Scientific Review in Pharmacy - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transkrypt

copyright © 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073
Farmaceutyczny
www.fpn.info.pl
Cena 24,50 zł
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH
IC Value - Current 3.66
MNiSW 4
ROK VI (X)
Nr 5/2009 (52)
Scientific Review in Pharmacy
Zastosowanie epigenetyki
w terapii chorób człowieka
Wpływ suszonego rozmarynu
na peroksydację lipidów
wybranych olejów jadalnych0
Chlorowcowe i siarkowe pochodne
naturalnych zasad purynowych
o aktywności przeciwnowotworowej
i immunosupresyjnej
Chromatograficzny rozdział i identyfikacja
taurynowych połączeń
wybranych kwasów żółciowych
w ich mieszaninie 0
Charakterystyka bakterii rodzaju
Desulfovibrio z uwzględnieniem
ich potencjalnie patogennego wpływu 0
na organizm człowieka i zwierząt
oraz możliwości leczenia 0zakażeń
wywołanych przez te mikroorganizmy
Zawartość selenu
w roślinnych surowcach leczniczych
i jego relacje
z wybranymi pierwiastkami
Szlak RANKL/RANK/OPG w patogenezie chorób
– nowe możliwości terapeutyczne
Wrażliwość radiacyjna mikroorganizmów
ISSN 1425-5073
Białko opiekuńcze GRP94
i jego rola w terapii nowotworów
1
Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
Farmaceutyczny
Adres redakcji / Editorial Adress:
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
ul. Jedności 8 , 41-200 Sosnowiec, Polska / Poland
Tel. 500 722 219
Fax. 032/364-11-34
Mail: [email protected]
Index Copernicus 3,66
MNiSW 4
Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board
Przewodniczący / Head:
Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec
Członkowie / Members:
Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok
Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja
Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków
Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa
Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź
Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania
Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja
Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin
Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań
Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja
Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia
Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria
Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków
Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin
Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec
Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice
Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia
Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa
Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok
Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław
Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin
Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia
Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja
Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk
Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia
Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary:
Dr n. med. Robert D. Wojtyczka
Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board:
Dr n. farm. Paweł Olczyk
Dr n. biol. Małgorzata Kępa
Mgr Anna Szeremeta
Mgr Agnieszka Jura – Półtorak
Dr n. hum. Anna Kierczak
Wydawca / Publisher:
Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego
Adres Wydawcy / Publisher Adress:
ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Poland
tel. (0-33) 817-28-79 fax (0-33) 817-36-31
Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.)
Marketing Manager:
Opracowanie graficzne / Graphics:
Agnieszka Romańska
Robert Cyganik
[email protected]
Nakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copies
Skład / Technical Editor:
Jerzy Partyka
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.
Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education.
Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach
z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania
nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą
wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja
nie odpowiada.
All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright
laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the
rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints
are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for
advertisements and reader letters.
Zdj. Zygmunt Wieczorek
Szanowni Państwo,
Koleżanki i Koledzy,
Drodzy Czytelnicy
Zgodnie z wcześniejszą zapowiedzią, przedstawiam garść informacji na temat Konferencji Europejskiego Stowarzyszenia Wydziałów
Farmaceutycznych (EAFP), która odbyła się w Norwegii, w dniach
18 – 20 czerwca br. Konferencja, pod nazwą New issues in postgraduate / post-registration pharmacy education, dotycząca wszystkich
aspektów szkolenia podyplomowego, jakie realizowane jest na europejskich Wydziałach Farmaceutycznych, zorganizowana została
przez Wydział Farmaceutyczny Uniwersytetu w Oslo, w kooperacji
z EAFP. Po raz pierwszy poświęcono tak wiele uwagi szkoleniu podyplomowemu, bowiem jak dotąd, przedmiotem corocznych Konferencji EAFP były kwestie dotyczące edukacji przeddyplomowej
(Bologna first and second cycle), a szczególnie – nowych trendów
w kształceniu przyszłych farmaceutów. Dotychczasowe skupianie
uwagi na programie i sposobie realizacji studiów na kierunku farmacja uzasadnione było świadomością zmieniającej się roli współczesnego farmaceuty w systemie ochrony zdrowia, tj. aktywnym
uczestnictwem w opiece nad pacjentem poprzez indywidualne podejście do chorego, identyfikację jego problemów lekowych czy
ocenę bezpieczeństwa i skuteczności farmakoterapii.
Nieustanny rozwój nauk farmaceutycznych wymaga jednak
dalszej edukacji i specjalizacji, wykraczając poza zakres nauczania
przeddyplomowego.
Stąd tematyka tegorocznej Konferencji, nawiązującej do studiów III stopnia, wyrazem których w projekcie bolońskim są studia
doktoranckie (Bologna third cycle), lecz także – do specjalizacji
czy szkolenia ciągłego farmaceutów, określanego jako continuing education, continuing professional development, czy life long
learning. Podczas obrad zwrócono także uwagę na znaczenie
szkolenia podyplomowego w aspekcie potrzeb przemysłu farmaceutycznego.
Polskimi doświadczeniami w zakresie przedstawionej tematyki dzielili się przedstawiciele czterech Wydziałów Farmaceutycznych, tj. Prof. Renata Jachowicz i Prof. Marek Cegła
z Wydziału Farmaceutycznego w Krakowie, Prof. Kazimierz
Głowniak z Wydziału Farmaceutycznego w Lublinie, Prof. Franciszek Główka z Wydziału Farmaceutycznego w Poznaniu i Prof.
Krystyna Olczyk z Wydziału Farmaceutycznego w Sosnowcu.
Ważnym i cennym dla Polskiej Farmacji wydarzeniem podczas
tegorocznej Konferencji był wybór Pani Prof. Renaty Jachowicz do
Komitetu Wykonawczego EAFP. Co ważne, Pani Profesor uzyskała największą ilość głosów. Nieskromnie dodam, że nasza czwór-
ka miała w tym swój udział. Aktywne uczestnictwo Pani Profesor
w corocznych Konferencjach – od początku ich zaistnienia, a także
wysoka pozycja w międzynarodowych gremiach farmaceutycznych, przyczyniły się do tego sukcesu. Serdecznie gratulujemy!
Szanowni Państwo. Mój pobyt na powyższej Konferencji stworzył także sposobność przedstawienia Farmaceutycznego Przeglądu
Naukowego uczestnikom tego Przedsięwzięcia. Wręczyłam Pani Profesor Karen Marie Ulshagen, Przewodniczącej Komitetu Organizacyjnego i Członkowi Komitetu Naukowego tegorocznej Konferencji,
poprzedni numer naszego czasopisma, zawierający oryginalny Komunikat na temat nadchodzącego spotkania EAFP. Ponadto, uzyskałam
zgodę trojga Profesorów na Ich dołączenie do naszej Konsultacyjnej
Rady Naukowej. Są nimi Prof. Filiz Hincal z Uniwersytetu Hacettepe w Ankarze i wieloletni Członek Komitetu Wykonawczego EAFP,
Prof. Benito Del Castillo Garcia – były Dziekan Wydziału Farmaceutycznego w Madrycie i poprzedni Prezydent EAFP, Prof. Vitalis Briedis – dziekan Wydziału Farmaceutycznego w Kownie.
Dążąc konsekwentnie do nadania naszemu czasopismu międzynarodowego charakteru, zamieszczamy już w niniejszym numerze,
opracowany przez Kolegium Redakcyjne Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego, anglojęzyczny Regulamin publikowania prac,
a ponadto – zredagowaną w dwóch wersjach językowych treść
tzw. stopki redakcyjnej oraz tytuły zawartych w numerze prac. Zachęcam Państwa do nadsyłania publikacji w wersji anglojęzycznej. Może powolutku uda nam się wspiąć na wyższy szczebelek
w „drabinie” listy rankingowej MNiSW oraz IC? A może pomyślimy i o innych punktach? To przecież zależy tylko od nas!
Szanowni Państwo, Drodzy Autorzy i Czytelnicy. Zapraszam
serdecznie do lektury bieżącego numeru Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego. W numerze tym, obok naszych publikacji, znalazł się kolejny artykuł, zatytułowany A week worth gold!, rekomendowany przez Komitet Naukowy i Organizacyjny FIP, a to
w związku z nadchodzącym Kongresem w Stambule, w dniach
3 – 8 września br.
A tymczasem, życzę cudownych wakacji, pełni relaksu i wypoczynku.
W chwilach wolnych od zajęć polecam Farmaceutyczny Przegląd Naukowy!
Redaktor Naczelny
Prof. dr hab. n. med. Krystyna Olczyk
Farmaceutyczny
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
Index Copernicus 3,66
MNiSW 4
Nr 5 / 2009
Spis treści
Zastosowanie epigenetyki w terapii chorób człowieka0000000000000000000000000000000000000000000 7
Epigenetic therapy in human diseases
Wpływ suszonego rozmarynu na peroksydację lipidów
wybranych olejów jadalnych00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 11
The effect of dried rosemary on lipids peroxydationof selected edible oils
Chlorowcowe i siarkowe pochodne naturalnych zasad purynowych
o aktywności przeciwnowotworowej i immunosupresyjnej0 000000000000000000000000000000000000 15
Chloro and thiopurine derivatives with anticancer 0
and immunosuppressive activity0
taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych
w ich mieszaninie 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 21
Chromatographic separation and identification
of taurine-conjugates of selected bile acids in their mixture0
Charakterystyka bakterii rodzaju Desulfovibrio 0
z uwzględnieniem ich potencjalnie patogennego wpływu 0
na organizm człowieka i zwierząt oraz możliwości leczenia 0
zakażeń wywołanych przez te mikroorganizmy000000000000000000000000000000000000000000 0
Characteristics of the Desulfovibrio genus with regard to its potential
pathogenic influence on human and animal body, and the possible
treatment of infections caused by these microorganisms
26
Zawartość selenu w roślinnych surowcach leczniczych
i jego relacje z wybranymi pierwiastkami0 00000000000000000000000000000000000000000000000000 33
Content of selenium in medicinal plant raw materials
and its relation with selected elements
– nowe możliwości terapeutyczne0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 37
The RANKL/RANK/OPG pathway in pathogenesis of diseases 0
– new therapeutic possibilities
Wrażliwość radiacyjna mikroorganizmów000000000000000000000000000000000000000000000000000 43
Radiosensitivity of microorganisms
Białko opiekuńcze GRP94 i jego rola w terapii nowotworów0
Chaperon GRP94 and its role in anti-cancer therapy
47
Wydawnictwo Kwieciński poleca
RECEPTURA
DLA LEKARZY, STUDENTÓW MEDYCYNY I STOMATOLOGII
Pod redakcją
Przemysława Nowaka
Zbigniewa S. Hermana
Ryszarda Brusa
2005
Farm Przegl Nauk, 2009,5, 7-10
Zastosowanie epigenetyki w terapii chorób człowieka
Epigenetic therapy in human diseases
Marta Palacz
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej
Kierownik Katedry: Prof. dr hab. J. Kowalski
Streszczenie: Epigenetyka to nauka zajmująca się wyjaśnieniem fenomenu zmian fenotypowych niezależnych
od zmian na poziomie genu. Mechanizmy epigenetyczne
związane są przede wszystkim z metylacją DNA oraz acetylacją histonów prowadzącą do zmian w strukturze chromatyny. Dziedziczne zmiany spowodowane modyfikacjami epigenetycznymi mogą prowadzić do rozwoju wielu
chorób, między innymi do transformacji nowotworowej,
chorób psychicznych oraz chorób związanych z układem
krążenia, stąd zainteresowanie farmakologii tymi mechanizmami i poszukiwanie leków mogących na nie wpływać. Pierwsza grupa leków to inhibitory metylotransferaz
DNA, natomiast drugą stanowią inhibitory deacetylaz histonów. Obie wymienione grupy leków mają potencjalne
znaczenie w leczeniu chorób nowotworowych.
Abstract: The science of epigenetics describes mechanisms of phenotypic changes not connected with changes
in DNA sequences. Epigenetic mechanisms include DNA
methylation as well as chromatin and histone modification. Inherited epigenetic changes are responsible for various diseases development. Therefore pharmacology is interested in such kind of mechanisms and looking for the
drugs that can influence them. The first group of the drugs
constitute methylotransferases (DNMTs) inhibitors and
the second one histone acetlotransferases ( HATs) inhibitors. Both mentioned groups can have the potential meaning for the treatment of tumor diseases.
Key words: epigenetics, DNA methylation, histone
acetylation
Słowa kluczowe: epigenetyka, metylacja DNA, acetylacja histonów
In the past few years a theory has arisen that genetic
lessons alone can not explain the molecular mechanism of
many diseases development. Epigenetic processes together
with genetic one (changes in DNA sequence) - allow to a
better understanding of malignant mechanisms [1,2].
Epigenetics try to answer the question why there are
changes in phenotype when the genotype is identical. As opposed to sequence changes, epigenetic alternations are the
result of endogenous mechanisms connected with genome
information reading. Epigenetic changes which are inherited
can be switched off during natural cell processes and / or
by environmental factors. Epigenetics refer to the statement
that every cell can inherit “something” more than DNA.
A special kind of material such as Barr body or tumor tissues
are demanded to observe and define epigenetic mechanisms
[1,2,3].
Two basic epigenetic mechanisms can be distinguish:
DNA methylation and histone acethylation, which both lead
to the chromatin structure modifications [2].
DNA methylation
DNA methylation is essential to correct gene expression in mammalian cell. The mechanism of DNA methylation requires CpG sites and leads to converting cytosine into
5-methylcytosine. Methyl group present in the gene promot-
er inhibits transcription factors binding and in consequence
DNA transcription. In practice it means the lack of gene
product, the promoter of which has been methylated. This
methylation mechanism is currently use in genes silencing
processes necessary for organism development and cell differentiation. The same mechanism is responsible for gene
imprinting [4].
CpG dinucleotides are unmethylated in 5’ regulatory
area, but CpG islands in introns and repetitive DNA sequences are often methylated. In case of the lack of methylation in human genome, highly repetitive sequences are
susceptible to mutations [5].
The enzymes responsible for methylation are DNA
methylotransferases (DNMTs) [6]. One can distinguish 4
human DNMTs ( DNMT1 – methylation keeping; DNMT2,
DNMT3a, DNMT3b – de novo methylation). Changes in the
activity of DNMTs can be the cause of certain diseases such
as atheriosclerosis [4], schizophrenia [9] and cancer [7].
Recently scientists took into special consideration the
role of CpG island hypermathylation in the colon cancer
development. It is well known fact that MLH1 promoter
hypermethylation can cause colon carcinogenesis. On the
other hand administration of inhibitors of DNA methylation
significantly reduced tumor progression [7].
We can point at the three subgroups of DNMTs inhibitors (table I). The first one constitute nucleoside analogues,
7
Farm Przegl Nauk, 2009,5
Table I. Characteristics of DNMTs inhibitors
DRUG
AC – 5 azacitidine
5-Aza-2’deoxycytidine
5-fluoro-2’-deoxycytidine
5,6-dihydro-5-azacytidine
Hydralazine
procainamide
EGCG
Psammaplin A
MD88
MG98
RG108
DAC - Decytabine
Zebularine
USE
MDS – Myelodysplastic syndrome
AML – Myeloid leukemia
Haematological malignancies, cervical, non-small-cell lung
cancer
Cancer
Ovarian cancer and lymphomas
Cervical cancer
Cancer
Cancer
Cancer
Cancer
Advanced/metastatic solid tumours
Cancer
MDS Myelodysplastic syndrome
AML Myeloid leukemia
Urinary bladder cancer
DEVELOPMENT PHASE
Phase II
Phase I, II, III
Phase I
Phase I, II
Phase I
Preclinical
Preclinical
Preclinical
Preclinical
Phase I
Preclinical
Phase II
preclinical
* The basis of the source: Jacob Peedicayil, Epigenetic therapy - a new development in pharmacology; Indian J Med Res 123, January 2006,
pp 17-24.
especially cytosine. Such a DNMTs inhibitors are phosphorylated and then incorporated instead of cytosine into DNA
during replication. Nucleoside analogues of cytosine are
decitabine and 5- azacytidine. The last mentioned substance
under the trade name of Vidaza is already use as a drug in
myelodysplastic syndrome treatment [8]. A large limitation
in using decitabine and 5- azacytidine as a drugs is necessity
of parenteral administration as well as their myelotoxicity
resulting in cytopenia. Moreover their mechanism of action
depends on concentration and high therapeutical doses are
needed to induce cytotoxicity effect. The new discovered
DNMTs inhibitor, zebularine is less toxic and orally administered drug, which indicates highest stability as opposed to
5 -azacytidine [9,10,11].
Searching for nonmyelotoxic cytosine analogues has resulted in discovery of the second group of DNMTs inhibitors: non-nucleoside inhibitors. The members of this group
are drugs such as procainamide, procaine or hydralazine
[3,8,9].
To the third group of DNMTs inhibitors belong antisense
oligonucleotides. Oligonucletides are short nucleotide sequences complementary to mRNAs, which gives the possibility of hybridization with them and in consequence inhibits translation. [3, 13].
As mention before DNMTs are also used in schizophrenia treatment. DNMT inhibitor doxorubicin can change the
expression level of reelin and GAD67 – enzyme responsible
for GABA synthesis. [8] As all three above mentioned DNMTs inhibitors groups have many side effects, an attempt to
find the other way of DNMTs inhibition in human cell was
made.
Small interfering RNAs, noncoding sequences, can also
apply to for gene expression. RNAs takes part in heterochromatin formation and is responsible for siRNA rise from
dsRNA. This process, also known as posttranscriptional silencing, can cause transcription repression. Mutations in the
structure of siRNA lead to dysfunction in chromosom segregation and centromeric heterochromatic instability. siRNA is
8
responsible for heterochromatin region – telomeres. siRNAs
are responsible for few epigenetically silenced genes and are
in the Phase II of clinical trials in the effectiveness in cancer therapy. We can distinguish DNMT1ASO for DNMT1
[2,11,12,13,14].
Interestingly DNMTs inhibitors are unexpected properties of antiarrhytmic. They can also stop methylation of cancer cell what gives potential usefulness in cancer therapy.
EGCG - main polyphenol found in green tea reduces methylation activity is at present in phase I of clinical trials [11].
It worth to mention about psammaplins from marine sponge
Pseudoceratina pupurea which has shown to inhibit both
DNMT and histone deacetylase activity [8,14] .
HISTONE MODYFICATION:
The second epigenetic mechanism connected with chromatin structure alterations is histone modifications[15].
Human genetic material exists as a nucleoprotein complex – chromatin. Chromatin is built of fundamental units
– nucleosomes. Nucleosom is the first level of chromatin
structural organization. Each nucleosom includes histone
octamer (core histones H2A, H2B, H3 and H4 which form
dimmers) surrounded by 147 bp of DNA [14,15].
Wide variety of postranslational modifications of histones include lysine acetylation, lysine and arginine methylation, serine and threonine phosphorylation, lysine ubiquitination and sumoylation. Histone modifications may affect chromosome function through two mechanisms. One is
connected with electrostatic charge of the histone and resulting in structural change in histones and their binding to
DNA. The second one assumes that these modifications are
binding sites for protein recognition modules (bromo- and
chromodomains), that recognize acetylated or methylated
lysines [16].
Histones can be modified by specific enzymes. In the last
decade many such kind of enzymes have been found. They
are built of numerous units that together catalyze specific
reactions. Core histones are acetylated by histone acetylotransferases (HATs). The opposite effect – deacetylation
is catalyzed by histone deacetylases (HDACs). One can
distinguish three classes of HDACs. The first one included
HDAC1, HDAC2, HDAC3 and HDAC8- present only in the
nucleus. HDAC4-7, 9 and 10- able to move from cytoplasm
to the nucleus- belong to the second group. The last group of
HDAC is represented by SIRT enzymes [15,16].
HDAC inhibitors
Histone acetylation is natural biological process lead to
transcription activation. Histone acetylotransferase by binding acetyl group to the promoter of the gene, change chromatin structure into more decondensed, what allow interaction
with transcription factors. Acetyl group is eliminated by histone deacetylases (HDACs) before chromatin condensation
and genome silencing. The mechanism of HDAC inhibitors
consist in progress of apoptotic pathways and inhibition of
growth of tumor culture cells.
We can point out four main groups of HDAC inhibitors:
the short-chain fatty acids (valproic acid), hydroxyamic acids (suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA), epoksyketones (trapoxin) and benzamides (table II) [16,17].
SAHA as advanced candidate in cancer therapy. Interestingly, valproic acid (VPA) used in treating epilepsy and
bipolar disorder has become a HDAC inhibitor [17].
VPA is also in clinical trials in myeloid leukemia and
myelodysplastic syndrome treatment.
HDAC inhibitors are also used in neurodegenerative
disease treatment as Huntington’s, Parkinson’s, Alzheimer’s
diseases. Some clinical trials are conducted in ischemic
stroke treatment. HDAC inhibitors as DNA methylotransferase inhibitors are also used in depression, anxiety disorders and schizophrenia treatment. Some last findings, essential for schizophrenia, indicate that the promoter of the gene
reelin contain special sites for DNA methylation, HDAC
and methylotransferase inhibitors. Also GABA synthesis is
connected with optimal methylation [19, 20].
Interestingly, monotherapy of HDAC inhibitors is less
effective than a mixed HDAC inhibitors therapy. Scientist
try to create the mixed HDAC inhibitors with DNA methylotransferase inhibitors therapy. Sodium phenylbutyrate is
combinated with 5AC and VPA is combined with decitabine
in myeloid leukemia treatment [21,22,23].
DNMT together with HDAC inhibitor can stop angiogenesis and further metastasis in cancer development what
was confirm by microarray analyze [24,25].
Epigenetics and environmental factors
If we focus on epigenetic mechanism we shouldn’t forget about environmental factors and their influence on these
processes. There is significant relationship between diet and
malignances development. Some researches apply to Western – type diet and DNA methylation in colon cancer development [7] and antioxidant secure. Diet can influence on
methylation during cancer development. Interesting are food
and nutrients taking part in DNA synthesis and enzymes responsible for that process [4,7].
Diet as environmental factor can influence on epigenetical mechanisms. There is evidence that epigenetic changes,
especially methylation, can be reversible by specific diet.
