MS
b) spektroskopią w podczerwieni IR – zestaw GC-IR
c) absorpcyjną spektroskopią atomową AAS – zestaw GC-AAS,
d) emisyjną spektroskopią atomową AES – zestaw GC-AES
pozwala na identyfikację związków organicznych (GC-MS, GC-IR) i metaloorganicznych
(GC-AAS i GC-AES). Dzięki technikom łączonym uzyskujemy dodatkową informację
stukturalną – np. odpowiednie do danej techniki spektroskopowej widmo substancji badanej.
Najprostszym sposobem identyfikacji substancji jest zastosowanie metody połączenia
chromatografii
gazowej
z
spektrometrią mas
(GC-MS).
Identyfikacja składników
analizowanej mieszaniny odbywa się wówczas nie tylko na podstawie czasów retencji, ale też
na podstawie widm mas analizowanych substancji. Należy zaznaczyć, iż próbka nie powinna
zawierać izomerów, które mają często zbliżone lub identyczne widma mas.
2. Część eksperymentalna
2.1. Cel
Celem ćwiczenia jest nabycie umiejętności obsługi chromatografu gazowego oraz wykonanie
analizy jakościowej za pomocą chromatografii gazowej.
2.2. Wykonanie
2.2.1. Analiza chromatograficzna w warunkach izotermicznych
Chromatograf GC z detektorem FID, Kolumna chromatograficzna RTX-5 30 m, 0,25 mm
średnica wewnętrzna, 0,25 µm grubość fazy stacjonarnej,
Temperatura kolumny: 120°C, Temperatura dozownika: 220°C, Temperatura detektora:
7
220°C, Dzielnik przepływu: 1:20, Gaz nośny: argon, stały przepływ 1 mL/min, Powietrze:
350 kPa Wodór: 35 kPa, Czas analizy: 11 min.
2.2.2. Analiza chromatograficzna w programie temperaturowym
Chromatograf GC z detektorem FID, Kolumna chromatograficzna RTX-5 30 m, 0,25 mm
średnica wewnętrzna, 0,25 µm grubość fazy stacjonarnej,
Program temperaturowy: 60 - 126°C, narost 3°C/min, Temperatura dozownika: 220°C,
Temperatura detektora: 220°C, Dzielnik przepływu: 1:20, Gaz nośny: argon, stały przepływ 1
mL/min, Powietrze: 350 kPa, Wodór: 35 kPa, Czas analizy: 22 min.
2.2.3. Ekstrakcja olejku eterycznego ze skórek owoców cytrusowych
Ekstrahować około 0,1 g części pomarańczowej skórki (nie albedo) za pomocą 3 mL heksanu
mieszając przez około 5 min i pozostawić na około 5 min a następnie zdekantować. Jeżeli
będzie to konieczne to zatężyć ekstrakt w strumieniu azotu.
2.2.4. Analiza jakościowa poprzez porównanie czasu retencji analitu z czasem retencji
wzorca wyznaczonych w tych samych warunkach chromatograficznych
Należy wykonać analizę próbki badanej oraz analizę roztworu wzorcowego. Odczytać z
chromatogramów i porównać czasy retencji. Zidentyfikować analit.
2.2.5. Wyznaczenie indeksów Kováts’a w warunkach programowanej temperatury
Należy wykonać analizę próbki badanej oraz analizę roztworu wzorcowego: mieszaniny 5-ciu
n-alkanów od n-C8 do n-C12 i wyznaczyć indeksy. Wykreślić krzywą zależności pomiędzy
zredukowanymi czasami retencji i liczbą atomów węgla w szeregu homologicznym nalkanów na podstawie analizy roztworu wzorcowego:
t R′ = f (C )
2.2.6. Wyznaczenie indeksów Kováts’a w warunkach izotermicznych
Należy wykonać analizę próbki badanej oraz analizę roztworu wzorcowego: mieszaniny 5-ciu
n-alkanów od n-C8 do n-C12 i wyznaczyć indeksy. Wykreślić krzywą zależności pomiędzy
logarytmami zredukowanych czasów retencji i liczbą atomów węgla w szeregu
homologicznym n-alkanów na podstawie analizy roztworu wzorcowego:
log t R′ = f (C )
8
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny
•
roztwór wzorcowy mieszaniny n-alkanów:
•
roztwór wzorcowy limonenu,
•
roztwór wzorcowy α-pinenu,
•
chlorek metylenu do mycia strzykawki,
•
strzykawka do GC 10 µL - 2 szt,
•
zlewka 10 mL – 4 szt
•
naczynko zakręcane 1,5 mL – 4 szt
•
pipeta 5 mL, pompka do pipet,
•
heksan 50 mL
•
nóż
n-C8, n-C9, n-C10, n-C11, n-C12,
Literatura
1. Walenty Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej PWN, W-wa, 1996.
2. Ryszard Kocjan (red.). Chemia analityczna. Podręcznik dla studentów. Tom 2. PZWL, W-wa, 2000.
3. Witkiewicz Zygfryd, Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa, 2005.
9