Summary
Epigenetics describe mechanisms of genes expression
not connected with changes of DNA sequences. Until recently it was obvious that genotype changes lead to phenotypical modifications but a better knowledge of epigenetic
mechanisms has cast an entirely different light on inheritance. Not only do we have genes code, but it is also possible that we have histone code
and chromatin structure code
Table II. Characteristics of HDACs inhibitors
which are essential for gene
expression. There are still
DRUG
USE
DEVELOPMENTAL PHASE
many epigenetic mechanisms
Breast cancer
Trichostatin A
Preclinical
which create a whole specOvarian cancer
trum of possibilities for the
Solid tumours
SAHA
Phase I, II
scientists thus opening up new
leukaemias
ways for development within
Leukaemias
Phase I, II
the field of genetics.
depsipeptide
Melanoma
Preclinical
Epigenetic mechanism deColon cancer
Preclinical
velopment
opened new way
apicidin
Leukaemia
Preclinical
for
drugs
development.
Some
MS-275
Solid tumours
Phase I
of
them
are
in
the
preclinical
CI-994
Solid tumours
Phase I
and clinical drug trials. Most
Trifluoromethyl ketones Cancer
Preclinical
of this trials are connected
a-ketoamides
Cancer
Preclinical
with various types of cancer,
MDS
Phase I
Sodium phenylbutyrate
hematological malignancies
Leukemia
and psychiatric disorders. The
Phase I
VPA
Neuroectodermal tumor cells
Phase II
development of epigenetic
Romidepsin
Myeloid disorders
Phase I
mechanisms in cancer development has opened a new area
Vorinostat
Cutaneous T-cell Lymphoma Phase II
for cancer therapy which tries
* The basis of the source: Jacob Peedicayil, Epigenetic therapy - a new development in pharmacolto use histone deacatylase and
ogy; Indian J Med Res 123, January 2006, pp 17-24.
9
DNA methylotransferase inhibitors [16, 17]. The biggest interest is in enzymes such as HATs, HDACs, DNMTs and
histone methylotransferases [24,25].
Epigenetic therapy is a new way of treatment which will
help to objective diagnose, optymalize doses and picking up
the best pharmacological therapy.
References:
1. Esteller M., Epigenetics in cancer. N Engl J Med 2008;
358:1148-59.
2. David Allis C., Jenuwein T., Reinberg D. : Epigenetics.
Cold Spring Harbor Labolatory Press, New York, 2006.
3. Peedicayil J. : Epigenetic therapy – a new development
in pharmacology. Indian J Med RES 2006; 123: 17-24.
4. Turunen P. M., Aavik E., Seppo Yla-Hertuala. Epigenetics and atheriosclerosis. Biochimica et Biophysica Acta
2009; 3: 1-6
5. Wei Dai i wsp. Methylation Linear Discriminant Analysis ( MLDA) for indentifying differentially methylated
CpG island. BMC Bioinformatics 2008;9:337.
6. Levenson J. M. DNA ( Cytosine -5) Methyltransferase
Inhibitors: A Potential Therapeutic Agent for Schizophrenia. Mol Pharmacology 2007;71: 635-637.
7. Nystrom M., Mutanen M. Diet and epigenetics in colon
cancer. World Journal of Gastroenterology 2009; 21:
257-263.
8. Brueckner B., Lyko F. DNA methyltransferase inhibitors: old and new drugs for an epigenetic cancer therapy.
Trends in Pharmacological Science2004;11: 551-554.
9. Levenson J. M. DNA ( Cytosine -5) Methyltransferase
Inhibitors: A Potential Therapeutic Agent for Schizophrenia. Mol Pharmacology 2007;71: 635-637.
10.Laird W. P. Cancer epigenetics. Human Mol. Genetics
2005; 14: 65-76.
11.Yoo C.B., Cheng J.C., Jones P.A. Zebularine: a new drug
for epigenetic therapy. Biochemical Society Transacions
2004; 32: 910-912.
Adres do korespondencji:
Marta Palacz
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej
ul. Ostrogórska 30
41-200 Sosnowiec
[email protected]
10
12.Altucci L. i wsp: Acute myeloid leukemia: Therapeutic
impact of epigenetic drugs. The International Journal
of Biochemistry & Cell Biology 2005;37: 1752-1762.
13..Robert i wsp: DNMTis required to maintain CpG methylation and aberrant gene silencing in human cancer
cells. Nat. Genet. 2003; 33:61-65.
14. Griffiths E. I wsp. DNA Methylotransferase and Histone
Deacetylase Inhibitors in the Treatment of Myelodysplasic Syndroms. Semin Hematol. 2008; 45: 23-30.
15.Annemieke I wsp: Hisotne deacetylases ( HDACs): characetrisation of the classical HDAC family. Biochem. J.
2003; 370: 737-749.
16. Vasquero, A. et. al. The Constantly Changing Face of Chromatin. Science of Aging Knowledge Environment. 2003;
17. Karagiannis T., Harikrishnan K., El-Osta A. The Epigenetic Modifier, Valproic Acid,
Enhances Radiation
Sensitivity. Epigenetics 2006; 6: 131-137.
18. Mariadason J.M. HDACs and HDAC inhibitors in colon
cancer. Epigenetics 2008; 3:28-37.
19. Peedicayil J. Epigenetic biomarkers in psychiatric disorders. British Journal of Pharmacology 2008; 155:
795-796.
20. Abel T., Zukin S. Epigenetic targets od HDAC inhibition
in neurodegenerative and
psychiatric disorders. Curr
Opin Pharmacol. 2008; 8: 57-64.
21. Lujambio A., Esteller M.: How epiegentics can explain
human metastasis. Cell Cycle2009; 2: 377-382.
22. Hellebrekers D. i wsp. : Identyfication of epigenetically
silenced genes in tumor endothelial cells. Cancer Res
2007;67: 4138-4148.
23. Dinant C., Houtsmuller A., Vermeulen W. Chromatin
strucure and DNA damage repair. Epigenetics & Chromatin 2008; 1.
24.Marks P.A., Jiang X. Histone deacetylase Inhibitors in
Programmmed Cell Death and Cancer Therapy. Cell
Cyckle 2005; 4: 549-551.
25. Dong C. i wsp. DNA Methylation and Atheriosclerosis.
The Journal of Nutrition 2002; 2: 2406- 2409.
Wpływ suszonego rozmarynu na peroksydację lipidów
wybranych olejów jadalnych
The effect of dried rosemary on lipids peroxydation
of selected edible oils
Ewa Kurzeja, Małgorzata Stec,
Katarzyna Pawłowska-Góral, Izabela Maciejewska-Paszek, Monika Pawlik
Katedra i Zakład Żywności i Żywienia,
Kierownik: M. Wardas
Streszczenie:
Oleje roślinne są często wzbogacane substancjami egzogennymi, mającymi na celu zwiększenie ich trwałości
i zapobiegającymi utlenianiu. Ponieważ liczne badania
dowodzą wielu niekorzystnych działań syntetycznych
antyoksydantów, coraz więcej uwagi poświęca się badaniom surowców roślinnych, których składniki wykazują
właściwości przeciwutleniające. Celem pracy była próba
oceny wpływu suszonego ziela rozmarynu na szybkość
starzenia się oleju rzepakowego i słonecznikowego w warunkach przechowywania i w wyniku działania wysokiej
temperatury. Oznaczano wartości czterech parametrów,
będących wskaźnikami świeżości olejów: liczbę kwasową
(LK), liczbę nadtlenkową (LN), liczbę anizydynową (LA)
oraz stężenie dialdehydu malonowego (MDA). Badania
wykazały, że suszony rozmaryn w oleju rzepakowym
i słonecznikowym nasila hydrolizę tłuszczów do wolnych
kwasów tłuszczowych oraz przyspiesza ich utlenianie
do nadtlenków, natomiast hamuje, szczególnie podczas
przechowywania w temperaturze pokojowej oraz podczas
krótkotrwałego ogrzewania, etap peroksydacji, w którym
z nadtlenków powstają aldehydy.
Abstract:
Plant oils are frequntly enriched with exogenous substances, whose aim is to enhance their durability and prevent their oxidation. Since numerous studies reveal many
unfavourable effects of synthetic antioxidants, more and
more attention is focused on plant raw materials, whose
components exhibit antioxidant properties. The aim of the
study was the evaluation of the effect of rosemary dried
herd upon the rate of aging of sunflower and rape oil
in storage conditions and exposure to high temperature.
The velues of four parameters which were the indices of
oils’freshness were determined: acid value (LK), peroxide value (LN), anisidine value (LA) and concentration
of malonic dialdehyde (MDA). Studies showed, that dried
rosemary in rape and sunflower oil intensifies fats hydrolysis to free fatty acids and accalerates their oxidation to
peroxides, whereas it inhibits peroxidation stage, particularly at room temperature, storage and short-term heating,
in which aldehydes are formed from peroxides.
Key worlds: rosemary, lipids peroxidation, edible oils
Słowa kluczowe: rozmaryn, per oksydacja lipidów, oleje
roślinne
Wstęp
Wobec nasilających się w krajach rozwiniętych chorób cywilizacyjnych, takich jak cukrzyca czy miażdżyca
i towarzyszącej im otyłości, zaleca się ograniczenie spożywania węglowodanów i tłuszczów zwierzęcych. Do
przygotowywania potraw powinny być więc stosowane
oleje roślinne. Prozdrowotne właściwości olejów roślinnych wynikają głównie z faktu, że zawierają one nienasycone kwasy tłuszczowe [1]. Kwasy te mogą jednak
ulegać utlenianiu, w wyniku czego maleje ich wartość
odżywcza, a w dodatku powstają szkodliwe nadtlenki, aldehydy, ketony i produkty ich kondensacji [2,3]. Warunki
sprzyjające tym niekorzystnym zmianom to ogrzewanie
olejów, a więc proces smażenia na olejach potraw oraz
nieprawidłowe przechowywanie olejów. Ponadto, pod-
czas smażenia czy duszenia potraw na oleju często dodaje się różnych przypraw, w celu podniesienia walorów
smakowych. Przyprawą taką może być rozmaryn, nadający potrawie charakterystyczny smak i zapach. Działanie
wielu przypraw, w tym również rozmarynu, uznawane
jest za korzystne nie tylko z uwagi na modyfikację smaku
i zapachu, ale również z uwagi na domniemane właściwości antyoksydacyjne [4,5,6]. Istotne wydaje się jednak
badanie czy właściwości te rozmaryn zachowuje w wyższej temperaturze podczas smażenia potraw oraz czy nie
wywiera dodatkowych efektów w odniesieniu do wartości odżywczej i właściwości olejów.
Celem pracy była próba oceny wpływu suszonego ziela rozmarynu na szybkość starzenia się oleju rzepakowego
i słonecznikowego w warunkach przechowywania i w wyniku działania wysokiej temperatury.
11
Materiał i metody
Materiałem badanym były powszechnie dostępne
w handlu, dwa rodzaje jadalnych olejów roślinnych: olej słonecznikowy „Brölio” (rafinowany i wzbogacony witaminą
E) oraz olej rzepakowy „Floriol” (rafinowany, z pierwszego
tłoczenia). W celu oceny wpływu suszonego ziela rozmarynu na peroksydację lipidów w badanych olejach, oznaczenia
przeprowadzono w olejach bez dodatku suchego rozmarynu
oraz z jego dodatkiem. Do badań wykorzystano przyprawę
„Rozmaryn”, firmy Kamis – Przyprawy S.A., którą dodawano w ilości 5g przyprawy na 495g oleju, otrzymując stężenie
1% (w/w). Zarówno oleje użyte w badaniach, jak i przyprawa były w okresie przydatności do spożycia. Oznaczano
liczbę kwasową [7], nadtlenkową [8], anizydynową [9] i stężenie dialdehydu malonowego [10] w olejach po 30 dniach
przechowywania w temperaturze pokojowej bez dostępu
światła oraz w olejach po poddaniu go obróbce termicznej
w temp. 178±2ºC w chwili osiągnięcia tej temperatury, jak i
po 15., 30. i 60. minutach ogrzewania. W olejach bez rozmarynu oznaczenia wykonano również bezpośrednio po otwarciu opakowania.
Wyniki i ich omówienie
Wartości liczby kwasowej, nadtlenkowej i anizydynowej
oznaczonej bezpośrednio po otwarciu opakowań z badanymi olejami nie przekraczały dopuszczalnych norm; niskie
były również wartości stężenia dialdehydu malonowego:
Po otwarciu opakowania
Po 30-dniowym przechowywaniu w
temp. pokojowej
Po osiągnięciu temp. 178 ±2°C
Po 15 minutach ogrzewania w temp.
178 ±2°C
178 ±2°C
178 ±2°C
LK
0,103
± 0,003
0,114
±0,012
0,109
±0,004
0,117
±0,001
0,126
±0,001
0,131
±0,003
Bez dodatku rozmarynu
LN
LA
MDA
2,15
1,92
0,43
± 0,103
± 0,064
± 0,016
3,24
2,23
0,65
±0,099
±0,035
±0,013
4,44
4,16
5,66
±0,007
±0,064
±0,306
3,27
10,29
13,74
±0,141
±0,021
±0,322
2,91
14,89
13,95
±0,177
±0,092
±0,777
8,40
32,35
20,09
±0,049
±0,495
±0,133
Tabela I. Średnie wartości liczby kwasowej (LK),
w oleju rzepakowym
Po otwarciu opakowania
Po 30-dniowym przechowywaniu w
temp. pokojowej
Po osiągnięciu temp. 178 ±2°C
178 ±2°C
178 ±2°C
178 ±2°C
LK
0,160
±0,005
0,163
±0,004
0,164
±0,004
0,204
±0,005
0,181
±0,004
0,192
±0,007
0,43 [μmol/dm3] dla oleju rzepakowego (Tabela I) i 0,67
[μmol/dm3] dla oleju słonecznikowego (Tabela II).
30-dniowe przechowywanie w temperaturze pokojowej
spowodowało niewielki wzrost liczby kwasowej zarówno
w olejach z dodatkiem, jak i bez dodatku rozmarynu. Podgrzewanie do temperatury 178±2°C i dalsze ogrzewanie
przez 15, 30 i 60 minut powodowało dalszy, niewielki wzrost
wartości LK. Zaobserwowano, że wartości liczby kwasowej
dla oleju rzepakowego (Tabela I) we wszystkich wariantach
oznaczeń były niższe niż dla oleju słonecznikowego (Tabela
II), a dodatek rozmarynu do obu badanych olejów nieznacznie ją zwiększał. W żadnym przypadku jednak nie została
przekroczona wartość 0,4, uznana za normę LK dla olejów
rafinowanych.
Podczas 30-dniowego przechowywania badanych olejów w temperaturze pokojowej wzrosła wartość liczby
nadtlenkowej. Dla oleju słonecznikowego bez dodatku rozmarynu LN wynosiła 9,125 i była większa niż LN dla tego
samego oleju z dodatkiem rozmarynu (Tabela II). Dla oleju rzepakowego bez dodatku rozmarynu liczba ta wynosiła 3,24 a dla oleju z dodatkiem rozmarynu 6,79 (Tabela I).
Różnice wartości LN po 30 dniach przechowywania olejów
bez dodatku rozmarynu były większe dla oleju słonecznikowego, niż rzepakowego. W wyniku ogrzania do temperatury 178±2°C olejów z dodatkiem i bez dodatku przyprawy
liczba nadtlenkowa dla oleju rzepakowego wzrastała, a dla
oleju słonecznikowego zmniejszała się. Ogrzewanie 15, 30
i 60 minut oleju słonecznikowego zarówno z dodatkiem, jak
i bez dodatku przyprawy spowodowało spadek wartości LN
LK
0,156
±0,008
0,153
±0,004
0,142
±0,004
0,159
±0,004
0,167
±0,008
Z dodatkiem rozmarynu
LN
LA
6,79
±0,141
6,82
±0,092
6,75
±0,042
9,55
±0,163
16,32
±0,057
1,65
±0,028
3,5
±0,141
9,48
±0,042
13,23
±0,064
47,02
±0,141
MDA
0,42
±0,019
3,48
±0,118
10,19
±0,048
10,68
±0,259
14,49
±0,117
nadtlenkowej (LN), anizydynowej (LA) oraz stężenia MDA [μmol/dm3]
Bez dodatku rozmarynu
LN
LA
2,43
2,32
±0,035
±0,099
9,12
2,73
±0,021
±0,040
7,69
9,37
±0,078
±0,471
2,67
37,05
±0,057
±0,213
2,76
45,15
±0,049
±0,216
2,74
65,90
±0,184
±0,283
MDA
0,67
±0,013
0,89
±0,009
1,40
±0,042
1,84
±0,045
1,95
±0,076
3,11
±0,077
LK
0,208
±0,004
0,212
±0,001
0,213
±0,007
0,215
±0,004
0,257
±0,004
Z dodatkiem rozmarynu
LN
LA
8,85
±0,205
5,04
±0,460
3,12
±0,240
3,23
±0,035
3,94
±0,156
3,20
±0,141
21,33
±0,424
56,55
±0,495
81,85
±0,495
97,65
±0,636
MDA
0,92
±0,05
1,68
±0,032
1,45
±0,032
1,68
±0,048
3,47
±0,059
Tabela II. Średnie wartości liczby kwasowej (LK), nadtlenkowej (LN), anizydynowej (LA) oraz stężenia MDA [μmol/dm3]
w oleju słonecznikowym
12
wraz z wydłużaniem się czasu ogrzewania. Dla oleju rzepakowego z dodatkiem rozmarynu już po 15 minutach ogrzewania LN wzrastała, osiągając maksymalną wartość 16,32
po 60-minutowym ogrzewaniu (Tabela I). W oleju rzepakowym bez rozmarynu znaczny wzrost wartości LN nastąpił
dopiero po ogrzewaniu przez 60 minut.
W wyniku 30-dniowego przechowywania olejów w temperaturze pokojowej, nastąpił bardzo niewielki wzrost liczby anizydynowej w każdej z próbek oleju słonecznikowego oraz w oleju rzepakowym bez dodatku rozmarynu. Dla
oleju rzepakowego z dodatkiem rozmarynu, LA była niższa
w porównaniu z olejem bez dodatku. W wyniku ogrzania
oleju rzepakowego do temperatury 178±2°C, wartość liczby
anizydynowej wzrosła nieznacznie w porównaniu z olejem
nieogrzewanym, zarówno w oleju bez dodatku, jak i z dodatkiem rozmarynu. Dla oleju z dodatkiem przyprawy wartość
LA była jednak nieco niższa. Podobną zależność zaobserwowano po 15 i 30 minutach ogrzewania, kiedy to dodatek
rozmarynu powodował zmniejszenie liczby anizydynowej.
Najwyższe wartości LA zaobserwowano po 60 minutach
ogrzewania, wyższe jednak dla oleju rzepakowego z rozmarynem niż dla tego samego oleju bez dodatku przyprawy
(Tabela I). W przypadku oleju słonecznikowego zależność
wartości liczby anizydynowej w miarę wydłużania czasu
ogrzewania wzrastała. Taką tendencję wykazywał zarówno
olej słonecznikowy bez, jak i z dodatkiem rozmarynu. Od
momentu osiągnięcia przez oleje temperatury 178±2°C do
końca ogrzewania, wartość LA dla oleju słonecznikowego bez
dodatków wahała się w granicach od 9,37 do 65,9, natomiast
dla oleju z dodatkiem przyprawy od 21,33 do 97,65 (Tabela
II). Liczby te były dużo wyższe w porównaniu z oznaczeniami
dla oleju rzepakowego w tych samych punktach pomiarowych
i przekroczyły swoją dopuszczalną normę wartości LA.
W wyniku miesięcznego przechowywania w temperaturze pokojowej oleju rzepakowego bez dodatku przyprawy,
stężenie MDA uległo niewielkiemu wzrostowi, natomiast
w oleju z dodatkiem przyprawy było zbliżone do stężenia
po otwarciu opakowania. W przypadku oleju słonecznikowego przechowywanie spowodowało niewielki wzrost
stężenia MDA w oleju bez dodatku i z dodatkiem rozmarynu. Ogrzanie do temp. 178±2°C i dalsze ogrzewanie
w tej temperaturze oleju rzepakowego w spowodowało wzrost
stężenia diladehydu malonowego w oleju bez i z dodatkiem
rozmarynu, w porównaniu z olejami nieogrzewanymi. Wartość stężenia była wówczas mniejsza dla oleju wzbogacanego rozmarynem i wynosiła 3,47 [μmol/dm3], podczas gdy
w oleju bez dodatku stężenie wzrosło do wartości 5,66 [μmol
/dm3] (Tabela I). Po 15, 30 i 60 minutach ogrzewania
w tej temperaturze nastąpił znaczny wzrost stężenia MDA
w obu próbkach oleju rzepakowego: do wartości 20,09
[μmol/dm3] dla oleju bez dodatku oraz 14,49 [μmol/dm3] dla
oleju z dodatkiem przyprawy (Tabela I). Wartości stężenia
dialdehydu malonowego były niższe dla oleju z dodatkiem
rozmarynu. Wydłużanie czasu ogrzewania oleju słonecznikowego, powodowało stopniowy wzrost stężenia MDA dla
oleju bez dodatku rozmarynu, które przyjmowało wartości
1,40 [μmol/dm3], po podgrzaniu do temperatury 178±2°C
i 3,11 [μmol/dm3] po 60 minutach ogrzewania (Tabela II).
W przypadku oleju z rozmarynem ogrzanie spowodowało
wzrost stężenia MDA do wartości 1,68 [μmol/dm3], a 60
-minutowe ogrzewanie do 3,47 [μmol/dm3] (Tabela II). Po
15 i 30 minutach ogrzewania wartości stężenia MDA były
niższe dla oleju z dodatkiem rozmarynu, niż dla oleju bez
dodatku przyprawy.
Dyskusja
Uzyskane wyniki potwierdziły powszechną opinię dotyczącą faktu, iż dostęp powietrza do olejów (otwarty pojemnik) oraz światło pogarszają jakość olejów, ponieważ nasila
się hydroliza zawartych w nich tłuszczów, proces utleniania kwasów tłuszczowych oraz powstawanie nadtlenków,
a w efekcie również powstawanie aldehydów, w tym dialdehydu malonowego (MDA). Również proces ogrzewania do
temperatury 178±2°C sprzyjał zachodzeniu niekorzystnych
zmian. Zmiany te nasilały się w miarę wydłużania czasu
ogrzewania. Najdłuższy przyjęty w pracy czas ogrzewania
wynosił 60 minut. W przypadku smażenia potraw czas ten
nie jest aż tak długi, lecz dla przeprowadzonego w niniejszej
pracy eksperymentu z ogrzewaniem olejów, tak długi czas
był niezbędny, w celu ewidentnego wykazania wpływu długości czasu ogrzewania na zachodzące zmiany. Zastosowane
w przeprowadzonym eksperymencie warunki ogrzewania,
tj. długość ogrzewania i temperatura, pozwoliły ustalić, że
w oleju rzepakowym zachodzące niekorzystne zmiany są
nieco łagodniejsze niż w oleju słonecznikowym, stąd sugestia, że z dwu przebadanych olejów do smażenia bardziej
przydatny jest olej rzepakowy niż słonecznikowy. Olej słonecznikowy powinien być zatem spożywany na surowo,
jako dodatek do sałatek, sosów, czy sporządzania majonezów. Rozmaryn w obu olejach nasilał hydrolizę, dowodem
czego był niewielki wzrost liczby kwasowej. Niewielki
wzrost liczby kwasowej nie ujmuje wartości olejom pod
warunkiem, że nie będą one narażone na proces peroksydacji kwasów tłuszczowych. Fakt, iż rozmaryn, nasilając
w niewielkim stopniu hydrolizę tłuszczów, przyspieszał powstawanie nadtlenków (w różnym nasileniu w stosunku do
badanych olejów), należy uznać za niekorzystny. Być może
wynikało to ze stosunkowo wysokiego stężenia rozmarynu
w badanych olejach - nie wykluczone, że w praktyce kulinarnej stężenie to jest nieco niższe. Za niezwykle pozytywny efekt działania rozmarynu należy uznać fakt, że mimo
stymulowania procesu powstawania nadtlenków, hamował
proces powstawania aldehydów, dowodem czego była zawartość oznaczonego dialdehydu malonowego. Zahamowanie
powstawania aldehydów, a zapewne i ketonów wskazuje, iż
w olejach tych prawdopodobnie nie dochodzi do tworzenia
szkodliwych dla zdrowia produktów polimeryzacji. Dlatego
też zarejestrowane w niniejszej pracy efekty działania rozmarynu podczas ogrzewania olejów, należy uznać za korzystne.
Wnioski
1. Rozmaryn w oleju rzepakowym i słonecznikowym nieznacznie nasila hydrolizę tłuszczów do wolnych kwasów tłuszczowych oraz przyspiesza ich utlenianie do
nadtlenków, hamuje natomiast szczególnie w niskiej
temperaturze oraz podczas krótkotrwałego ogrzewania,
proces peroksydacji, w którym z nadtlenków powstają
aldehydy.
13
2. Niższe wartości LK i LA podczas ogrzewania oleju
rzepakowego w porównaniu z olejem słonecznikowym
sugerują, że olej pozyskiwany z nasion rzepaku jest bardziej odpowiedni do smażenia.
Piśmiennictwo
1. Okuyama H., Yamada K., Miyazawa D., Yasui Y., Ohara N.: Dietary lipids impacts on healthy ageing. Lipids.
2007; 42(9): 821-835.
2. Guillén M.D., Goicoechea E.: Toxic oxygenated alpha,beta-unsaturated aldehydes and their study in foods: a review. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2008 48(2):
119-136.
3. Muik B., Lendl B., Molina-Díaz A., Ayora-Cañada M.J.:
Direct monitoring of lipid oxidation in edible oils by
Fourier transform Raman spectroscopy. Chem. Phys. Lipids 2005; 134(2): 173-182.
4. Bhale S.D., Xu Z., Prinyawiwatkul W., King J. M., Godber J. S.: Oregano and rosemary extracts inhibit oxidation of long-chain n-3 fatty acids in menhaden oil. J.
Food Sci., 2007; 72(9): 504-508.
5. Grzegorczyk I., Kuźma Ł., Wysokińska H.: Związki
o właściwościach przeciwutleniających w roślinach
z rodzaju Salvia. Bromat. Chem. Toksykol., 2004; 37(3):
209-216.
6. Moreno S., Schever T., Romano C.S., Vojnov A.A.: Antioxidant and antimicrobial acticities of rosemary exctracts linked to their polyphenol composition. Free Radic. Res., 2006; 40(2): 223–231.
7. Polska Norma PN-EN ISO 660: 2005.
8. Polska Norma PN- ISO 3960: 1996.
9. Polska Norma PN-EN ISO 6885: 2001.
10.Esterbauer H., Schaur R.J., Zollner H.: Chemistry and
biology of 4-hydroxynonenal, malondialdehyd and related aldehydes. Free Radic. Biol. Med., 1991; 11: 81-128.
Dr n. med. Ewa Kurzeja,
Katedra i Zakład Żywności i Żywienia Wydz. Farmaceutyczny
z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach;
41-200 Sosnowiec, ul. Jedności 8;
tel. 032/3641172
e-mail: [email protected]
14
Chlorowcowe i siarkowe pochodne naturalnych zasad purynowych
o aktywności przeciwnowotworowej i immunosupresyjnej
Chloro and thiopurine derivatives with anticancer
and immunosuppressive activity
Alicja Kowalska
Katedra i Zakład Chemii Organicznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Śląski Uniwersytet Medyczny,
Sosnowiec
Streszczenie
Abstract
Syntetyczne pochodne puryny zawierające atom chlorowca
lub siarki są lekami od dawna wykorzystywanymi w farmakoterapii. 6-Merkaptopuryna jako pierwsza tiopuryna
została wprowadzona w 1963 roku do chemioterapii przeciwnowotworowej u dzieci. Stosowane obecnie w lecznictwie pochodne: 6-merkaptopuryna (6-MP), 6-tioguanina
(6-TG), azatiopryna (AZA), fludarabina i kladrybina stanowią grupę antymetabolitów naturalnych zasad purynowych - adeniny, guaniny i hipoksantyny. Mechanizm ich
działania polega głównie na wbudowywaniu się do łańcucha DNA i RNA w postaci nukleozydów oraz na blokowaniu biosyntezy puryn de novo. Istnieją również doniesienia o możliwości indukowania przez nukleozydowe
analogi puryn procesu apoptozy jak i hamowania angiogenezy tkanek nowotworowych. Są lekami swoistymi dla
fazy S cyklu komórkowego przy czym kladrybina działa
dodatkowo w fazie G0. Związki te stają się biologicznie
aktywne po przekształceniu w organizmie do rybonukleotydów przy udziale takich enzymów, jak: HGPRT, IMPD,
GMPS, IPP. Azatiopryna jest prolekiem, który ulega
w wątrobie nieenzymatycznej przemianie do 6-MP
i pochodnej metylonitroimidazolu przy udziale
S-metylotransferazy glutationu. 6-MP, 6-TG, fludarabina
i kladrybina wykorzystywane są głównie w chemioterapii
przeciwnowotworowej, głównie w białaczkach szpikowych
i limfoblastycznych, azatiopryna natomiast stosowana jest
przede wszystkim jako lek immunosupresyjny w transplantologii oraz leczeniu chorób o podłożu autoimmunologicznym.
The synthetic chloro and thiopurine derivatives are the
drugs widely used in pharmacotherapy for many years.
In 1963 6-mercaptopurine as the first thiopurine was introduced into cancer chemotherapy in children. From this
group of purine derivatives, 6-mercaptopurine (6-MP),
6-thioguanine (6-TG), azathioprine (AZA), fludarabine
and cladrybine are the drugs available today in therapy. All
this compounds are the natural purine (adenine, guanine
and hypoxanthine) antimetabolites. They are metabolically
activated to ribonycleotides by a multienzymatic process
(HGPRT, IMPD, GMPS, IPP). The mechanism of the drugs
biological activity is complex and may involve modulation
of cellular metabolism in several ways. The first pathway
it is incorporation active nucleotides into replicating nucleic acids and the second one is action as pseudofeedback
inhibitor of de novo purine nucleotide synthesis. They are
the drugs acting in the S phase of cell cycle, cladrybine
acts in the G0 phase as well. Azathioprine is a prodrug,
which is metabolized to 6-MP through the elimination of
the methylnitroimidazole by a chemical nucleophile such
as glutathione. Glutathione S-methyltransferase is the enzyme catalyzing the conjugation of glutathione with the
imidazole moiety. 6-MP, 6-TG, fludarabine and cladrybine have been used mainly in the antitumor therapy, in
lymphoblastic and myeloid leukemia. AZA is used as an
immunomodulator in different disciplines: transplantology, dermatology, hematology and in the rheumatologic or
inflammatory bowel diseases.
Słowa kluczowe: antymetabolity purynowe, mechanizm
działania, zastosowanie kliniczne
Syntetyczne pochodne puryn zawierające w swej strukturze atomy chlorowca lub siarki są lekami od dawna wykorzystywanymi w farmakoterapii. 6-Merkaptopuryna jako
pierwsza tiopuryna znalazła zastosowanie w leczeniu ostrej
białaczki szpikowej i limfoblastycznej i do chwili obecnej
jest jednym z najbardziej efektywnych leków używanych
w leczeniu dziecięcej białaczki limfoblastycznej [1,2].
Key words: purine antimetabolites, mechanism of action,
clinical indications Do odkrycia merkaptopuryny w 1951 roku doprowadziły badania George’a Hitchings’a i Gertrudy Elion, którzy
w amerykańskich laboratoriach firmy Wellcome Burroughs
przetestowali około 100 różnych pochodnych purynowych,
wykorzystując bakterie Lactobacillus casei jako mikroorganizm testowy [2,3].G. Hitchings [4] opierając się na
teorii antymetabolitów założył, że jeśli kwasy nukleinowe
15
są niezbędne do funkcjonowania każdej żywej komórki,
istnieje możliwość zatrzymania wzrostu szybko dzielących
się komórek (bakterii, pierwotniaków, komórek nowotworowych) związkami będącymi antagonistami zasad purynowych wchodzących w skład tych kwasów. Niewielkie
zmiany chemiczne dokonane w obrębie cząsteczki naturalnie występującej puryny mogłyby spowodować, że analog
będzie na tyle podobny do substratu, iż możliwe będzie
jego oddziaływanie z receptorem. Ostateczne zastąpienie atomu tlenu atomem siarki w pozycji 6 hipoksantyny
i guaniny doprowadziło do otrzymania antymetabolitów
purynowych: 6-merkaptopuryny i 6-tioguaniny. Po pomyślnych testach na liniach komórkowych białaczki L1210
i zwierzętach [5] oraz pierwszych klinicznych badaniach,
w których uzyskano wydłużenie czasu przeżycia oraz remisję u chorych na białaczkę [3] 6-merkaptopuryna została
w 1963 roku zatwierdzona przez Amerykańską Agencję
ds. Żywności i Leków do stosowania w lecznictwie [2].
Wprowadzenie chemioterapii do leczenia nowotworów
u dzieci było ogromnym postępem w tej dziedzinie.
1. Metabolizm i mechanizm działania
Wśród siarkowych pochodnych puryn, obecnie stosowanych w lecznictwie, znajdują się takie leki, jak:
6-merkaptopuryna (6-MP), 6-tioguanina (6-TG) (Ryc.1)
i azatiopryna (AZA) (Ryc.2), do chlorowcopochodnych natomiast zalicza się: fludarabinę (Ryc.3) i kladrybinę (Ryc.4)
[1].
Wszystkie te leki stanowią grupę antymetabolitów naturalnych zasad purynowych: adeniny, guaniny i hipoksantyny. Mechanizm ich działania jest złożony. Z jednej strony
jako „fałszywe” zasady są wbudowywane w postaci nukleotydów do łańcucha DNA i RNA zaburzając transkrypcję
i replikację kwasów nukleinowych, z drugiej natomiast
blokują biosyntezę puryn de novo [6,7]. Antymetabolity są
lekami swoistymi fazowo, działają w fazie S cyklu komórkowego, czyli w fazie aktywnej syntezy DNA następującej
po zakończeniu fazy G1 [8,9]. Kladrybina dodatkowo działa
także na populację dzielących się limfocytów i monocytów
w fazie spoczynkowej (G0) cyklu komórkowego [1].
Przyjmuje się, że głównym mechanizmem uszkadzającym
komórki w fazie Go jest proces apoptozy. Kladrybina indukując apoptozę w limfocytach powoduje zmniejszenie
się populacji limfocytów CD4 i CD8 [1,8,9].
W ciągu ostatnich lat pojawiły się nowe teorie dotyczące mechanizmu działania siarkowych analogów puryn. Okazało się, że 6-TG może też działać jako molekuła antyangiogenna. Angiogeneza, czyli proces tworzenia się naczyń krwionośnych odgrywa podstawową rolę
w powstawaniu i wzroście niektórych nowotworów. In
vitro 6-TG hamuje proliferację komórek endotelium wyzwalaną przez czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2)
i czynnik proliferacyjny dla śródbłonka (VEGF) oraz opóźnia naprawę mechanicznie uszkodzonych komórek endotelium. 6-Tioguanina hamuje zatem różne etapy angiogenezy
[10].
Biotransformacja 6-MP i 6-TG może odbywać się dwiema drogami - anaboliczną i kataboliczną. Przemiany anaboliczne polegają na aktywacji 6-MP i 6-TG przez enzym fosfo-
16
rybozylotransferazę hipoksantynowo-guaninową (HGPRT)
i powstaniu początkowo monofosforanowych nukleotydów, a następnie pochodnych trifosforanowych w reakcji katalizowanej przez enzym inozyno-5’-fosforanopirofosforylazę (IPP) [7,11] (Ryc.5). Nukleotyd tioinozyno-5’-monofosforanowy (6-TIMP) powstający z merkaptopuryny, w dalszym etapie w reakcji katalizowanej
przez dehydrogenazę inozyno-monofosforanową (IMPD)
jest utleniany w pozycji C2 pierścienia purynowego do nukleotydu tioksantozyno-monofosforanowego (TXMP). Ten
ostatni z kolei ulega przekształceniu do 6-tioguanozyno5’-monofosforanu (TGMP) w energozależnej reakcji katalizowanej przez syntetazę guanozyno-monofosforanową
(GMPS). W przeciwieństwie do merkaptopuryny, tioguanina ulega bezpośredniej przemianie do nukleotydu TGMP w
jednoetapowej reakcji katalizowanej przez enzym HGPRT.
6-Tioguanozyno-5’-monofosforan (TGMP) jest dalej metabolizowany przez kinazy i reduktazy do deoksy-6-tioguanozyno-5’-trifosforanu [7,11,12], który może być wbudowany do DNA.
Metabolizm kataboliczny 6-MP i 6-TG zachodzi
z udziałem metylotransferazy tiopurynowej (TPMT), oksydazy ksantynowej (XO) oraz oksydazy aldehydowej (AO),
konkurujących z enzymem HGPRT i prowadzi do powstania kwasu 6-tiomoczowego i 6-metylotiomoczowego
[7]. Proces ten zachodzi bardzo intensywnie już w czasie
pierwszego przejścia cytostatyku przez wątrobę i w związku
z tym jego biodostępność jest bardzo mała. Oksydaza ksantynowa jest blokowana przez allopurinol, co prowadzi do
hamowania biotransformacji merkaptopuryny i wydłuża jej
biologiczny okres półtrwania [9].
Ważnym etapem biotransformacji 6-MP i 6-TG jest
powstawanie metylowych pochodnych zachodzące przy
udziale enzymu metylotransferazy tiopurynowej (TPMT),
której poziom waha się w szerokich granicach ze względu na genetyczny polimorfizm, warunkujący powstawanie
nieaktywnych form enzymów. Około 10% ludzi rasy białej
jest nosicielami polimorficznego genu TPMT warunkującego bardzo niski poziom aktywności tego enzymu. Pacjenci
o takim genotypie leczeni standardową dawką 6-MP będą
doświadczać głębokiej mielosupresji z towarzyszącym wysokim poziomem 6-tioguanozyny (TGN) w krwinkach czerwonych [7,11,13]. Zachowanie wysokiego poziomu TGN
przy obniżonej aktywności enzymu TPMT sugeruje, że 6-MP
wykazuje cytotoksyczny efekt poprzez mechanizmy niezależne od produkcji TGN, np. poprzez hamowanie syntezy
puryn de novo przez S-metylotioinozyno-5’-monofosforan
(MeTIMP) [7]. Dla 6-MP i 6-TG istnieją różnice w syntezie
S-metylowych pochodnych, w inkorporacji nukleotydów
tioguaninowych do DNA i w hamowaniu syntezy puryn de
novo. W przypadku 6-TG aktywacja TPMT prowadzi do
niewielkiego wzrostu cytotoksycznej wrażliwości, w wyniku czego można zaobserwować wzrost efektywności inkorporacji TGN do DNA. Zatem mechanizm cytotoksycznego
działania 6-TG zależy głównie od wbudowywania TGN do
DNA. S-Metylotioguanozyno-5’-monofosforan (MeTGMP)
jest słabym inhibitorem syntezy puryn de novo [7].
Biotransformacja merkaptopuryny zachodzi głównie
w wątrobie i prawdopodobnie w błonie śluzowej przewodu
pokarmowego. Merkaptopuryna przenika łatwo przez bło-
ny komórkowe i jest aktywowana przez system cytochromu
P-450 do reaktywnego metabolitu, który wiąże się z białkami tkanek. W trakcie tego procesu dochodzi do powstania
rodników tiopurynowych ulegających dimeryzacji z wytworzeniem symetrycznego disulfidu bis (6,6’-dipurynowego)
[14], który może być dalej utleniany do kwasu puryno-6sulfenowego [14,15] lub ulegać reakcji dysproporcjonowania z wytworzeniem 6-MP i kwasu puryno-6-sulfinowego
[14,16]. Badania in vitro z użyciem znakowanego [8-14C]
kwasu puryno-6-sulfinowwego potwierdzają możliwość
jego wiązania z białkami poprzez tworzenie mostków disulfidowych z grupami tiolowymi protein, co może tłumaczyć
hepatotoksyczny efekt działania 6-MP [15].
Azatiopryna (AZA) jako prekursor merkaptopuryny jest
metabolizowana w wątrobie i nerkach do 6-MP i pochodnej 1-metylo-4-nitroimidazolu w reakcji, w której uczestniczy S-transferaza glutationu (GSTs) [17] (Ryc.6). Reakcja
ta polega na nukleofilowym ataku grup tiolowych różnych
związków na pozycję 5 pierścienia imidazolowego, przy
czym proces ten zachodzi głównie w krwinkach czerwonych
zawierających glutation i inne związki o strukturze tiolowej
[17]. Dochodzi do obniżenia poziomu glutationu (GSH)
w hepatocytach, co prowadzi do dysfunkcji mitochondriów,
spadku poziomu ATP i w konsekwencji do śmierci komórki
przez nekrozę. Procesowi temu zapobiegają silne antyoksydanty, glicyna oraz związki blokujące przepuszczalność
błony mitochondrialnej [18,19]. Ludzka S-transferaza glutationu (GSTs) jest kodowana przez 17 genów, przy czym
w uwalnianiu 6-MP z azatiopryny uczestniczą trzy różne
izoenzymy GSTs: A1-1, A2-2 i M1-1 [20].
Efekt immunosupresyjnego działania azatiopryny zależy od synergistycznego współwystępowania relatywnie
słabego cytostatycznego efektu niskiej dawki 6-MP i efektu
wywieranego przez wysoce reaktywne pochodne imidazolu:
S-podstawione 1-metylo-4-nitro-5-tioimidazole oraz aminoimidazole [17]. Azatiopryna wywiera niespecyficzny efekt
na komórki układu immunologicznego. Metabolity purynowe hamują proliferację aktywnych mitotycznie limfocytów,
a sama AZA posiada selektywny wpływ na limfocyty T oraz
nieznaczny na limfocyty B. Efektem działania AZA jest inhibicja funkcji cytotoksycznych limfocytów T poprzez blokowanie białka CD28 oraz modulacyjny wpływ na syntezę
związanego z guanozynotrifosforanem (GTP) białka Rac1
[21].
Fludarabina jest analogiem nukleozydu adeniny opornym na działanie deaminazy adenozynowej. Stosowana
w postaci monofosforanu ulega szybko defosforylacji do
2-fluoroadenozyny i w tej postaci jest wchłaniana przez
komórki. Następnie ulega wewnątrzkomórkowej przemianie do aktywnego 5’-trifosforanu w reakcji katalizowanej
przez kinazę deoksycytydynową. Trifosforan fludarabiny
jako czynny metabolit hamuje reduktazę rybonykleotydową, polimerazę, primazę i ligazę DNA, czego efektem jest zablokowanie syntezy DNA w komórce. Ponadto
następuje częściowe zahamowanie polimerazy II RNA
i w konsekwencji zmniejszenie syntezy białek. Procesy te
prowadzą do zahamowania wzrostu komórek [1,9].
Kladrybina jest syntetyczną pochodną deoksyadenozyny różniącą się od niej obecnością atomu chloru w pozycji
C2 pierścienia purynowego. Wewnątrz komórki ulega fos-
forylowaniu przy udziale kinazy deoksycytydynowej początkowo od mono a następnie trifosforanu. Wywiera wybiórcze
cytotoksyczne działanie w stosunku do komórek o względnie
dużym stosunku kinazy deoksycytydynowej do deoksynukleotydazy, czyli prawidłowych i nowotworowych limfocytów
i monocytów. Kladrybina nie tylko hamuje aktywność enzymów, takich jak reduktaza rybonukleotydowa czy polimerazy
DNA, ale także jak wszystkie antymetabolity ulega wbudowaniu do łańcucha DNA w miejsce deoksyadenozyny powodując
pęknięcie helisy DNA. Komórki zawierające duże ilości deoksynukleotydów są niezdolne do naprawy pojedynczych łańcuchów
DNA. Uszkodzone końce DNA aktywują polimerazę, w rezultacie czego dochodzi do zubożenia puli komórkowego NAD, zahamowania syntezy ATP i ostatecznie zaburzenia metabolizmu,
zaburzenia procesów energetycznych komórki i jej śmierci.
Wodróżnieniuodinnychanalogówpurynowych,kladrybinadziała
zarówno na populację limfocytów i monocytów proliferujących,
jak i pozostających w fazie spoczynkowej (G0) cyklu komórkowego [1,8,9].
2. Zastosowanie kliniczne
Ryc. 1. R = H Merkaptopuryna
0
R = NH2 Tioguanina
6-Merkaptopuryna (Ryc.1) stosowana jest głównie
w leczeniu ostrych białaczek: szpikowej i limfoblastycznej,
w zaostrzeniu blastycznym przewlekłej białaczki szpikowej,
a także w połączeniu z innymi lekami dla podtrzymania
remisji ostrej białaczki limfoblastycznej [1,12,13]. Często
wykorzystuje się ją do leczenia białaczek u dzieci, u których
stanowi jeden z najbardziej efektywnych leków [11,12,22].
W Polsce zarejestrowana jest pod nazwą Mercaptopurinum
(Vis, PL) [1].
Lekiem stosowanym w onkologii jest także 6-tioguaniana
(Ryc.1), która obecnie jest głównie wykorzystywana (podobnie jak merkaptopuryna) do leczenia białaczek w fazie ostrej,
a także w połączeniu z innymi lekami w chemioterapii nowotworów o charakterze przewlekłym np. w konsolidacji i podtrzymywaniu remisji ostrej i przewlekłej białaczki szpikowej,
a także ostrej białaczki limfoblastycznej [1,12,23]. Dostępna
jest w postaci preparatów: Lanvis (GlaxoSmithkline, GB)
i Thioguanin-GSK (GlaxoSmithkline, D) [1].
Zarówno 6-MP jak i 6-TG stosuje się również w leczeniu chorób o podłożu immunologicznym np. w chorobie
Crohn’a, wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego, łącznie
z kortykosteroidami w wirusowym zapaleniu wątroby,
w dermatologii w leczeniu liszaja, łuszczycy, twardziny,
guzkowatego zapalenia tętnic czy złuszczającego zapalenia
skóry [6,23,24].
17
Ryc. 2. Azatiopryna
Ryc. 3. Fludarabina
Ryc. 4. Kladrybina
Objawy niepożądane, które towarzyszą stosowaniu
6-merkaptopuryny i 6-tioguaniny wiążą się przede wszystkim z przyjmowaniem dużych dawek cytostatyków. Należą
do nich zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego: nudności, wymioty, biegunka, zapalenie jamy ustnej, owrzodzenie błony śluzowej jelit, hepatotoksyczność oraz uszkodzenie szpiku [8,25,26].
Azatioprynę (Ryc. 2) stosuje się wyłącznie jako lek
immunosupresyjny w transplantologii narządów i tkanek
oraz w chorobach o podłożu autoimmunologicznym: chorobie Werlhofa, ciężkim reumatoidalnym zapaleniu stawów,
przewlekłym czynnym zapaleniu wątroby, autoimmunologicznej niedorkwistości hemolitycznej, sklerodermii,
nieropnym zapaleniu skóry, tkanki podskórnej i mięśni,
guzkowatym zapaleniu okołotętniczym, zespole nerczycowym, rozsianym liszaju rumieniowatym, pęcherzycy zwyczajnej czy przewlekłej samoistnej plamicy małopłytkowej
opornej na leczenie. Azatioprynę najczęściej stosuje się
w połączeniu z innymi lekami, zwykle kortykosteroidami lub
w połączeniu z zabiegami zmniejszającymi odpowiedź immunologiczną [23,25-31]. Azatiopryna jest obecnie dostępna
w postaci następujących preparatów: AzathioprinRatiopharm (Ratiopharm, D), Azamedac (Medac, D),
Azathioprine (Vis, PL), Imuran (GlaxoSmithkline, GB),
Imurek (GlaxoSmithkline, CH), Imurel (GlaxoSmithkline,
F), Zytrim (Mercle, D) [1].
Objawy niepożądane występujące przy stosowaniu
azatiopryny często wynikają z reakcji nadwrażliwości na
ten lek. Należą do nich zaburzenia rytmu serca, obniżenie
ciśnienia tętniczego, zawroty głowy, złe samopoczucie,
gorączka, bóle mięśni, stawów (prawdopodobnie spowodowane obecnością pierścienia imidazolowego w cząsteczce azatiopryny) oraz zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego podobnie jak w przypadku stosowania
merkaptopuryny. Ponadto mogą wystąpić megalobastyczne zmiany w szpiku (niekokrwistość megaloblastyczna,
erytroblastopenia, leukopemia, granulocytopenia, limfocytopenia), a u biorców przeszczepów zwiększona podatność na zakażenia wirusowe, bakteryjne i grzybicze
[18,28,30,31].
Ryc. 5. Enzymatyczna aktywacja 6-merkaptopuryny i 6-tioguaniny
0
HGPRT-fosforybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa
IMPD-dehydrogenaza inozyno-monofosforanowa
GMPS-syntetaza guanozyno-monofosforanowa
IPP-inozyno-5'-fosforanopirofosforylaza
6-TIMP-tioinozyno-5'-monofosforan
TXMP-tioksantozyno-monofosforan
18
Ryc. 6. Metabolizm azatiopryny
0
GSH-glutation
GSTs-S-transferaza glutationu
Chlorowcowe pochodne puryn – fludarabina i kladrybina są typowymi chemioterapeutykami. Fludarabinę (Ryc.3)
stosuje się w leczeniu przewlekłej białaczki limfatycznej
typu B-komórkowego, chłoniaków nieziarniczych, ostrej
białaczki szpikowej i limfoblastycznej, białaczki prolimfocytowej i włochatokomórkowej [1,8,9]. Zarejestrowana jest
pod nazwą Fludara (Schering, GB,D, Berlex, USA) [1].
Kladrybina (Ryc.4) ma podobne zastosowanie w leczeniu białaczek włochatokomórkowych w każdym stadium
choroby, przewlekłych białaczek limfatycznych opornych
na leczenie innymi cytostatykami, chłoniaków nieziarniczych o małym stopniu złośliwości oraz ostrych białaczek
szpikowych w skojarzeniu z innymi cytostatykami. Jest dostępna w postaci następujących preparatów: Biodribin (IBA,
PL), Leustat (Janssen-Cilag, GB), Leustatin (Ortho Biotech,
USA), Litak (Lipomed, D) [1].
Przy stosowaniu fludarabiny lub kladrybiny najczęstszym objawem ubocznym jest mielotoksyczność (leukopenia, trombocytopenia, neutropenia), zaburzenia czynności
przewodu pokarmowego oraz neurotoksyczność (bóle i zawroty głowy, bezsenność, parestezje, zaburzenia widzenia
wywołane zapaleniem nerwów wzrokowych). Ponadto fludarabinę cechuje pulmotoksyczność (może wywołać duszności, kaszel i śródmiąższowe zapalenie płuc), natomiast w
czasie leczenia kladrybiną może wystąpić uszkodzenie nerek, zakażenia bakteryjne i grzybicze oraz wysypki skórne
[1,9].
Dokonany przegląd stosowanych obecnie w lecznictwie
antymetabolitów purynowych z grupy chlorowco i tiopuryn
wskazuje na duże znaczenie tych związków w chemioterapii
nowotworowej, jak również na coraz szersze ich wykorzystanie jako immunosupresorów. Duży zasięg występowania
chorób nowotworowych w dzisiejszym społeczeństwie oraz
niedoskonałość stosowanych metod leczenia stanowi wyzwanie zarówno dla lekarzy jak i chemików w zakresie syntezy nowych leków oraz badań dotyczących mechanizmu
działania już stosowanych.
Piśmiennictwo:
1. Podlewski J. K., Chwalibogowska-Podlewska A.; Leki
współczesnej terapii; Split Trading Sp. z o.o.; Warszawa;
2007/2008.
2. Elion G.B.; The purine path to chemotherapy; Science,
1989; 244: 41-47.
3. Farber S.; Summary of experience with 6-MP; Ann. NY
Acad. Sci.; 1954; 60: 412- 414.
4. Hitchings G. H., Elion G. B.; The chemistry and biochemistry of purine analogs; Ann. NY Acad. Sci.; 1954; 60:
195-199.
5. Burchenol J. H., Ellison R. R., Murphy M. L.; Clinical
studies on 6-mercaptopurine; Ann. NY Acad. Sci.; 1954;
60: 359-368.
6. Bökkerink J. P. et al.; 6-Mercaptopurine: cytotoxicity and biochemical pharmacology in human malignant T-lymphoblasts;
Biochem. Pharmacol.; 1993; 45: 1455-1463.
7. Coulthard S. A. et al.; The effect of thiopurine methyltransferase expression on sensitivity to thiopurine drugs;
Mol. Pharmacol.; 2002; 62: 102-109.
8. Kostowski W., Herman Z. S.; Farmakologia; PZWL;
Tom II, Warszawa; 2003, 418-422.
9. Orzechowska-Juzwenko K.; Zarys chemioterapii nowotworów; Volumed; Wrocław; 2000, 33-39.
10.Presta M., Belleri M., Vacca A., Ribatti D.; Antiangiogenic activity of the purine analog 6-thioguanine;
Leukemia; 2002; 16: 1490-1499.
11.Evans W. E. et al.; Altered mercaptopurine metabolism,
toxic effects, and dosage requirement in a thiopurine
methyltransferase deficient child with acute lymphocytic
leukemia; J. Pediatr.; 1991; 119: 985-989.
12.Adamson P. C., Poplack D. G., Balis F. M.; The cytotoxicity of thioguanine vs mercaptopurine in acute lymphoblastic leukemia; Leukemia Res.; 1994; 18: 805-810.
13.Lennard L., Lilleyman J. S.; Individualizing therapy with
6-mercaptopurine and 6-thioguanine related to the thiopurine methyltransferase genetic polymorphism; Ther.
Drug Monit.; 1996; 18: 328-334.
14.Goyal R. N., Rastogi A., Sangal A.; Electro oxidation
of 6-mercaptopurine riboside with special emphasis on
the stability of the dimer in aqueous solutions; New J.
Chem.; 2001; 25: 545-550.
15.Abraham R. T., Benson L. M., Jardine I.; Synthesis and
pH-dependent stability of purine-6-sulfenic acid, a putative reactive metabolite of 6-thiopurine; J. Med. Chem.;
1983; 26: 1523-1526.
19
16.Pawełczyk E., Zając M., Majewski W., Majewska B.;
Kinetyka rozkładu leków: XCIII Model kinetyki rozkładu 6-merkaptopuryny (6-MP) w środowisku zasadowym; Acta Polon.Pharm.: 1988; 45: 259-265.
17.Hoffmann M. et al.; Mechanism of activation of an immunosuppresive drug: azathioprine. Quantum chemical
study on the reaction of azathioprine with cysteine; J.
Am. Chem. Soc.; 2001; 123: 6404-6409.
18.Lee A. U., Farrell G. C.; Mechanism of azathioprine
induced injury to hepatocytes: roles of glutathione depletion and mitochondrial injury; J. Hepatol.; 2001; 35:
756-764.
19.Menor C. et al.; Azathioprine acts upon rat hepatocyte
mitochondria and stress-activated protein kinases leading to necrosis: protective role of N-acetyl-L-cysteine;
J. Pharmacol. Exp. Ther.; 2004; 311: 668-676.
20.Eklund B. I., Moberg M., Bergquist J., Mannervik B.;
Divergent activities of human glutathione transferases
in the bioactivation of azathioprine; Mol. Pharmacol.;
2006; 70: 747-754.
21.Tiede I. et al.; CD28-dependent Rac1 activation is the
molecular target of azathioprine in primary human
CD4+T lymphocytes; J. Clin. Invest.; 2003; 111: 11331145.
22.Paneta J. C., Evans W. E., Cheok M. H.; Mechanistic
mathematical modeling of mercaptopurine effects on
cell cycle of human acute lymphoblastic leukaemia cells;
Br. J. Cancer; 2006; 94: 93-100.
Alicja Kowalska,
tel. 0323641602,
20
23.Duley J. A., Florin T. H.; Thiopurine therapies: problems,
complexities, and progress with monitoring thioguanine
nukleotides; Ther. Drug Monit.; 2005; 27; 547-654.
24.Bonaz B. et al.; Thioguanine in patients with Crohn’s
disease intolerant or resista; Aliment. Pharmacol. Ther.;
2003; 18: 401-408.
25.Chojnacki J., Wichan P.; Tło patogenetyczne i zasady
leczenia zachowawczego przewlekłych nieswoistych
zapaleń jelit; Pediatria współ.; 2004; 6: 441-447.
26.Cara C. J. et al.; Reviewing the mechanism of action
of thiopurine drugs towards a new paradigm in clinical
practice; Med. Sci. Monit.; 2004; 10: 247-257.
27.Siegel C. A., Sands B. E.; Practical management of inflamatory bowel disease patients taking immunomodulators; Aliment. Pharmacol. Ther.; 2005; 22: 1-12.
28.Chang J.; A review on the management of Crohn’s disease; U.S.Pharmacist; 2007; 32: 18-33.
29.Cuffari C., Hunts S., Bayless T. M.; Enhanced bioavailability of azathioprine compared to 6-mercaptopurine
therapy in correlation with treatment efficacy; Aliment.
Pharmacol. Ther.; 2000; 14: 1009-1014.
30.Anstey A. V., Wakelin S., Reynolds N. J.; Guidelines
for prescribing azathioprine in dermatology; Br. J.
Dermatol.; 2004; 151: 1123-1132.
31.Arnott I. D., Watts D., Satsangi J.; Azathioprine and anti-TNF alpha therapies in Crohn’s disease: a review of
pharmacology, clinical efficacy and safety; Pharmacol.
Res.; 2003; 47: 1-10.
taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych
w ich mieszaninie*
Chromatographic separation and identification
of taurine-conjugates of selected bile acids in their mixture
Małgorzata Dołowy
Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Ogólnej i Analitycznej,
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
Sosnowiec
Kierownik Katedry: prof. dr hab. n. chem. Alina Pyka
Streszczenie
Celem pracy było zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej w normalnym i odwróconym układzie faz
(NP-TLC i RP-TLC) do rozdziału i identyfikacji taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych, takich jak:
kwas taurocholowy (TCA), taurodeoksycholowy (TDCA),
taurochenodeoksycholowy (TCDCA) i taurolitocholowy
(TLCA) w ich mieszaninie. Do oceny rozdziału trzech par
badanych kwasów żółciowych tj. TCA/TDCA, TDCA/
TCDCA i TCDCA/TLCA użyto współczynniki rozdziału
∆RF i RS. Wykazano, że NP-TLC i RP-TLC są przydatne
do rozdziału tylko dwóch par kwasów żółciowych z ich
mieszaniny: TCA/TDCA i TCDC/TLCA. Problem stanowi
separacja kwasu TDCA od TCDCA. Para ta nie rozdzieliła
się w żadnych z zastosowanych warunków chromatograficznych. Stwierdzono, że trudności w separacji pary kwasów TDCA/TCDCA wynikają z podobieństwa ich retencji
chromatograficznej.
Abstract
The aim of this paper was to apply a thin-layer chromatography in normal and reversed phase system (NP-TLC and
RP-TLC) to separate and identify a mixture of selected
taurine- conjugates bile acids such as: taurocholic acid
(TCA), taurodeoxycholic acid (TDCA), taurochenodeoxycholic acid (TCDCA) and taurolithocholic acid (TLCA).
The estimation of resolution of three investigated pairs of
bile acids was carried out on the basis of the separation
factors values ∆RF and RS. It was showed that, the NPTLC and RP-TLC methods are useful for separation of two
of three examined bile acids of their mixture: TCA/TDCA
and TCDCA/TLCA. The biggest problem in bile acids
separation is resolution of TDCA from TCDCA. This pair
didn’t separate under all applied chromatographic conditions. It was stated that the problems in TDCA/TCDCA
separation arise from similarities of their chromatographic
retention.
słowa kluczowe: kwasy żółciowe, rozdział kwasów żółciowych, analiza kwasów żółciowych, TLC
key words: bile acids, separation of bile acids, analysis
of bile acids, TLC
Wstęp
Kwasy żółciowe to pochodne steroidowe, czyli zawierające w swojej strukturze charakterystyczny dla steroidów
układ 1,2-cyklopentanoperhydrofenantrenu składający się
z czterech nasyconych, skondensowanych pierścieni, w tym
trzech pierścieni sześciowęglowych i jednego pięciowęglowego. W żółci człowieka kwasy te występują w postaci wolnej oraz sprzężonej, tj. są połączone wiązaniem amidowym
poprzez grupę karboksylową z glicyną (H2N-CH2-COOH)
lub z tauryną (H2N-CH2-CH2-SO3H) – rys. 1. Kwasy żółciowe różnią się ilością grup OH i C=O. W zależności od ilości
grup hydroksylowych (OH) obecnych w cząsteczce kwasu
żółciowego, związki te dzieli się na [1-3]:
• pochodne monohydroksylowe np. kwas litocholowy
• pochodne dihydroksylowe np. chenodeoksycholowy,
ursodeoksycholowy i deoksycholowy
• pochodne trihydroksylowe np. kwas cholowy.
Pod wpływem enzymów bakterii jelitowych, których
wzrost jest objawem pętli zastoinowej, glicyna lub tauryna,
mogą ulegać odszczepieniu od cząsteczek kwasów żółciowych do wolnych kwasów lub może dojść do dehydroksylacji czyli zamianie trihydroksylowych kwasów żółciowych
do monohydroksylowych. U osób z kamicą żółciową oraz
w przypadku marskości wątroby (tj. uszkodzenia miąższu wątroby) całkowita pula kwasów żółciowych w surowicy krwi
zwiększa się w porównaniu do zdrowych osobników [3].
*Badania finansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach z umowy KNW-2-023/09
21
kwasów żółciowych w ich mieszaninie, tj. kwasu taurocholowego (TCA), kwasu taurodeoksycholowego (TDCA),
kwasu taurochenodeoksycholowego (TCDCA) oraz kwasu
taurolitocholowego (TLCA).
Materiały
Rys. 1. S
0 truktura chemiczna kwasów żółciowych [2]
Dlatego bardzo ważna i istotna dla celów diagnostyki schorzeń wątroby i dróg żółciowych byłaby możliwość
rozdziału mieszaniny kwasów żółciowych na poszczególne frakcje tzn. wolne kwasy, kwasy połączone z glicyną
i tauryną oraz ich identyfikacja i ilościowe oznaczenia w surowicy czy żółci. Wśród metod stosowanych do rozdziału
i oznaczania kwasów żółciowych w materiale biologicznym
(surowica krwi, mocz i kał) stosuje się następujące metody
analityczne [4,5]:
• chromatografia cienkowarstwowa (TLC)
• chromatografia gazowa (GC)
• wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
• elektroforeza kapilarna (CE)
• metody enzymatyczne i immunoenzymatyczne.
Budowa kwasów żółciowych wskazująca na obecność
słabych ugrupowań chromoforowych absorbujących promieniowanie przy długości fali około 200 nm sprawia, że
spektrofotometryczne oznaczanie kwasów żółciowych bez
wcześniejszej ich derywatyzacji do bardziej czułych na
działanie światła pochodnych jest niemożliwe [5].
W standardowej diagnostyce laboratoryjnej do oznaczania całkowitej puli kwasów żółciowych w surowicy krwi
stosuje się metodę enzymatyczną. W metodzie tej wykorzystuje się katalityczne utlenianie kwasów żółciowych
przy użyciu swoistego dla nich enzymu – dehydrogenazy
3α-hydroksysteroidowej. Barwny produkt tej reakcji oznacza się spektrofotometrycznie, a jego stężenie jest proporcjonalne do poziomu kwasów żółciowych w surowicy krwi
ludzkiej. Metoda ta jest prosta w wykonaniu i obarczona
małymi błędami analitycznymi, co sprawia, że znalazła szerokie zastosowanie w analizie chorób wątroby i dróg żółciowych [4,5].
Powyższa praca jest kontynuacją chromatograficznych badań kwasów żółciowych w modelowej mieszaninie odpowiadającej składowi żółci ludzkiej. Poprzednie prace pozwoliły
na opracowanie optymalnych warunków chromatograficznych
(techniką TLC) do rozdziału i identyfikacji wolnych i związanych z glicyną kwasów żółciowych [6-12]. Ponadto chromatograficzno – densytometryczna metoda okazała się również
przydatna do ilościowego oznaczania wolnych kwasów żółciowych po wstępnym ich rozdziale z mieszaniny [9].
W prezentowanej pracy podjęto próbę chromatograficznego rozdziału i identyfikacji taurynowych połączeń
22
Do badań użyto metanolowe roztwory następujących
kwasów żółciowych: TCA, TDCA TCDCA i TLCA (Sigma- Aldrich, USA) o stężeniu 5µg/µl oraz ich mieszaninę
zawierającą 5 µg każdego kwasu w 1 µl.
Składniki faz ruchomych to: n -heksan (POCh, Gliwice), octan etylu (POCh, Gliwice), kwas octowy (99,5%,
POCh, Gliwice), metanol (POCh, Gliwice), chloroform
(POCh, Gliwice), izooktan (POCh, Gliwice), n- butanol
(POCh, Gliwice) oraz woda destylowana (Zakład Chemii
Analitycznej, Wydział Farmaceutyczny ŚUM, Sosnowiec).
W celu wizualizacji plamek badanych kwasów zastosowano
około 95% H2SO4 (POCh, Gliwice). Wodny roztwór CuSO4
× 5H2O (POCh, Gliwice) użyto do impregnacji płytek chromatograficznych stosowanych w badaniach.
W pracy użyto płytki chromatograficzne do chromatografii w normalnym układzie faz (NP –TLC) produkcji E.
Merck o numerach: Art. 1.05715, Art. 1.05554 i Art. 1.05553
oraz płytki do chromatografii w odwróconym układzie faz
(RP – TLC) o numerze Art. 1.05559.
Metodyka badań
Rozdział mieszaniny kwasów żółciowych techniką NP
–TLC ( rozwijanie jednokierunkowe)
Zastosowano płytki aluminiowe pokryte żelem krzemionkowym 60F254 i 60 (E. Merck, Art. 1.05554 i Art. 1.05553)
oraz szklane Art. 1.05715 o wymiarach 10cm×10cm. Na
zaktywowane w temp. 120oC płytki nanoszono 10 µl mieszaniny badanych kwasów i 3µl roztworu standardowego
kwasu TCA, TDCA, TCDCA i TLCA. Płytki rozwijano na
wysokość 9 cm w klasycznej komorze chromatograficznej
20cm×20cm (Camag, Szwajcaria) przy użyciu 50 ml fazy
ruchomej:
• n- heksan –octan etylu –kwas octowy w następujących
stosunkach objętościowych: 25:20:8 i 22:22:5 (v/v/v)
• chloroform –metanol-kwas octowy w stosunkach objętościowych: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5, 45:0:5, 40:5:5
i 37,5:13,5:1,55 (v/v/v).
Impregnacji płytek chromatograficznych dokonywano
poprzez ich zanurzenie na 30 sekund w wodnym roztworze CuSO4 o stężeniu 5% i następnie wysuszenie w temp.
18±1oC przez 24 h.
W celu uwidocznienia plamek analizowanych kwasów
płytki spryskiwano 10% roztworem H2SO4 i ogrzewano je
przez 20 minut w temp. 120oC.
Rozdział mieszaniny kwasów żółciowych techniką 2D
–TLC ( rozwijanie dwukierunkowe)
W przypadku rozwijania dwukierunkowego użyto płytki chromatograficzne Art. 1.05715 wymiarach 10cm×10cm
oraz mieszaninę izooktan –octan etylu- kwas octowy
w stosunku objętościowym 5:4:1 (v/v/v) jako fazę ruchomą
w I- szym kierunku rozwijania. Natomiast mieszaninę:
chloroform- woda-kwas octowy- n- butanol w stosunku objętościowym 2:1:1:16 (v/v/v/v) zastosowano w II kierunku
rozwijania prostopadłym do pierwszego. Na płytki nanoszono tylko 10 µl mieszaniny kwasów w obu etapach rozwijania dwukierunkowego. Każdorazowo użyto 50 ml fazy
ruchomej. Chromatogramy rozwijano na wysokość 9 cm.
Po wysuszeniu, w celu wizualizacji plamek badanych
związków, chromatogramy spryskiwano 10% wodnym
roztworem H2SO4 i ogrzewano przez 20 minut w temp.
120oC.
Rozdział mieszaniny kwasów żółciowych techniką RP
–TLC (rozwijanie jednokierunkowe)
W badaniach zastosowano płytki aluminiowe RP-18F254
(Art. 1.05559) o wymiarach 10cm×10cm. Mieszaninę metanol-kwas octowy- woda w ilości 50 ml użyto jako fazę
ruchomą w następujących stosunkach objętościowych:
15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 35:5:0, 25:5:20,
25:20:8, 22:22:5 i 25:20:5 (v/v/v). Chromatogramy rozwijano w komorze firmy Camag na wysokość 9 cm. Na płytki nanoszono 10 µl mieszaniny i 3 µl roztworów badanych
kwasów. Wizualizacji plamek badanych kwasów dokonywano za pomocą 10% H2SO4.
Ocena rozdziału taurynowych połączeń badanych kwasów żółciowych
Efekt rozdziału badanej mieszaniny oceniano za pomocą wartości współczynników rozdziału tj. ∆RF i RS [6] obliczonych na podstawie otrzymanych chromatogramów wg
wzorów:
∆RF=RF2 – RF1
(1)
gdzie: RF1 i RF2 są wartości RF dwóch sąsiadujących ze
sobą plamek na chromatogramie, a RF2> RF1.
a
Rs = 2x –
b
(2)
a- odległość pomiędzy środkami dwóch sąsiadujących plamek [cm]
b- suma szerokości obu plamek w kierunku rozwijania
[cm]
Wyniki i omówienie wyników
Prezentowana praca miała na celu opracowanie optymalnych warunków chromatograficznych pozwalających
na całkowity rozdział i identyfikację taurynowych połączeń
wybranych kwasów żółciowych, tj. kwasu TCA, TDCA,
TCDCA i TLCA. Badania przeprowadzono techniką chromatografii cienkowarstwowej w normalnym układzie faz
(NP-TLC) przy użyciu mieszaniny n- heksan– octan etylu–
kwas octowy w następujących stosunkach objętościowych:
25:20:8 i 22:22:5 oraz chloroform –metanol- kwas octowy w stosunku objętościowym: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5,
45:0:5, 40:5:5, 37,5:13,5:1,55 (v/v/v) jako fazy ruchomej.
Mieszaninę kwasów TCA+ TDCA+ TCDCA+ TLCA roz-
dzielano na płytkach chromatograficznych pokrytych żelem krzemionkowym 60F254 i 60 produkcji E. Merck (Art.
1.05554, Art. 1.05715 i Art. 1.05553). Rozdział mieszaniny
badanych kwasów oceniano na podstawie wartości współczynników rozdziału: ∆RF i RS wyznaczonych dla trzech
par badanych kwasów żółciowych tj. TCA/TDCA, TDCA/
TCDCA i TCDCA/TLCA w zastosowanych warunkach
chromatograficznych. Za kryterium całkowitego rozdziału
każdej z par badanych kwasów żółciowych przyjęto wartości ∆RF≥0.05 i RS>1 [6,7]. Z przeprowadzonych badań
rozdziału mieszaniny kwasów techniką NP -TLC z użyciem
fazy ruchomej chloroform –metanol- kwas octowy w różnym stosunku objętościowym wynika, że żadne z zastosowanych warunków chromatograficznych nie pozwalają na
całkowity rozdział wszystkich trzech par badanych kwasów.
Użyte płytki chromatograficzne (Art. 1.05554, Art. 1.05715
i Art. 1.05553) i mieszanina chloroform –metanol- kwas
octowy w stosunkach objętościowych: 25:12:3, 35:10:5,
25:20:5 i 37,5:13,5:1,55 (v/v/v) pozwoliły na rozdział tylko
dwóch spośród trzech par badanych kwasów żółciowych
tj. TCA/TDCA i TCDCA/TLCA, dla których otrzymano
∆RF≥0.05 i RS>1. Modyfikacja zastosowanych płytek chromatograficznych za pomocą 5% wodnego roztworu CuSO4×5H2O nieznacznie tylko polepszyła rozdział pary kwasów
TDCA i TCDCA. Natomiast stosowane płytki i mieszanina
chloroform –metanol- kwas octowy w stosunku objętościowym 45:5:5 (v/v/v) pozwalają na rozdział tylko jednej
pary badanych kwasów TCDCA/TLCA. Zupełnie nie przydatna do rozdziału badanej mieszaniny kwasów okazała się
również faza ruchoma: chloroform –metanol-kwas octowy
40:0:5 (v/v/v) oraz n- heksan –octan etylu –kwas octowy
w obu zastosowanych stosunkach objętościowych tj. 25:20:8
i 22:22:5 (v/v/v). Dla tych warunków chromatograficznych
brak jest rozdziału żadnej z par kwasów (∆RF dla wszystkich
par kwasów wynosi 0). Przykładowy chromatogram otrzymany techniką NP-TLC przedstawiono na rys. 2.
Sugerując się wynikami wcześniejszych badań nad wolnymi i sprzężonymi z glicyną kwasami żółciowymi, w kolejnym etapie przeprowadzono rozwijanie dwukierunkowe
omawianej mieszaniny taurynowych połączeń kwasów żółciowych, czyli techniką 2D- TLC. W tym celu zastosowano
płytki chromatograficzne Art. 1.05715 i mieszaninę izooktan –octan etylu-kwas octowy w stosunku objętościowym
5:4:1 (v/v/v) jako fazę ruchomą w pierwszym kierunku
rozwijania. Natomiast w drugim kierunku rozwijania (prostopadłym do pierwszego) użyto fazę ruchomą chloroform
–woda-kwas octowy- n- butanol w stosunku objętościowym
TLCA
TDCA + TCDCA
TCA
Rys. 2. R
0 ozdział mieszaniny taurynowych połączeń kwasów żółciowych
(M) na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym 60F254 (E. Merck, Art.
1.05715) rozwijanych przy użyciu fazy ruchomej: chloroform -metanol
–kwas octowy w stosunku objętościowym: 35:10:5 (v/v/v).
23
2:1:1:16 (v/v/v/v). Niestety, tak jak w przypadku rozwijania
jednokierunkowego, rozdziałowi uległy dwie pary kwasów
TCA i TDCA oraz TCDCA i TLCA. Brak natomiast jest rozdziału kwasu TDCA od TCDCA.
Oprócz techniki chromatograficznej w normalnym układzie faz, do rozdziału mieszaniny kwasów zastosowano płytki chromatograficzne RP-18F254 (E. Merck, Art. 1.05559)
czyli z odwróconym układem faz. Mieszaninę: metanolkwas octowy- woda w następujących stosunkach objętościowych: 15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 35:5:0,
25:5:20, 25:20:8, 22:22:5 i 25:20:5 (v/v/v) użyto jako fazy
ruchome. Ocenę rozdziału trzech par badanych kwasów żółciowych dokonywano na podstawie wartości współczynników rozdziału: ∆RF i RS. Za najbardziej optymalne fazy ruchome tj. pozwalające na rozdział tylko dwóch par badanych
kwasów żółciowych TCA/TDCA i TCDCA/TLCA uznano
mieszaninę: metanol-kwas octowy-woda w stosunkach ob-
jętościowych: 15:20:15, 30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 25:5:20
i 25:20:8. Natomiast żadna z zastosowanych faz ruchomych
nie pozwoliła na całkowity rozdział wszystkich trzech par
badanych kwasów techniką RP- TLC. Problem, podobnie
jak w przypadku rozdziału w normalnym układzie faz, stanowiła separacja kwasu TDCA od TCDCA. Dla tej pary
kwasów bez względu na zastosowane warunki chromatograficzne uzyskiwano parametry chromatograficznego rozdziału poza kryterium rozdziału tj. ∆RF<0.05 i RS<1.
W celu uzasadnienia przyczyny trudności w uzyskaniu całkowitego rozdziału kwasu taurodeoksycholowego
(TDCA) od taurochenodeoksycholowego (TCDCA) techniką NP-TLC i RP-TLC otrzymane obiema technikami chromatograficznymi współczynniki retencji chromatograficznej
(RF) omawianych kwasów, czyli TDCA i TCDCA porównano za pomocą analizy skupień (rys. 3 i 4). Zaprezentowane na poniższych rysunkach dendrogramy dowodzą, że
przyczyną trudności w separacji kwasu TDCA i TCDCA
jest niewątpliwie duże podobieństwo w wartościach RF obu
kwasów otrzymane metodą chromatografii cienkowarstwowej NP-TLC i RP-TLC (na prezentowanych w pracy dendrogramach te dwa kwasy tworzą wyraźne skupienie).
Wnioski
Rys. 3. D
0 endrogram podobieństwa rozdziału taurynowych połączeń kwasów żółciowych techniką NP- TLC na płytkach szklanych
pokrytych żelem krzemionkowym 60F254 (E. Merck, Art. 1.05715)
przy użyciu fazy ruchomej: chloroform -metanol –kwas octowy w
stosunkach objętościowych: 25:12:3, 35:10:5, 25:20:5, 45:0:5,
40:5:5, 37,5:13,5:1,55 (v/v/v).
Przeprowadzone badania pozwoliły sformułować następujące wnioski:
• chromatografia cienkowarstwowa w normalnym i odwróconym układzie faz (NP-TLC i RP-TLC) może być
przydatna do rozdziału wybranych taurynowych połączeń kwasów żółciowych z ich mieszaniny,
• największe trudności w rozdziale mieszaniny kwasów
żółciowych związanych z tauryną techniką chromatografii cienkowarstwowej obserwuje się w przypadku
separacji kwasu taurodeoksycholowego od taurochenodeoksycholowego,
• zarówno modyfikacja powierzchni płytek chromatograficznych za pomocą CuSO4, jak i rozwijanie dwukierunkowe nie poprawiają znacząco efektu rozdziału kwasu
taurodeoksycholowego od taurochenodeoksycholowego
(TDCA od TCDCA),
• techniki chemometryczne, do których należy analiza skupień są pomocne w ocenie separacji mieszaniny
taurynowych połączeń kwasów żółciowych,
• chromatografia cienkowarstwowa (TLC) może znaleźć
praktyczne zastosowanie w analityce wybranych kwasów żółciowych obecnych w żółci ludzkiej.
Piśmiennictwo
Rys. 4. 0Dendrogram podobieństwa rozdziału taurynowych połączeń
kwasów żółciowych techniką RP- TLC na płytkach aluminiowych
RP-18F254 (E. Merck, Art. 1.05559) przy użyciu mieszaniny: metanol-kwas octowy- woda w stosunkach objętościowych: 15:20:15,
30:5:15, 30:15:5, 10:30:10, 35:5:0, 25:5:20, 25:20:8, 22:22:5
i 25:20:5 (v/v/v) jako fazy ruchomej.
24
1. Gumińska M. Zarys biochemii ogólnej dla studentów
farmacji i analityki medycznej. Wydaw. Uniwersytetu
Jagiellońskiego Kraków 1998.
2. Radziwon A.I., Zarzycki P. K. Budowa, biosynteza oraz
zastosowanie kwasów żółciowych jako leków. Farm.
Pol. 2004; T. 60(18): 869-873.
3. Orłowski W. Nauka o chorobach wewnętrznych. T. VI.
Wydaw. PZWL Warszawa 1988.
4. Lorenc J. Kliniczne aspekty metabolizmu kwasów żółciowych. Diagn. Lab. 1996; 32: 285-295.
5. Scalia S. Bile acids separation. J. Chromatogr. B. 1985;
671: 299-317.
6. Pyka A., Dołowy M. Separation of selected bile acids by
TLC. III. Separation on various stationary phases. J. Liq.
Chromatogr. & Rel. Technol. 2004; 27(16): 2613-2623.
TLC. VII. Separation by reversed partition HPTLC. J. Liq.
TLC. II. One dimensional and two-dimensional TLC. J. Liq.
9. Dołowy M., Bat. B., Niestrój A. Application of NP-TLC with
densitometric detection for separation and quantitative analysis of unconjugated bile acids presented in human bile. J. Liq.
Chromatogr. Relat. Technol. 2009; 32 (1): 144-153.
10.Dołowy M. Badanie tożsamości kwasu ursodeoksycholowego w wybranych preparatach farmaceutycznych
techniką NP- TLC. Farm. Pol. 2008; T.64 (17): 753758.
11.Dołowy M. Rozdział mieszaniny wybranych kwasów
żółciowych techniką TLC na płytkach aluminiowych
pokrytych mieszaniną żelu krzemionkowego 60 i ziemi
okrzemkowej F254 impregnowanych kationami Cu[II],
Ni [II], Fe[II] oraz Mn[II]. Farm. Przegląd. Nauk. 2008;
2: 34-37.
12.Dołowy M. Chromatograficzna analiza jakościowa taurynowych połączeń wybranych kwasów żółciowych.
Aktualne problemy chemii analitycznej. 3 Seminarium
Naukowe. Wydaw. Górnośląskie Towarzystwo Przyjaciół Nauk im. W. Roździeńskiego. Katowice 2009: 19.
Małgorzata Dołowy
Zakład Chemii Analitycznej, Katedra Chemii Ogólnej i Analitycznej,
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej,
ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec,
25
Charakterystyka bakterii rodzaju Desulfovibrio
z uwzględnieniem ich potencjalnie patogennego wpływu
na organizm człowieka i zwierząt oraz możliwości leczenia
zakażeń wywołanych przez te mikroorganizmy
Characteristics of the Desulfovibrio genus with regard to its potential
pathogenic influence on human and animal body, and the possible
treatment of infections caused by these microorganisms
Joanna Szczerba, Arkadiusz Gruchlik, Zofia Dzierżewicz
Katedra i Zakład Biofarmacji,
Śląski Uniwersytet Medyczny
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Kierownik Katedry: Prof. Dr hab. Zofia Dzierżewicz
Streszczenie
Bakterie redukujące siarczany (BRS) należą do zróżnicowanej pod względem morfologii, aktywności metabolicznej oraz wymagań odżywczych grupy beztlenowych
mikroorganizmów charakteryzujących się zdolnością
przeprowadzania procesu dysymilacyjnej redukcji związków siarki. Izoluje się je z tak odmiennych środowisk,
jak np. jelito grube ssaków oraz z gleb i wód naturalnych.
Przez wiele lat BRS traktowano jako mikroorganizmy
środowiskowe, obecnie uważa się, że stanowią integralny składnik flory fizjologicznej jelita grubego, a ostatnio
w piśmiennictwie naukowym pojawiły się doniesienia
o ich obecności w jamie ustnej.
Spośród BRS rodzaj Desulfovibrio jest najlepiej poznanym i opisanym rodzajem ze względu na powszechność
jego izolacji z organizmu ludzkiego oraz potencjalnie
patogenny wpływ na człowieka oraz zwierzęta. Rodzaj
ten należy do podjednostki delta typu Proteobacteria,
a gatunki wchodzące w jego skład zaliczane są do bakterii
Gram-ujemnych, beztlenowych, charakteryzujących się
powolnym wzrostem w warunkach in vitro.
Ze względu na toksyczność siarkowodoru wydzielanego
przez bakterie rodzaju Desulfovibrio możemy domniemywać o ich szkodliwym wpływie na organizm człowieka.
Należy więc zastanowić się nad możliwością i zasadnością stosowania chemioterapeutyków zwalczających te
bakterie. Liczba publikacji uwzględniająca sposób zwalczania infekcji bakterii Desulfovibrio jest uboga, a poza
tym jest wiele rozbieżności w tym zakresie, jakkolwiek
wielu autorów wskazuje imipenem oraz metranidazol
jako chemioterapeutyki skuteczne w zwalczaniu bakterii
Desulfovibrio.
Słowa kluczowe: bakterie redukujące siarczany (BRS),
rodzaj Desulfovibrio, siarkowodór, patogen, metranidazol, imipenem
26
Summary
Sulphate-reducing bacteria (SRB) belong to the heterogeneous group of anaerobic microorganisms which differ in their morphology, metabolic activity and nutrients
requirements. They share ability to dissimilate sulphur
reducing. These bacteria have been isolated from such different sources as the digestive tract of mammalians and
the soil and aquatic habitats. SRB for many years were
consider as a environmental microorganisms, currently
are known that they common occur in the large bowel, as
well as, in the human oral cavity.
Bacteria of Desulfovibrio genus are the best known and
the most thoroughly studied among the SRB for the regard
of common isolation from human body and possible pathological influence on the human and animal organisms.
The Desulfovibrio bacteria belong to the delta subdivision
of Proteobacteria and the species of this genus are the
Gram negative, anaerobic, characterized by slow multiplication.
The toxicity of hydrogen sulphide and possibility of harmful influence on the human organism of Desulfovibrio genus suggest that it is worth consider the ability and the
purposefulness of treatment infections caused by these
bacteria.
There is a lot of discrepancies in rare literature concerning
of control of Desulfovibrio infections, but many authors
suggest the therapy with imipenem or metronidazole.
Key words: sulphate reducing bacteria (SRB), Desulfovibrio genus, hydrogen sulfide, pathogen, metronidazole,
imipenem
Bakterie redukujące siarczany
– ogólna charakterystyka
z uwzględnieniem miejsca ich występowania
Bakterie redukujące siarczany (BRS) to duża i zróżnicowana grupa beztlenowych mikroorganizmów, których cechą
wspólną jest zdolność dysymilacyjnej redukcji związków
siarki. Do grupy tych bakterii zaliczamy rodzaje: Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfomicrobium,
Desulfobacterium, Desulfomonas, Desulfobulbus, Dfesulfococcus, Desulfonema i Desulfosarcin, Thermodesulfobacterium (ryc. 1), różniące się morfologią, aktywnością metaboliczną, środowiskiem bytowania oraz zdolnością do wykorzystywania różnych źródeł węgla [1]. Różnice te wynikają
z charakteru zasiedlanych nisz przez poszczególne rodzaje.
BRS izolowane są z bardzo różnych środowisk począwszy
od jelita grubego ssaków [2], aż po miejsca pozbawione dostępu tlenu w obrębie gleby, błota [3], osadów przybrzeżnych i morskich [4, 5, 6] oraz osadów przy ujściach rzek [7].
Mikroorganizmy te występują również w wodach rzecznych
oraz morskich [8], a także mułach ściekowych [9], bagnach
i moczarach [10]. W organizmach żywych obecność BRS
odnotowuje się nie tylko w jelicie grubym człowieka [11,
12], ale także w jelicie grubym kotów [13], chomików, fretek [14], myszy [15], a nawet chrząszczy [16].
Rola BRS w środowisku naturalnym jest dobrze poznana i scharakteryzowana, natomiast ich funkcja w ekosystemie jelita grubego pozostaje nadal niewyjaśniona. Ponadto,
w literaturze pojawiają się coraz częściej doniesienia
o obecności tych bakterii w materiale klinicznym różnego
pochodzenia. Spośród BRS rodzaj Desulfovibrio jest najlepiej poznanym i opisanym ze względu na powszechność
jego izolacji z organizmu ludzkiego i zwierzęcego [1, 2, 17].
Celem niniejszego opracowania jest zwrócenie uwagi na
możliwość szkodliwego wpływu mikroorganizmów rodzaju
Desulfovibrio na organizm człowieka, a także na sposoby
eradykacji tych mikroorganizmów.
większości tych mikroorganizmów. Desulfovibrio spp. rosną
stosunkowo wolno, w warunkach in vitro, kolonie pojawiają
się w przeciągu 4-7 dni od posiewu na powierzchni agaru.
Trudno je zidentyfikować i łatwo je przeoczyć w kulturach
mieszanych.
Komórki bakterii Desulfovibrio występują zwykle pojedynczo, ale w pewnych stadiach wzrostu mogą tworzyć formy łańcuchów złożonych od dwóch do kilku komórek [23].
Najczęściej mają zakrzywiony lub przecinkowaty kształt
z polarnie wyrastającą wicią bez osłonki [24, 25]. Charakteryzują się obecnością desulfowirydyny, niezdolnością do wytwarzania spor [26] oraz dużą ruchliwością [23]. Długość komórek
waha się w granicach 2-4 µm, a średnica 0.75-1.0 µm [27].
Potencjał patogenny
rodzaju Desulfovibrio
W 1974 roku Moore i wsp. [28] oraz Beerens i Romond
[29] opisali przypadki obecności BRS w jelicie grubym
człowieka, gdzie Desulfovibrio desulfuricans był gatunkiem dominującym. Od początku lat dziewięćdziesiątych
ubiegłego wieku zaczęło się pojawiać coraz więcej doniesień dotyczących obecności bakterii Desulfovibrio w jelicie grubym [11, 30], a występowanie siarczków w kale
oraz siarkowodoru w gazach jelitowych zaczęto łączyć
z zależnym od Desulfovibrio procesem dysymilacyjnej redukcji siarczanów.
Na podstawie dotychczas opublikowanych prac trudno
jest jednoznacznie orzec o konsekwencjach aktywności metabolicznej bakterii rodzaju Desulfovibrio w jelicie grubym,
jednak główny produkt dysymilacyjnej redukcji siarczanów to
jony S2-, które w postaci siarkowodoru H2S są wysoce toksyczne dla organizmów żywych. W środowisku wodnym tworzą
trudno rozpuszczalne sole z jonami metali ciężkich, nierzadko
o budowie krystalicznej, mogące mechanicznie drażnić śluzówkę jelita. Ponadto H2S może zaburzać metabolizm komórek nabłonkowych jelita grubego, hamując β-oksydację kwasu
n-masłowego, będącego ich podstawowym źródłem ener-
Cechy charakterystyczne
rodzaju Desulfovibrio
Rodzaj Desulfovibrio należy do podjednostki delta typu Proteobacteria [18, 19] do
którego zalicza się około 30 gatunków, między innymi: D. desulfuricans, D. vulgaris,
D. salexigens, D. africanus, D. gigas,
D. baculatus, D. sapovorans, D. baarsii, D. thermophilus, D. fairfieldensis,
D. gabonensis, D. piger, D. profundus,
D. aosterae, D. burkinensis, D. longus,
D. orale oraz D. aespoeensis [2].
Bakterie rodzaju Desulfovibrio zaliczane są do beztlenowych, Gram-ujemnych
bakterii, charakteryzujących się zdolnością przeżycia przy krótkotrwałej ekspozycji na tlen [20]. Cypionka [21] oraz
Morgensen i wsp. [22] twierdzą nawet, iż
niektóre gatunki są zdolne redukować tlen,
jakkolwiek, w czystych kulturach pierwiastek ten hamuje lub uniemożliwia wzrost
Ryc. 1. Zależności filogenetyczne bakterii redukujących siarczany (BRS) oparte na
analizie sekwencji genu 16S rRNA ([23]; w modyfikacji własnej).
27
gii [31, 32]. Konsekwencją tego procesu jest zahamowanie
syntezy lipidów, mucyny oraz upośledzenie mechanizmów
detoksykacyjnych, co pośrednio może odgrywać istotna rolę
w inicjacji i prolongacji stanów zapalnych w obrębie jelita
grubego [32].
Gibson i wsp. [30] wykazali, iż rodzaj Desulfovibrio
stanowi około 66% całej populacji BRS u osób zdrowych
i około 92 % u osób z wrzodziejącym zapaleniem okrężnicy.
Na podstawie swoich badań wysunęli hipotezę, iż bakterie
tego rodzaju mogą brać udział w etiopatologii wrzodziejącego zapalenia jelita grubego i choroby Crohna. Również
Loubinox i wsp. [36] stwierdzili, iż liczebność gatunku Desulfovibrio piger była znacząco większa (55%) wśród pacjentów cierpiących na wrzodziejące zapalenie okrężnicy
w porównaniu do osób zdrowych (12%). Natomiast Pitcher
i wsp. [32] nie odnotowali istotnych różnic w liczebności
BRS zasiedlających jelito grube pacjentów z wrzodziejącym
zapaleniem okrężnicy oraz jelito osobników zdrowych. Ci
sami autorzy sugerują, iż potencjał patogenny może zależeć
od szczepu oraz jego aktywności metabolicznej. Wykazali, że wśród pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita
grubego dominują szybko rosnące szczepy Desulfovibrio
desulfuricans. Zinkovich i Beech [34] również uważają, że
udział BRS we wrzodziejącym zapaleniu okrężnicy może
mieć związek z fizjologicznymi różnicami pomiędzy szczepami należącymi do tego samego gatunku.
Nadal nie wiadomo czy BRS są bezpośrednią przyczyną
schorzeń jelita grubego czy przyczyniają się do ich chronicznego przebiegu [37]. Wyjaśnienie roli jaką BRS pełnią
w okrężnicy jest niezmiernie ważne, ze względu na fakt, iż
choroby jelita grubego zajmują jedno z czołowych miejsc
wśród dolegliwości związanych z układem pokarmowym,
szczególnie w krajach wysokorozwiniętych.
Jelito grube nie jest jedynym miejscem bytowania BRS
w ciele człowieka, bakterie te izoluje się także z materiału klinicznego różnego pochodzenia. Porschen i Chan [35]
wyizolowali bakterie rodzaju Desulfovibrio z dróg żółciowych pacjenta z posocznicą. Lozniewski i wsp. [36] opisał
przypadek izolacji gatunku rodzaju Desulfovibrio z ropnia
mózgu, a Tee i wsp. [26] z ropnia wątroby (ryc. 2). BRS
wyosobniono również z ropni jamy brzusznej [1] oraz wyrostka robaczkowego z przewlekłym stanem zapalnym [37]
(ryc. 2). Stosunkowo często odnotowywane są przypadki
bakteriemii wywołane zakażeniami Desulfovibrio, najczęściej z powodu obecności we krwi gatunku D. fairfieldensis
[17, 27, 38, 39]. Goldstein i wsp. [2] stwierdzili przypadek
bakteriemii u człowieka, a Shukla i Reed [25] u psa, wywołany przez D. desulfuricans.
W piśmiennictwie pojawia się coraz więcej doniesień
o obecności BRS w jamie ustnej człowieka [40-47]. Lotne
związki siarki (siarkowodór, siarczek dimetylu, merkaptan
metylu) wydzielane przez BRS mogą być przyczyną nieświeżego oddechu, co jest głównym objawem halitozy [44].
Bardzo prawdopodobne jest również, iż BRS mogą należeć do czynników etiologicznych w chorobach przyzębia,
a zwłaszcza parodontozie [42, 43, 46-50]. Boopathy i wsp. [42]
u osób z zaawansowaną parodontozą, z tkanek poddziąsłowych, wyizolowali czystą kulturę bakterii rodzaju Desulfovibrio. Również Lagendijk i wsp. [46] wyodrębnili 10 różnych
szczepów BRS od osób cierpiących na tą chorobę. Loubinoux
28
Ryc. 2. Miejsca izolacji bakterii Desulfovibrio z organizmu ludzkiego
z podaniem dat publikacji, które ukazały się w bazie PubMed
i wsp. [44] uzyskali osiem różnych izolatów BRS z kieszonek przydziąsłowych od pięciu z siedmiu badanych pacjentów. Wyizolowane szczepy zaliczono do Desulfovibrio
fairfirldensis, które wraz z Desulfomicrobium orale są najczęściej izolowanymi BRS od osób cierpiących z powodu
parodontozy. Lagendjik i wsp. [50] oraz Vianna i wsp. [47]
zaobserwowali korelację pomiędzy ilością BRS, a krwawiącymi kieszonkami dziąsłowymi z kątowym ubytkiem kości,
jak również głębokością samych kieszonek. Zmniejszenie
krwawienia oraz redukcję głębokości kieszonek zaobserwowano po eliminacji BRS [48].
Reasumując, bakterie rodzaju Desulfovibrio możemy
rozpatrywać jako potencjalne patogeny, a zwłaszcza gatunki
,takie jak: D. piger, D. fairfieldensis oraz D. desulfuricans
[1, 2, 17, 33]. Według Schoenborn i wsp. [24] mogą one należeć do tzw. oportunistycznych patogenów, dla których najważniejszym czynnikiem umożliwiającym im przetrwanie
w zainfekowanych tkankach jest ich względna tolerancja na
tlen.
Warto także podkreślić, że udział BRS w infekcjach jest
nadal niedoszacowany z powodu powolnego wzrostu kolonii tych bakterii w hodowlach in vitro oraz trudnej ich identyfikacji. Dalsze badania mające na celu cenę roli tych mikroorganizmów w różnego rodzaju infekcjach są konieczne,
a coraz prężniej rozwijająca się biologia molekularna stwarza
możliwość łatwej, szybkiej i wiarygodnej ich identyfikacji.
Lipopolisacharydy jako jeden
z czynników wirulencji
bakterii Desulfovibrio
Integralnym składnikiem błony zewnętrznej bakterii
Gram-ujemnych, w tym również rodzaju Desulfovibrio, jest
kompleks lipopolisacharydowy (LPS) zwany także endotok-
syną. LPS jest immunogenem stymulującym uwalnianie cytokin, chemokin, cząsteczek adhezyjnych oraz reaktywnych
form tlenu przez komórki układu odpornościowego. Wysokie stężenia LPS-ów oddziaływują negatywnie na organizm
człowieka. Mogą indukować procesy zapalne, powodować
hiperglikemię, hipotensję, odczyn Schwartzmana, nekrozę
komórek szpiku kostnego, leukopenię czy leukocytozę, a po
przedostaniu się do krwi wstrząs septyczny [51].
Stosunkowo niewiele wiadomo o wpływie endotoksyn
bakterii Desulfovibrio na organizm człowieka i zwierząt.
Dzierżewicz i wsp. [51] wykazali obniżenie aktywności
metabolicznej oraz zahamowanie wzrostu komórek fibroblastów linii V-79 izolowanej od chomika chińskiego pod
wpływem LPS-ów bakterii D. desulfuricans. Dłuższa inkubacja prowadziła do apoptozy tych fibroblastów, zatem lipopolisacharydy BRS mogą oddziaływać na wewnątrzkomórkowe procesy związane z odnową i proliferacją komórek.
Węglarz i wsp. [52, 53] udokumentowali wpływ LPS-ów
D. desulfuricans na zwiększoną sekrecję IL-6 oraz IL-8
w transformowanych komórkach nabłonkowych linii Caco-2.
Ponieważ istnieje wyraźny związek pomiędzy zjadliwością bakterii, a budową ich lipopolisacharydów, określenie
struktury endotoksyn bakterii Desulfovibrio pomogłoby
uzupełnić wiedzę o ich wpływie na organizm ludzki. Integralną częścią lipopolisacharydów jest lipid A. Aktywność
biologiczna endotoksyn zależy w bardzo dużym stopniu od
konformacji tego lipidu, a zwłaszcza rozmieszczenia reszt
kwasów tłuszczowych w jego obrębie. Nie bez znaczenia
jest także struktura regionu rdzeniowego oraz łańcucha
O-swoistego. Mutanty pozbawione łańcucha O-swoistego cechuje mniejsza patogenność w stosunku do posiadających go
tzw. form gładkich. Istnieje niewiele publikacji dotyczących
struktury LPS-ów bakterii Desulfovibrio. Gaylarde i Beech
[54] odkryli, że w skład lipidu A wchodzi kwas heptadecenowy, oktadec-8-enowy, oktadec-9-enowy, oktadec-10-enowy,
ejkozenowy, tetrakozenowy, a łańcuch O-swoisty tworzą:
ramnoza, glukoza, galaktoa, mannoza i ryboza. Lodowska
i wsp. [55] wykryli podobne cukry prócz rybozy w łańcuchu
O-swoistym LPS-u D. desulfuricans, przy czym, największy
udział procentowy przypadał dla galaktozy i ramnozy. Według Lodowskiej i wsp. [55] ryboza wykryta przez Gaylarde
i Beech [54] pochodziła najprawdopodobniej z zanieczyszczeń LPS-ów kwasami nukleinowymi. Lodowska i wsp.
[56], wykazali obecność kwasu 2-keto-3-deoksyoktonowego
(KDO), cząsteczki która łączy lipid A z łańcuchem
O-swoistym, który na podstawie swoich badań wykluczyli
Gaylarde i Beech [54]. Wychodząc z założenia, iż KDO jest
niestabilny i ulega rozkładowi podczas procesu derywatyzacji, Lodowska i wsp. [56] ocenili jego zawartość metodą spektrofotometryczną, potwierdzając otrzymany wynik
dodatkowo chromatografią gazową. W każdym z badanych
LPS-ów obecny był KDO, przy czym endotoksyny różnych izolatów różniły się jego zawartością (w zakresie od
0,48% do 2,86% suchej masy lipopolisacharydu). Autorzy
uważają również, że badane endotoksyny różnią się liczbą
podjednostek cukrowych budujących łańcuchy O-swoiste,
co zostało potwierdzone elektroforetycznie [51]. Warto
także podkreślić, iż wrażliwość na antybiotyki bakterii
Gram-ujemnych jest skorelowana z długością łańcucha
O-swoistego endotoksyny.
Możliwości leczenia zakażeń
wywołanych przez bakterie Desulfovibrio
Bakterie z rodzaju Desulfovibrio można zaliczyć do tzw.
bakterii oportunistycznych, które podczas spadku odporności mogą być przyczyną powstawania stanów zapalnych lub
bakteriemii. Ponadto udowodniono ich niekorzystny wpływ
na funkcjonowanie komórek nabłonkowych jelita [2, 17, 26,
36, 38, 39].
Ze względu na wydzielenie przez Desulfovibrio spp.
toksycznych związków siarki, w tym przede wszystkim siarkowodoru, możemy wnioskować, iż bakterie te mogą mieć
niekorzystny wpływ na zdrowie człowieka, a zwłaszcza ich
zwiększona populacja w jelicie grubym i w jamie ustnej.
W związku z tym, warto zastanowić się nad możliwością
i zasadnością stosowania chemioterapeutyków zwalczających te bakterie lub ograniczających ich rozwój.
Jednym z podstawowych leków stosowanych w chorobach zapalnych jelita, takich jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego czy choroba Crohna jest należąca do proleków
sulfasalazyna (SAS). Po dostaniu się do jelita, dzięki aktywności bytujących tam bakterii, dochodzi do redukcji wiązania azowego w obrębie SAS. Produktami tej reakcji są kwas
5-aminosalicylowy (5-ASA) i sulfapirydyna (SP). West
i wsp. [58] oraz Pitcher i wsp. [32] zaobserwowali, iż
5-ASA hamował syntezę siarkowodoru w okrężnicy. Efekt
ten prawdopodobnie nie był związany z zahamowaniem
wzrostu i proliferacji BRS, a jedynie z zahamowaniem
ich zdolności do redukcji nieorganicznych związków siarki [32]. Zmniejszenie wydzielania siarkowodoru o prawie
90% zaobserwowano przy stężeniach 1mM i 5mM sulfasalazyny oraz przy 20mM stężeniu jej metabolitu 5-ASA
[59]. Szczepy Desulfovibrio desulfuricans izolowane
z przewodu pokarmowego człowieka okazały się wrażliwe na SAS oraz kwas 5-aminosalicylowy. Badane izolaty
różniły się stopniem wrażliwości na wspomniane terapeutyki. SAS skuteczniej hamowała podziały bakterii niż
5-ASA. Sulfapirydyna natomiast nie wykazywała żadnego
negatywnego działania w stosunku do badanych szczepów
D. desulfuricans [60].
Stosunkowo mało wiadomo na temat wrażliwości
bakterii rodzaju Desulfovibrio na powszechnie stosowane leki przeciwdrobnoustrojowe. Generalnie leczenie infekcji wywołanych przez bakterie beztlenowe jest
niezwykle trudne. Aminoglikozydy, połączenie trimetoprimu z sulfametoksazolem, większość chinolonów oraz
monobaktamów słabo oddziałuje na bakterie anaerobowe [61]. W związku z pojawiającymi się publikacjami
o szkodliwym wpływie bakterii Desulfovibrio na organizm
człowieka zaczęto badać te drobnoustroje pod kontem ich
wrażliwości na antybiotyki, aby ustalić możliwości ich
zwalczania. Szczepy D. fairfieldensis okazały się wrażliwe
na imipenem, metrodidazol [17, 62], ciprofloksacynę, chloramfenikol oraz klindamycynę [2], natomiast penicylina G,
piperacylina oraz cefoksytyna nie miały żadnego wpływu
na te bakterie [17]. Zbadano również wrażliwość większości szczepów jelitowych z gatunku D. desulfuricans na powszechnie stosowane chemioterapeutyki. Dzierżewicz i wsp.
[57] zaobserwowali oporność wszystkich badanych izolatów na penicylinę, cefoksytynę, klindamycynę, metronida-
29
zol, erytromycynę, rifampicynę oraz teicoplanin. Większość
z nich była wrażliwa na tikarcylinę, mezlocylinę, piperacylinę, cefoperazon, chloramfenikol, ampicylinę, cefotaksim
i moksalaktam, a tylko niektóre na amoksycylinę, cefamandol, cefotetan, ceftyzoksym, tetracyklinę oraz wankomycynę. Ponadto odnotowano, iż doksycyklina daje dobre efekty
w zwalczaniu infekcji wywołanych przez bakterie rodzaju
Desulfovibrio [2, 25], natomiast są one oporne na kolistynę
[1]. Według Warren’a i wsp. [1] opornośc na kolistynę jest
cechą charakterystyczną dla Desulfovibrio i pozwala łatwo
go odróżnić od fenotypowo podobnych rodzajów, takich
jak: Campylobacter czy Bilophila.
Z uwagi na problem, jakim jest szybko rosnąca oporność
bakterii na antybiotyki, zaleca się rozsądne i przemyślane
ich stosowanie. Bakterie Desulfovibrio niejednokrotnie
były jedyną przyczyną powstawania stanów zapalnych lub
bakteriemii u ludzi i zwierząt [1, 2, 20, 28, 29, 30, 41, 42]
w związku z czym w pewnych wypadkach, jeśli grożą poważne konsekwencje kliniczne wydaje się uzasadnione ich
zwalczanie przy użyciu antybiotyków.
Piśmiennictwo:
1. Warren Y.A., Citron D.M., Merriam C.V., Goldstein E.J.:
Biochemical differentiation and comparison of Desulfovibrio species and other phenotypically similar genera.
J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 4041-4045.
2. Goldstein E.J.C., Citron D.M., Peraino V.A., Cross S.A.:
Desulfovibrio desulfuricans bacteremia and review of human Desulfovibrio infections. J. Clin. Microbiol. 2003; 41:
2752-2754.
3. Postgate J.R.: The sulphate reducing bacteria. Cambridge Univ. Press. 1984.
4. Haouari O., Fardeau M.L., Casalot L., Tholozan J.L.,
Hamdi M., Ollivier B.: Isolation of sulfate-reducing bacteria from Tunisian marine sediments and description of
Desulfovibrio bizertensis sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006; 56: 2909-2913.
5. Bottcher M., Hespenheide B., Brumsack H.J., Bosselmann K.: Stable isotope biogeochemistry of the sulfur
cycle in modern marine sediments: I. Seasonal dynamics
in temperate intertidal sandy surface sediment. Isotopes
Environ. Health Stud. 2004; 40: 267-283.
6. Perez-Jimenez J.R., Kerkhof L.J.: Phylogeography of sulfate-reducing bacteria among disturbed sediments disclosed by analysis of the dissimilatory sulfite reductase genes
(dsrAB). Appl. Environ. Microbiol. 2005; 71: 1004-1011.
7. Boyle A., Phelps C.D., Young L.Y.: Isolation from estaurine sediments of Desulfovibrio strain which can grow
on lactate coupled to the reductive dehalogenation of
2,4,6-tribromophenol. Appl. Environ. Microbiol. 1999;
65: 1133-1140.
8. Nercessian O., Bienvenu N., Moreira D., Prieur D., Jeanthon C.: Diversity of functional genes of methanogens,
methanotrophs and sulfate reducers in deep-sea hydrothermal environments. Environ. Microbiol. 2005; 7:
118-132.
9. Campbell L.L., Postgate, J.R. : Classification of the spore forming sulfate-reducing bacteria. Bac. Rev. 1965; 29:
359-363.
30
10.Edgcomb V.P., Mc Donald J.H., Devereux R., Smith
D.W.: Estimation of bacterial cell numbers in humic
acid-rich salt marsh sediments with probes directed to
16S ribosomal DNA. Appl. Environ. Microbiol. 1999;
65: 1516-1523.
11.Gibson G.R., Macfarlane G.T., Cumming J.H.: Occurrence of sulphate–reducing bacteria in human faeces
and the relationship of dissimilatory sulphate reduction
to methanogenesis in the large gut. J. Appl. Bacteriol.
1988; 65: 103 – 111.
12.Dzierżewicz Z., Cwalina B., Gawlik B., Wilczok T.,
Gonciarz Z.: Isolation and evaluation of susceptibility
to sulphasalazine of Desulfovibrio desulfuricans strains from the human digestive tract. Acta Microbiol. Pol.
1997; 46: 175 – 187.
13.Inness V.L., McCartney A.L., Khoo C., Gross K.L.,
Gibson G.R.: Molecular characterisation of the gut
microflora of healthy and inflammatory bowel disease cats using fluorescence in situ hybridisation with special reference to Desulfovibrio spp.:
J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 2007; 91: 48-53.
14.Fox J.G., Dewhirst F.E., Fraser G.J., Paster B.J., Shames B., Murphy J.C.: Intracellular Campylobacter – like
organism from ferrets and hamsters with proliferative
bowel disease is a Desulfovibrio sp. J. Clin. Microbiol.
1994; 32: 1229 – 1237.
15.Deplancke B., Hristova K. R., Oakley H. A., McCracken
V. J., Aminov R., Mackie R.I., Gaskons H. R.: Molecular ecological analysis of the succesion and diversity of
sulfate–reducing bacteria in the mouse gastrointestinal
tract. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 66: 2166 – 2174.
16.Droge S., Limper U., Emtiazi F., Schonig I., Pavlus N.,
Drzyzga O., Fischer U., Konig H.: In vitro and in vivo
sulfate reduction in the contents of the termite Mastotermes darwiniensis and the rose-chafer Pachnoda marginata. J. Gen. Appl. Microbiol. 2005; 51: 57-64.
17.Loubinoux J., Mory F., Pereira I. A. C., La Faou A. E.:
Bacteremia caused by a strain of Desulfovibrio related to
the previsionally named Desulfovibrio fairfieldensis. J.
Clin. Microbiol. 2000; 38: 931-934.
18.Ito T., Nielsen J.L., Okabe S., Watanabe Y., Nielsen P.H.:
Phylogenetic identification and substrate uptake patterns
of sulfate-reducing bacteria inhabiting an oxic-anoxic
sewer biofilm determined by combinating microautoradiography and fluorescent in situ hybridization. Appl.
Environ. Microbiol. 2002; 68: 356- 364.
19.Devereux R., Delaney M., Widdel F., Stahl D.A.: Genus
and group-specific hybridization probes for determinative and environmental studies of sulphate-reducing bacteria. Syst. Appl. Microbiol. 1992; 15 : 601-609.
20.Lobo S.A., Melo A.M., Carita J.N., Teixeira M., Saraiva
L.M.: The anaerobe Desulfovibrio desulfuricans ATCC
27774 grows at nearly atmospheric oxygen levels. FEBS
Lett. 2007; 6: 433-436.
21.Cypionka H.: Oxygen respiration by desulfovibrio species. Annu. Rev. Microbiol. 2000; 54: 827-848.
22.Morgensen G.L., Kjeldsen K.U., Ingvorsen K.: Desulfovibrio aerotolerans sp. nov., an oxygen tolerant sulphate-reducing bacterium isolated from activated sludge.
Anaerobe. 2005; 11: 339-349.
23.Feio M.J., Beech I.B., Carepo M., Lopes J.M., Cheung
C.W.S., Franco R., Guezennec J., Smith J.R., Mitchell
J.I., Moura J.J. G., Lino A.R.: Isolation and characterisation of novel sulphate–reducing bacterium of the Desulfovibrio genus. Anaerobe. 1998; 4: 117 – 130.
24.Schoenborn L., Abdollahi H., Tee W., Dyall-Smith M.,
Janssen P.H.: A member of delta subgroup of Proteobacteria from a pyogenic liver abscess is a typical sulfate reducer of the genus Desulfovibrio. J. Clin. Microbiol. 2001;
39: 787 – 790.
25.Shukla S.K., Reed K.D.: Desulfovibrio desulfuricans
bacteremia in a dog. J. Clin. Microbiol. 2000; 38:
1701 – 1702.
26.Tee W., Dyall–Smith M., Woods W., Eisen D.: Probable
new species of Desulfovibrio isolated from a pyogenic
liver abscess. J. Clin. Microbiol. 1996; 34: 1760–1764.
27.McDougall R., Robson J., Peterson D., Tee W.: Bacteremia caused by a recently described novel Desulfovibrio
species. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 1805 – 1808.
28.Moore W.E.C., Holdeman L.V.: Human fecal flora: the
normal flora of 20 Japanese-Hawaiians. Appl. Microbiol. 1974; 27: 961-979.
29.Beerens H., Romond C.: Sulfate-reducing bacteria in human feces. Amer. J. Clin. Nutr. 1977; 30: 1770 – 1776.
30.Gibson G.R., Cumming J.H, Macfarlane G.T.: Growth
and activities of sulphate reducing bacteria in gut contents of healthy subjects and patients with ulcerative colitis. FEMS Microbiol. Ecol. 1991; 86: 103 – 112.
31.Ohge H., Furne J.K., Springfield J., Rothenberger
D.A., Madoff R.D., Levitt M.D.: Association between fecal hydrogen sulfide production and pouchitis.
Dis. Colon Rectum. 2005; 48: 469-475.
32.Pitcher M.C.L., Beatty E.R., Cummings J.H.: The contribution of sulphate reducing bacteria and 5–aminosalicylic
acid to faecal sulphide in patients with ulcerative colitis.
Gut. 2000; 46: 64 – 72.
33.Loubinoux J., Bronowicki J-P., Pereira I.A.C., Mougenel
J-L., Le Faou A.E.: Sulfate-reducing bacteria in human
feces and their association with inflammatory bowel diseases. FEMS Microbiol. Ecol. 2002; 40: 107-112.
34.Zinkovich V. i Beech I.B.: Screening of sulfate-reducing
bacteria in colonoscopy samples from healthy and colitic
human gut mucosa. FEMS Microbiol. Ecol. 2000; 34:
147-155.
35.Porschen R.K., Chan P.: Anaerobic vibrio–like organisms cultured from blood: Desulfovibrio desulfuricans
and Succinivibrio species. J. Clin. Microbiol. 1977;
5: 444 – 447.
36.Lozniewski A., Maurer P., Schuhmacher H., Carlier J.P.,
Mory F.: First isolation of Desulfovibrio sp. as part of
a polymicrobial infection from a brain abscess. Eur. J.
Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1999; 18: 602-603.
37.Baron E. J., Bennion R., Thompson J., Strong C., Summanen P., McTeagne M., Finegold S. M.: A microbiological comparison between acute and complicated appendicitis. Clin. Infect. Dis. 1992; 14: 227 – 231.
38.Pimentel J.D., Chan R.C.: Desulfovibrio fairfieldensis
bacteremia associated with choledocholithiasis and endoscopic retrograde cholangiopancreatography. J. Clin.
Microbiol. 2007; 45: 2747-2750.
39. Urata T., Kikuchi M., Hino T., Yoda Y., Tamai K., Ko-
daira Y., Hitomi S.: Bacteremia caused by Desulfovibrio
fairfieldensis. J. Infect. Chemother. 2008; 14: 368-370.
40.Willis C.L. Gibson G.R., Allison C., MacFarlane S.,
Holt J.S.: Growth, incidence and activities of dissimilatory sulfate-reducing bacteria in the human oral cavity.
FEMS Microbiol. Lett. 1995; 129: 267-272.
41.Van der Hoeven J.S., van den Kieboom C.W., Schaeken
M.J.: Sulfate-reducing bacteria in the periodontal pocket.
Oral. Microbiol. Immunol. 1995; 10: 288-290.
42.Boopathy R., Robichaux M., LaFont D., Howell M.: Activity of sulfate-reducing bacteria in human periodontal
pocket. Can. J. Microbiol. 2002; 48: 1099-1103.
43.Langendijk P.S., Kulik E.M., Sandmeier H., Meyer J.,
Van der Hoeven J.S.: Isolation of Desulfomicrobium
orale sp nov and Desulfovibrio strain NY682, oral
sulfate–reducing bactera involved in human peridontal disease. Intern. J. Sys. Evol. Microbiol. 2001; 51 :
1035 – 1044.
44.Loubinoux J., Bisson-Boutelliez C., Miller N., Le Faou
A.E.: Isolation of the provisionally named Desulfovibrio fairfieldensis from human periodontal pockets.
Oral Microbiol. Immunol. 2002; 17: 321-323.
45.Robichaux M., Howell M., Boopathy R.: Growth and activities of sulfate-reducing and methanogenic bacteria in
human oral cavity. Curr Microbiol. 2003; 47: 12-16.
46.Langendijk P.S., Grimm W.D., van der Hoeven J.S.:
Sulfate-reducing bacteria in relation with other potential
periodontal pathogens. J. Clin. Periodontol. 2001; 28:
1151-1157.
47.Vianna M.E., Holtgraewe S., Seyfarth I., Conrads G.,
Horz H.P.: Quantitative analysis of three hydrogenotrophic Microbial Groups, methanogenic archea, Sulfatereducing bacteria and acetogenic bacteria within plaque
biofolms associated with human periodontal disease. J.
Bacteriol. 2008; 190: 3779-3785.
48.Langendijk P.S., Hanssen J.T.J., van der Hoeven J.S.:
Decrease of sulfate-reducing bacteria after initial periodontal treatment. J. Dent. Res. 2001; 80: 1637-1642.
49.Grimm W.D., Cichon P., van der Hoeven J.S., Langendijk P.S., Smith F., Worley M.G., Schmitz I., Offenbacher S.: The influence of sulfate-reducing bacteria colonization of 2 different bioresorbable barrier membranes
for GTR. An 18-month case-controlled microbiologic
and clinical study. Int. J. Periodontics Restorative Dent.
2000; 20: 91-99.
50.Langendijk P.S., Hanssen J.T.J., van der Hoeven J.S.:
Sulfate-reducing bacteria in association with human periodontitis. J.Clin. Periodontol. 2000; 27:943-950.
51.Dzierżewicz Z., Orchel A., Komarska-Szostak J.,
Wawszczyk J., Węglarz L., Szczerba J., Wilczok T.:
Biological activity of endotoxins isolated from Desulfovibrio desulfuricans. Ann. Acad. Med. Siles. 2005;
59: 9-16.
52.Węglarz L., Dzierżewicz Z., Skop B., Orchel A., Parfiniewicz B., Wiśniowska B., Światkowska L., Wilczok T.:
Desulfovibrio desulfuricans lipopolysaccharides induce
endothelial cell IL-6 and IL-8 secretion and E-selectin
and VCAM-1 expression. Cell Mol. Biol. Lett. 2003; 8:
991-1003.
31
53.Węglarz L., Wawszczyk J., Orchel A., Jaworska-Kik M.,
Dzierżewicz Z.: Phytic acid modulates in vitro IL-8 and
IL-6 release from colonic epithelial cells stimulated with
LPS and IL-1 beta. Dig. Dis. Sci. 2007; 52: 93-102.
54.Gaylarde C.C., Beech I.B.: Short communication: Lipopolysaccharide composition of Desulfovibrio cell wall.
World J. Microb. Biot. 1996; 12:113-114.
55.Lodowska J., Wolny D., Jaworska-Kik M., Węglarz L.,
Dzierżewicz Z., Wilczok T.: Composition of the polysaccharide component of the endotoxin from the intestinal
strain of Desulfovibrio desulfuricans. Ann. Pol. Chem.
Soc. 2003; 2: 299-303.
56. Lodowska J., Wolny D., Jaworska-Kik M., Dzierżewicz Z., Węglarz L.: Interstinal diversity of 2-keto-3deoxyoctonate content in lipopolysaccharides of Desulfovibrio desulfuricans. Pol. J. Microb. 2009; 1 (in press).
57.Dzierżewicz Z., Cwalina B., Jaworska-Kik M., Węglarz
L., Wilczok T.: Susceptibility to antybiotics and biochemical properties of Desulfovibrio desulfuricans strains.
Acta Pol. Pharm.–Drug Res. 2001; 58: 439-444.
Dr Joanna Szczerba
Katedra i Zakład Biofarmacji
ul. Narcyzów 1
41-200 Sosnowiec
32
58.West B., Lendrum R., Walker G.: Effect of sulphasalazine (salazopyrin) on fecal flora in patients with inflammatory bowel disease. Gut. 1974; 15: 900-905.
59.Edmond L.M., Hopkins M.J., Magee E.A., Cummings
J.H.: The effect of 5-aminosalicylic acid-containing
drugs on sulfide production by sulfate-reducing and amino acid-fermenting bacteria. Inflamm. Bowel Dis. 2003;
9: 10-17.
60.Dzierżewicz Z., Cwalina B., Węglarz L., Wiśniowska
B., Szczerba J.: Susceptibility of Desulfovibrio desulfuricans intestinal strains to sulfasalazine and its biotransformation products. Med. Sci. Monit. 2004; 10:
185-190.
61.Finegold S.M., Wexler H.M.: Present studies of therapy for anaerobic infections. Clin. Infect. Dis. 1996; 23
(suppl. 1): 9-14.
62.Lozniewski A., Labia R., Haristoy X., Mory F.: Antimicrobial susceptibilities of clinical Desulfovibrio
isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 2001; 45:
2933-2935.
Zawartość selenu w roślinnych surowcach leczniczych
i jego relacje z wybranymi pierwiastkami
Content of selenium in medicinal plant raw materials
and its relation with selected elements
Beata Ulewicz-Magulska, Marek Wesołowski
Katedra i Zakład Chemii Analitycznej,
Gdański Uniwersytet Medyczny
Kierownik Katedry i Zakładu: Prof. dr hab. Marek Wesołowski
Streszczenie
Nieustające zainteresowanie roślinami leczniczymi jako
potencjalnymi lekami wspomagającymi powoduje, że
określenie w nich rodzaju i zawartości biogennych pierwiastków jest zagadnieniem ważnym i wciąż aktualnym.
Z tego względu celem pracy było rozpoznanie poziomu
selenu w roślinnych surowcach leczniczych z uwzględnieniem wpływu gatunku oraz organu rośliny na poziom
tego pierwiastka. Istotne było także określenie relacji pomiędzy zawartością selenu a wybranymi biopierwiastkami – miedzią, manganem, cynkiem i żelazem.
W wyniku przeprowadzonych analiz 148 roślinnych surowców leczniczych (ziół, liści, kwiatów, korzeni oraz
owoców i nasion), pochodzących od 44 gatunków roślin
stwierdzono, że ilość selenu w surowcach roślinnych waha
się w graniach od kilku do kilkunastu lub kilkudziesięciu
nanogramów w gramie suchej masy surowca. Zidentyfikowano kilka surowców, w których poziom selenu przekroczył 100 ng/g. Biorąc pod uwagę średnią zawartość selenu w poszczególnych grupach surowców stwierdzono,
że najwięcej zawierały go owoce i nasiona, a następnie
zioła, liście, kwiaty i korzenie.
Porównując średnią zawartość oznaczanych pierwiastków
w badanych surowcach stwierdzono, że w przypadku manganu, cynku i żelaza najbogatsze ich źródło stanowią liście i zioła,
najuboższe zaś owoce i nasiona. Najwyższe średnie stężenie
miedzi stwierdzono w kwiatach, natomiast zioła i liście charakteryzowały się niższą średnią zawartością tego pierwiastka.
Analiza korelacji wskazała na istnienie kilku par pierwiastków, które korelują w największym stopniu, tj. Cu-Zn
i Fe-Zn w owocach i nasionach, Mn-Zn w ziołach, FeCu w liściach oraz ujemną korelację Se-Cu w korzeniach.
Z kolei analiza głównych składowych (PCA) i analiza skupień (CA) umożliwiły identyfikację surowców roślinnych
o zbliżonym składzie pierwiastkowym. Skupienia tworzą
często surowce pochodzące z tego samego gatunku rośliny leczniczej, a także surowce pochodzące od gatunków
roślin należących do tej samej rodziny, jak np. liść jeżyny
i maliny.
Summary
The elemental composition of medicinal plants is now very
often an object of study. Because drugs of plant origin or
herbal species are now commonly used, they can been additional source of macro- and microelements in everyday
diet. The purpose of this study was to determine the content
and distribution of selenium in commercial plant raw materials used in medicine. Very important matter was also to
evaluate the relationship between levels of selenium and
copper, manganese, zinc and iron.
As the results of analysis of 148 samples of medicinal raw
plant materials (herbs, leaves, flowers, roots as well as fruits
and seeds), originating from 44 plant species, it was shown,
that the concentration of selenium in majority of samples
was determined in the range from several to several tens
of ng/g of dry plant weight. The raw materials in which the
content of selenium was above 100 ng/g were identified.
Comparing the average selenium level in individual groups
of plant materials it was possible to notice, that the highest
amounts of this element contained fruits and seeds, next
herbs, leaves, flowers and roots.
Comparing the average concentration of studied elements
it was found, that leaves and herbs contained the highest
amounts of manganese, zinc and iron, whereas in fruits and
seeds the lowest content of these elements was detected. In
the case of copper, the highest average concentration of this
element, in flowers was determined. The amounts of copper
detected in herbs and leave, were the lowest in comparison
with the other group of plant materials.
Statistically significant correlations between the following pairs
of metals: Cu-Zn, Fe-Zn in fruits and seeds, Mn-Zn in herbs, FeCu in leaves, were found. The negative linear correlations between Se-Cu in roots, Se-Mn in fruits and seeds, were observed.
Principal Component Analysis (PCA) and Cluster Analysis
(CA) were applied for interpretation of the results. It was found,
that raw materials originating from the same medicinal plant
species and from species which belong to the same taxonomic
family are frequently characterized by very similar elemental
composition (Rubi idaei Folium, Rubi fruticosi Folium).
Słowa kluczowe: selen, miedź, mangan, cynk, żelazo, roślinne surowce lecznicze, analiza głównych składowych,
analiza skupień
Key words: selenium, copper, manganese, zinc, iron, medicinal plant raw materials, principal component analysis,
cluster analysis
33
Wprowadzenie
Materiały i metody
Rośliny lecznicze, tzw. „zioła” są stosowane w celach
Materiał do badań składał się z 148 roślinnych surowmedycznych od setek lat na całym świecie. Mimo olbrzy- ców leczniczych, takich jak zioła, liście, kwiaty, korzenie
miego tempa rozwoju nauki, a wraz nią wprowadzenia wielu oraz owoce i nasiona, pochodzących od 44 gatunków roślin.
nowych leków syntetycznych, tradycyjnie stosowane rośli- Analizowano surowce lecznicze uzyskano z firm: Herbapol
ny lecznicze w postaci ziół, mieszanek i tabletek ziołowych (Bydgoszcz, Kraków, Lublin i Łódź), Kawon (Gostyń), Bocieszą się niesłabnącą popularnością [1].
guccy (Kraków), Flos (Mokrsko), Herbalux (Warszawa),
Wymagania jakościowe stawiane surowcom zielarskim Herbalux-Bis (Warszawa) i Elanda (Rozprza). Badany mazebrane są w Polskich Normach i Normach Zakładowych, teriał roślinny zmineralizowano za pomocą energii mikrozgodnie z wymogami Farmakopei Polskiej. Obejmują one falowej, stosując mineralizator mikrofalowy UniCleverTM
parametry jakościowe cech organoleptycznych surowca, BM-1z, Plazmatronika, Wrocław oraz stężony kwas azotozawartość substancji biologicznie czynnych, zawartość do- wy(V).
mieszek oraz zanieczyszczeń, w tym zanieczyszczeń pozoSelen oznaczono metodą spektrofluorymetryczną, stostałościami nawozów sztucznych [1-3].
sując spektrometr Luminescence LS 50B, Perkin Elmer.
W warunkach naturalnych obserwuje się duże zróżnico- W oznaczeniach wykorzystano barwną reakcję selenu(IV)
wanie w zawartości makro- i mikroelementów w zależności z 2,3-diaminonaftalenem (DAN). W wyniku tej reakcji
od gatunku, a nawet odmiany rośliny. Może ono wynikać tworzy się 4,5-benzopiazoselenol, dla którego wykonano
z zanieczyszczenia środowiska, właściwości i typu gleby, pomiar spektrofluorymetryczny przy fali wzbudzenia o dłuwarunków agro-klimatycznych, jak również jest związane gości 377 nm i emisji 522 nm. Ponieważ DAN wiąże się
z określoną częścią rośliny oraz jej stadium rozwojowym specyficznie z selenem na +4 stopniu utlenienia, konieczna
[4, 5]. Z kolei znajomość rozmieszczenia pierwiastków była ilościowa redukcja selenu w mineralizatach przeprowaw różnych gatunkach roślin może okazać się bardzo przydatna dzona przy użyciu stężonego kwasu solnego.
w poszukiwaniu naturalnych źródeł mikro- i makroelePierwiastki metaliczne w badanym materiale roślinnym
mentów potrzebnych organizmowi człowieka w codzien- po mineralizacji mikrofalowej oznaczono metodą absorpnej diecie [2].
cyjnej spektrometrii atomowej, wykorzystując atomizację
Dokonując przeglądu piśmiennictwa z ostatnich lat płomieniową (F-AAS).
można zauważyć istotny wzrost zainteresowania selenem,
Precyzję i odzysk użytych do oznaczeń metod sprawwynikający ze stwierdzenia jego ważnych funkcji fizjolo- dzono przy użyciu materiału referencyjnego Virginia Tabacgicznych, a także z faktu, że zarówno nadmiar jak i niedo- co Leaves (CTA-VTL-2, LGC Promochem) dla selenu, Tea
bór tego mikroelementu niekorzystnie wpływa na organizm Leaves (INCT-TL-1, LGC Promochem) dla miedzi i cynku
człowieka [6-9]. Podstawowym źródłem łatwo przyswajal- oraz Tomato Leaves (1573a, NIST) dla manganu i żelaza.
nego selenu dla człowieka jest pożywienie, zarówno pocho- Średni odzysk dla selenu wyniósł 75,4 %, natomiast dla medzenia roślinnego, jak i zwierzęcego. Zawartość selenu tali od 99,4 % do 117,2 %.
w wielu produktach żywnościowych została określona, pozostaje natomiast problem rozpoznania zawartości selenu Wyniki i dyskusja
w roślinach i pozyskiwanych z nich surowcach leczniczych
W wyniku przeprowadzonych oznaczeń stwierdzono, że
[6, 10, 11].
Z uwagi na nieustające zainteresowanie roślinami ilość selenu w surowcach roślinnych waha się w graniach
leczniczymi jako potencjalnymi lekami wspomagający- od kilku do kilkunastu lub kilkudziesięciu nanogramów
mi, określenie w nich rodzaju i zawartości biogennych w gramie suchej masy surowca. Stwierdzono także występierwiastków jest zagadnieniem ważnym i wciąż aktual- powanie kilku surowców, w których poziom selenu przekronym. Z tego względu zasadniczym
celem pracy było oznaczenie za- 240
wartości selenu oraz miedzi, man- 220
ganu, cynku i żelaza w dostępnych 200
w Polsce roślinnych surowcach 180
160
leczniczych oraz określenie wpły- 140
wu organu rośliny, z którego suro- 120
wiec został pozyskany, na poziom 100
80
oznaczanych pierwiastków. Istotne
60
było także porównanie zawartości
M ediana
40
oznaczanych pierwiastków w su25%-75%
20
rowcach pochodzących od tego saZakres nieodstających
0
mego gatunku rośliny, pozyskanych -20
Odstające
Zioła
Kwiaty
Owoce
z różnych zakładów zielarskich,
Ekstremalne
Liście
Korzenie
jak również określenie relacji pomiędzy zawartością analizowanych Ryc. 1. Zawartość selenu w poszczególnych grupach surowców leczniczych. W obliczeniach
pierwiastków w badanych grupach nie uwzględniono jednej próbki liścia podbiału z uwagi na skrajnie wysoką zawartość selenu
w tym surowcu (623,80 ng/g s.m. surowca)
surowców.
34
czył 100 ng/g, tj. liść podbiału (w czterech analizowanych
surowcach oznaczono selen w ilości, odpowiednio 623,80;
201,77; 142,53 i 108,42 ng/g), korzeń cykorii podróżnik
(analizowano dwa surowce zawierające 152,89 i 130,93 ng
Se/g próbki) oraz ziele skrzypu zawierające 133,74 ng Se/g
s.m. surowca. Wysokie stężenie selenu oznaczono także
w zielu majeranku i owocu głogu.
Zawartość selenu w poszczególnych grupach surowców
jest do siebie zbliżona, po wyłączeniu próbek o skrajnie wysokim stężeniu selenu, które występowały w każdej grupie
surowców, z wyjątkiem kwiatów. Biorąc pod uwagę średnie
stężenie selenu w kolejnych grupach surowców roślinnych,
z wyłączeniem tylko jednej próbki o niezwykle wysokiej
zawartości selenu, można uszeregować je w następującej
kolejności: owoce i nasiona, zioła i liście, kwiaty oraz korzenie. Zilustrowano to na Rys. 1.
Największą średnią zawartością selenu w badanych surowcach charakteryzują się owoce i nasiona (32,08 ng/g).
Wśród nich wysokie stężenie selenu stwierdzono w owocu
głogu pochodzącym z firmy Herbapol (Bydgoszcz). Wynosi
ono 76,88 ng/g i jest wyższe w porównaniu z wartościami
dla pozostałych próbek tego surowca. Wysoką zawartość selenu prezentują także nasiona lnu 68,32 ng/g i 50,00 ng/g.
Bogatym źródłem selenu są również zioła (średnia zawartość 22,93 ng/g). W grupie tej wysokie stężenie selenu wykryto w zielu skrzypu (Kawon, Gostyń), wynoszące
133,74 ng/g. Wysoką zawartość selenu prezentują także
próbki ziela majeranku, 63,04 ng/g i 86,16 ng/g. Istotnym
źródłem selenu są także próbki ziela macierzanki o zawartości odpowiednio 44,91; 39,40 i 47,85 ng/g.
Rozpatrując zawartość selenu w grupie liści można
stwierdzić, że w przypadku większości próbek stężenie
oznaczanego pierwiastka waha się w granicach od 15 do
25 ng/g suchej masy surowca przy wartości średniej rzędu
21,92 ng/g. W grupie tej występuje próbka o najwyższej zawartości selenu wśród wszystkich oznaczanych surowców
leczniczych, jest nią liść podbiału (Kawon, Gostyń). Zawiera on 623,80 ng Se/g s.m., przy czym ilość tego pierwiastka w pozostałych próbkach tego samego surowca jest już
niższa.
Porównując stężenie selenu w surowcach pochodzących
od tego samego gatunku rośliny leczniczej, ale uzyskanych
z różnych zakładów zielarskich, zaobserwowano zróżnicowanie w zawartości oznaczanego pierwiastka w zależności od producenta, czego przykładem jest ziele majeranku
i krwawnika. Stwierdzono także różnice w zawartości selenu w obrębie próbek pochodzących od tego samego producenta. Zauważono ponadto, że próbki surowców pochodzących z zakładu zielarskiego Kawon (Gostyń) charakteryzują
się wyższą zawartością selenu w porównaniu z surowcami
pochodzącymi z firmy Boguccy (Kraków) i Herbapol (Bydgoszcz).
Rozpatrując zawartość miedzi w analizowanych surowcach leczniczych stwierdzono, że waha się ona w granicach
od kilku do kilkunastu µg w gramie suchej masy surowca.
Najwyższą średnią zawartością miedzi wśród badanych surowców charakteryzują się kwiaty, 11,37 µg/g s.m. surowca,
następnie korzenie, owoce i nasiona oraz zioła, a najmniejszą jego ilość zawierają liście 7,05 µg/g.
Przeprowadzone oznaczenia wykazały, że w porów-
naniu z pozostałymi pierwiastkami, zawartość manganu
w badanych próbkach jest wysoka. Ilość tego pierwiastka
w kolejnych grupach surowców jest różna i wykazuje duże
zróżnicowanie w zawartości w obrębie danej grupy. Najzasobniejsze w mangan są liście (137,26 µg/g s.m.), bogatym
źródłem tego pierwiastka są również zioła (97,46 µg/g s.m.).
Stwierdzono ponadto, że korzenie, owoce i nasiona stanowią ubogie źródło manganu.
Analiza wyników oznaczeń cynku w badanych surowcach roślinnych wykazała, że zawartość tego pierwiastka
oscyluje w granicach od kilku do kilkunastu lub kilkudziesięciu µg w gramie suchej masy surowca, jak również, że
poza nielicznymi wyjątkami, jego ilość w ziołach (44,82
µg/g) i liściach (41,61 µg/g) jest średnio o połowę wyższa
niż w pozostałych surowcach. Interesujące pod względem
zawartości cynku są również korzenie. Pomimo tego, że
średni poziom oznaczanego mikroelementu w korzeniach
wynosi 29,18 µg/g, wykryto duży rozrzut w zawartości
cynku w poszczególnych surowcach. Podobnie jak w przypadku manganu, najmniej cynku zawierają kwiaty, owoce
i nasiona.
Zawartość żelaza w badanym materiale kształtuje się na
poziomie od 101,30 µg/g s.m. w owocach i nasionach do
451,43 µg/g s.m. w liściach. Oprócz liści, duże ilości żelaza wykryto także w korzeniach (447,27 µg/g s.m.). Owoce
i nasiona, podobnie jak w przypadku manganu i cynku, stanowią najuboższe źródło omawianego pierwiastka.
Zastosowanie analizy korelacji pozwoliło stwierdzić
występowanie wprost i odwrotnie proporcjonalnych zależności między oznaczanymi pierwiastkami, określanych
jako dodatnie i ujemne korelacje. W grupie ziół zanotowano dodatnią korelację pomiędzy Cu i Mn, Fe i Cu oraz Mn
i Zn. Wśród liści stwierdzono trzy korelacje dodatnie i jedną
ujemną. Dodatnie korelacje występowały pomiędzy parami
pierwiastków Mn-Zn i Fe-Zn, natomiast korelację o wysokiej wartości współczynnika r reprezentowała para Fe-Cu.
Ujemna korelacja występowała natomiast w parze Fe-Mn.
W grupie kwiatów i korzeni zaobserwowano korelacje
dodatnie w parach Mn-Zn (kwiaty) i Fe-Cu (korzenie). Ponadto w analizowanej grupie owoców i nasion zanotowano
bardzo wysoką korelację pomiędzy Cu i Zn, wysoką między
Fe i Zn oraz korelację o niskiej wartości współczynnika r
w parze pierwiastków Fe-Cu. Dwie ujemne korelacje stwierdzono w parach Se-Cu (korzenie) oraz Se-Mn (owoce i nasiona).
Zastosowanie technik eksploracji danych – analizy
głównych składowych oraz analizy skupień pozwoliło na
wyodrębnienie surowców o zbliżonym składzie pierwiastkowym. Stwierdzono, że skupienia tworzą często surowce
pochodzące z tego samego gatunku rośliny leczniczej oraz
surowce pochodzące z gatunków roślin należących do tej
samej rodziny botanicznej, np. liść maliny i jeżyny.
Analizę skupień zastosowano również do analizy relacji
między pierwiastkami w poszczególnych grupach roślinnych surowców leczniczych. Interpretacja wyników obliczeń przeprowadzonych techniką analizy skupień dowiodła,
że można je potraktować jako uzupełnienie i potwierdzenie
wyników analizy korelacji. Skupienia utworzone na najniższym poziomie wiązań opisywały często pary pierwiastków
o wysokiej wartości współczynnika korelacji.
35
Podsumowanie
Piśmiennictwo
Przeprowadzone badania dostarczyły cennych danych
odnośnie zawartości selenu w stosowanych w lecznictwie
roślinnych surowcach leczniczych. Z uwagi na niski poziom
tego biopierwiastka w materiale roślinnym oraz pracochłonną procedurę analityczną, w literaturze naukowej odczuwa
się brak szerszych opracowań na temat rozmieszczenia selenu w materiale roślinnym. Badania uzupełniły również
wiedzę o zawartości wybranych biopierwiastków (miedź,
mangan, cynk, żelazo), w dostępnych w Polsce surowcach,
pochodzących od tych samych oraz różnych gatunków roślin leczniczych.
Istotnym elementem pracy jest ponadto określenie wpływu organu rośliny, z którego surowiec został pozyskany
na poziom oznaczanego pierwiastka, i w związku z tym
identyfikacja surowców leczniczych oraz grup surowców
szczególnie bogatych w selen i oznaczane mikroelementy.
Ważnym elementem badań jest również identyfikacja wzajemnych relacji pomiędzy zawartością analizowanych pierwiastków.
Pełną interpretację uzyskanych danych zapewniły wielowymiarowe metody analizy statystycznej (analiza głównych
składowych i analiza skupień), umożliwiając optymalizację
danych pomiarowych oraz identyfikację niezależnych źródeł zmienności w zawartości selenu i pierwiastków metalicznych w badanych surowcach.
1. Kalny P. i wsp., Determination of selected microelements
in polish herbs and their infusions, Sci. Total Environ.,
2007, 381, 99-104
2. Leśniewicz A. i wsp., Macro- and micro-nutrients and
their bioavailability in polish herbal medicaments, Food
Chem., 2006, 99, 670-679
3. Kordana T., Wymagania jakościowe stawiane surowcom
zielarskim przez przemysł, Wiad. Ziel., 2002, 12, 1-3
4. Ražic S. i wsp., Determination of metal content in some
herbal drugs - Empirical and chemometric approach, Talanta, 2005, 67, 233-239
5. Smrkolj P., Stibilj V., Determination of selenium in
vegetables by hydride generation atomic fluorescence
spectrometry, Anal. Chim. Acta, 2004, 512, 11-17
6. Ferri T., Favero G., Frasconi, M., Selenium speciation
in foods: preliminary results on potatoes, Microchem. J.,
2007, 85, 222-227
7. Pappa E.C., Pappas A.C., Surai P.F., Selenium content in
selected foods from the Greek market and estimation of
the daily intake, Sci. Total Environ., 2006, 372, 100-108
8. Pezzarossa B. i wsp., Absorption of selenium by Lactuca
sativa as affected by carboxymethylcellulose, Chemosphere, 2007, 67, 322-329
9. Reid M.E. i wsp., A report of high-dose selenium supplementation: response and toxicities, J. Trace Elem. Med.
Biol., 2004, 18, 69-74
10.Mazej D. i wsp., Determination of selenium species in
plant leaves by HPLC-UV-HG-AFS, Talanta, 2006, 68,
558-568
11.Smrkolj P. i wsp., Selenium content in selected Slovenian foodstuffs and estimated daily intakes of selenium,
Food Chem., 2005, 90, 691-697
Marek Wesołowski
Al. Gen. J. Hallera 107,
80-416 Gdańsk
tel. 058-349-31-20
36
– nowe możliwości terapeutyczne
The RANKL/RANK/OPG pathway in pathogenesis of diseases
– new therapeutic possibilities
Maria Pytlik, Dorota Bolek, Igor Rymkiewicz
Katedra i Zakład Farmakologii, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny
Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny
Kierownik Katedry: dr hab. n. farm. Maria Pytlik
Streszczenie
W procesie przebudowy kości istnieje ścisła koordynacja między osteoblastami a osteoklastami. Odkrycie liganda receptorowego aktywatora czynnika jądrowego
κB (RANKL) wyjaśnia regulowany przez osteoblasty
mechanizm różnicowania, dojrzewania i funkcjonowania osteoklastów. Ligand RANKL aktywuje specyficzny receptor RANK zlokalizowany na preosteoklastach. Oddziaływanie RANKL-RANK pobudza wiele
zstępujących szlaków sygnałowych niezbędnych do
rozwoju osteoklastów. Efekty działania RANKL są fizjologicznie równoważone przez rozpuszczalny receptor pułapkowy – osteoprotegerynę (OPG). Zmiany
w obrębie szlaku RANKL/RANK/OPG stwierdzono np.
w osteoporozie pomenopauzalnej, reumatoidalnym zapaleniu stawów, nowotworach kości, chorobie Pageta i chorobach naczyń krwionośnych. Wprowadzenie nowych leków oddziałujących na szlak RANKL/RANK/OPG może
potencjalnie zrewolucjonizować leczenie wielu chorób
przebiegających z utratą kości. OPG otrzymana metodami inżynierii genetycznej jest potencjalnym inhibitorem
resorpcji kostnej w organizmie człowieka. Denozumab
jest w pełni ludzkim monoklonalnym przeciwciałem
blokującym RANKL. Badania kliniczne wykazały, że
zmniejsza on przebudowę kości i zwiększa gęstość mineralną u pacjentów.
Słowa kluczowe: osteoklasty, osteoblasty, RANK, ligand
RANK, osteoprotegeryna, denozumab
Badania naukowe ostatnich lat wykazały, że szlak
RANKL/RANK/OPG uczestniczy w patogenezie chorób
układu kostnego i innych schorzeń.
Kość jest tkanką dynamiczną, w której nieustannie zachodzą procesy przebudowy (remodelacji), obejmujące
resorpcję i kościotworzenie. Głównym celem remodelacji
jest dostosowanie budowy kości do obciążeń mechanicznych, zapewnienie homeostazy wapniowej oraz naprawa
Abstract
There is a close cooperation in bone remodeling between
osteoblasts and osteoclasts. The discovery of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) elucidates
the mechanism of osteoclast differentiation, maturation
and function regulated by osteoblasts. RANKL activates its specific receptor RANK, located on preosteoclasts. RANKL-RANK interaction activates a variety
of downstream signaling pathways required for osteoclast development. The effects of RANKL are physiologically counterbalanced by the soluble decoy receptor osteoprotegerin (OPG). Alterations of the RANKL/
RANK/OPG system have been shown for example in
postmenopausal osteoporosis, rheumatoid arthritis, skeletal malignancies, Paget′s disease and vascular diseases.
Introduction of novel drugs that target RANKL/RANK/
OPG pathway could potentially revolutionize the treatment of many diseases associated with bone loss. OPG
has been genetically engineered and in human subjects is
a potent inhibitor of bone resorption. Denosumab is a fully
human monoclonal antibody that inhibits RANK. Clinical
trials demonstrated denosumab to decrease bone turnover
and increase bone mineral density (BMD) in treated patients.
Key words: osteoclasts, osteoblasts, Receptor Activator
of Nuclear Factor-kappa B (RANK), RANK-Ligand, osteoprotegerin, denosumab
mikrouszkodzeń [1,2,3,4]. Procesy przebudowy kości zachodzą podczas całego życia człowieka, a ich intensywność i przebieg zależą od wieku. W okresie od urodzenia
do pełnej dojrzałości dominuje modelacja, w której kościotworzenie i resorpcja zachodzą na różnych powierzchniach kości, powodując ich wzrost na długość i szerokość.
U osób dorosłych w wieku 30-35 lat procesy resorpcji i kościotworzenia pozostają w stanie równowagi. W dalszym
37
okresie życia w procesach przebudowy następuje intensyfikacja resorpcji z utratą masy kostnej [4].
W procesach przebudowy kości istnieje ścisła koordynacja pomiędzy osteoblastami (komórki kościotwórcze) a osteoklastami (komórki kościogubne). Osteoblasty
powstają z mezenchymalnych komórek macierzystych zrębu, natomiast osteoklasty są wielojądrzastymi komórkami
wywodzącymi się z jednojądrowych hematopoetycznych prekursorów szpiku linii monocytowo-makrofagowej [2,3]. Na
komórkach prekursorowych osteoklastów występują transbłonowe receptory RANK (ang. receptor activator of nuclear
factor κB), służące do aktywacji czynnika jądrowego κB, który przekazuje do jądra sygnał uruchamiający kaskadę ekspresji genowych powodujących różnicowanie preosteoklastów
w osteoklasty (ryc.1.) [4]. RANK występuje także na powierzchni limfocytów T i B, komórek dendrytycznych
i fibroblastów [5]. Należy do nadrodziny receptorów TNFR
(ang. tumor necrosis factor receptors). Receptory RANK
są pobudzane przez RANKL (RANK ligand) wydzielany
przez osteoblasty i komórki zrębu. RANKL jest kluczowym czynnikiem formowania i aktywacji osteoklastów
oraz hamowania ich apoptozy. Jest to białko transbłonowe
należące do nadrodziny czynników TNF [1,2,3]. Występuje w trzech aktywnych biologicznie izoformach. RANKL1
(RANKL) i RANKL2 różnią się długością domeny śródbłonowej, natomiast RANKL3 jest formą rozpuszczalną
(sRANKL), pozbawioną tej domeny [3]. Poza układem kostnym obecność RANKL wykazano również w limfocytach
T i komórkach dendrytycznych [1]. Osteoblasty i komórki
zrębu wydzielają także rozpuszczalne białko osteoprotegerynę (OPG). Hamuje ona różnicowanie, dojrzewanie
i aktywność osteoklastów oraz indukuje ich apoptozę poprzez wiązanie i inaktywację RANKL, stanowiąc dla niego
receptor „pułapkowy”. OPG należy do nadrodziny receptorów TNFR, podobnie jak RANK. OPG jest wydzielana także przez inne tkanki: wątrobę, nerki, tarczycę, płuca, serce
[1,5].
Połączenie RANKL z receptorem RANK wyzwala
kaskadę reakcji, aktywujących zstępujące szlaki sygnałowe
w preosteoklastach.
Kaskadę reakcji zapoczątkowuje aktywacja czynnika
jądrowego NFκB, który jest czynnikiem transkrypcyjnym o budowie heterodimeru. NFκB występuje w cytoplazmie w formie nieaktywnej, w wyniku związania
z inhibitorem IκB. Aktywacja NFκB pobudza kompleks
kinazy inhibitora i na skutek fosorylacji, ubikwitynylacji
(unieczynnieniu przez przyłączenie białka ubikwityny)
i degradacji IκB traci swój hamujący wpływ na NFκB
[5,6].
Łącznie z aktywacją NFκB następuje rekrutacja białek adaptacyjnych, tj. TRAFs (ang. tumor necrosis
factor receptor associated factors) i c-Src. TRAFs są
białkami cytoplazmatycznymi wiążącymi się z wewnątrzkomórkowymi domenami różnych receptorów
z nadrodziny TNFR. Istotną funkcję w osteoklastogenezie pełni TRAF-6. c-Src jest cytoplazmatyczną kinazą
tyrozynową, odgrywającą kluczową rolę w aktywacji
antyapoptotycznej kinazy serynowo-treoninowej Akt/
PKB, podczas której TRAF-6 podnosi aktywność kinazową c-Src. Kinaza c-Src bierze także udział w funk-
38
cjonowaniu osteoklastów zależnych od integryn (białka
uczestniczące w adhezji osteoklasta do kostnej matriks)
[3,5]. W szlaku sygnalizacji RANK odkryto również
istotną rolę białka adaptacyjnego Gab-2 (ang. Grb 2associated binder) [5].
W obecności białek adaptacyjnych następuje uruchomienie szlaków sygnałowych z udziałem NFκB oraz
JNK/c-fos/c-jun, niezbędnych do formowania i aktywacji osteoklastów [5]. JNK (c-Jun N-terminalna kinaza) należy do rodziny kinaz białkowych MAPK (ang.
mitogen activated protein kinase), które są aktywowane
przez stres [7]. Wiele kinaz z tej rodziny jest aktywowanych przez RANK i mogą one przetworzyć stymulację
tego receptora na odpowiedź komórkową. Substratami
dla JNK są czynniki transkrypcyjne, m.in. Jun, fosforylowany na dwóch resztach seryny w N-terminalnym
rejonie łańcucha. Zaktywowane białko cytoplazmatyczne c-Jun w postaci homodimeru lub heterodimeru
z czynnikiem transkrypcyjnym c-Fos stanowi czynnik
transkrypcyjny AP-1 (ang. activation protein-1), który
jest niezbędny do efektywnej osteoklastogenezy [5].
W wyniku współdziałania czynnika TRAF-6 i c-Src
następuje aktywacja kinazy serynowo-treoninowej
Akt/PKB, uczestniczącej w sygnale anty-apoptotycznym [5].
Efektem oddziaływania RANKL-RANK na poziomie
komórkowym jest różnicowanie preosteoklastów do dojrzałych osteoklastów, nasilenie ich aktywności oraz zahamowanie apoptozy [2,4]. Na etapie rozwoju osteoklastów z komórek prekursorowych RANKL wymaga obecności MCSF
(ang. macrophage colony stimulating factor), posiadającego
swoiste receptory c-fms na osteoklastach [2,3,5].
Szlak RANKL/RANK oprócz udziału w osteoklastogenezie uczestniczy także: w organogenezie węzłów chłonnych, rozwoju limfocytów, funkcjonowaniu komórek dendrytycznych oraz w powstawaniu reakcji zapalnej [5,8].
Podczas ciąży oddziaływanie RANKL-RANK jest niezbędne do rozwoju komórek nabłonkowych gruczołu sutkowego
[9]. Sygnalizacja RANKL uczestniczy również w rozwoju
zastawek serca [10].
Szlak RANKL/RANK/OPG podlega regulacji przez
osteotropowe hormony i cytokiny. Ekspresję RANKL
w osteoblastach pobudzają: 1,25-dihydroksycholekalcyferol,
PTH, glikokortykosteroidy, PGE2, Il-1, Il-6, Il-11, Il-17,
TNF-α, insulinopodobny czynnik wzrostowy IGF-1, natomiast
hamują: Il-13, interferon IFN-γ, transormujący czynnik
wzrostowy TGF-β i estrogeny [1,3,5]. Ekspresję OPG pobudzają: estrogeny, 1,25-dihydroksycholekalcyferol, Il-1,
białko morfogenetyczne kości BMP-2, TGF-β, obciążenia
mechaniczne działające na kość, jony wapniowe uwalniane
w miejscach resorpcji kości, zaś hamują: PTH (podawany
w sposób ciągły, nie okresowy), glikokortykosteroidy, PGE2,
IGF-1, IL-1, Il-6, Il-11, Il-17, TNF-α [1,2,3].
Doświadczenia in vitro wykazały, że istotną rolę w regulacji osteoklastogenezy, przez hamujący wpływ na RANKL,
pełni cząsteczka tlenku azotu NO. Ponadto wykazano, że
RANKL przez indukcję interferonu IFN-β, pobudza ekspresję iNOS (indukowana syntaza tlenku azotu) i uwalnianie
Ryc. 1. Dojrzewanie i aktywacja osteoklastów
Fig. 1. Maturation and activation of osteoclasts
tlenku azotu, stanowiącego czynnik ograniczający osteoklastogenezę (mechanizm ujemnego sprzężenia zwrotnego)
[11].
Brak równowagi w stosunku RANKL do OPG lub
w sygnalizacji RANK leży u podstaw wielu zaburzeń szkieletu, charakteryzujących się nadmierną utratą kości (osteoporoza) bądź nadmiernym jej formowaniem (osteopetroza) lub zaburzoną przebudową.
Osteoporoza jest najlepiej zbadaną chorobą kości związaną ze szlakiem RANKL/RANK/OPG. Charakteryzuje się
ona zmniejszeniem masy tkanki kostnej, zaburzeniem mikroarchitektury kości i w konsekwencji, zwiększoną podatnością na złamania. Według WHO osteoporoza występuje,
gdy gęstość tkanki kostnej pacjenta ma wartość mniejszą
co najmniej o 2,5 odchylenia standardowego od średniej
wartości dla populacji młodych dorosłych. Natomiast, gdy
gęstość tkanki kostnej mieści się w zakresie 1 do 2,5 odchylenia standardowego poniżej średniej wartości dla populacji młodych dorosłych, mamy do czynienia z osteopenią.
U kobiet po menopauzie, na skutek zaniku hormonalnej
funkcji jajników, zmniejsza się oddziaływanie estrogenów
na układ kostny i może rozwinąć się osteoporoza pomenopauzalna. Niedobór estrogenów prowadzi do zwiększenia
szybkości przebudowy kości (resorpcji i kościotworzenia).
Przesunięcie równowagi pomiędzy procesami resorpcji
a procesami kościotworzenia w kierunku nasilenia resorpcji, obserwowane w osteoporozie pomenopauzalnej, jest
wynikiem przedłużenia czasu trwania życia osteoklastów
i skróceniu czasu życia osteoblastów [4]. Dane eksperymentalne wskazują, że za przyspieszoną przebudowę kości odpowiada wzmożone uwalnianie cytokin (RANKL, Il-1, Il-6,
TNF-α), nasilających resorpcję kości, których wydzielanie
w warunkach fizjologicznych jest hamowane przez estradiol. Ponadto niedobór estrogenów prowadzi do zmniejszenia wydzielania OPG w osteoblastach. U kobiet w okresie
pomenopauzalnym stwierdzono wyższe poziomy RANKL
w komórkach zrębu szpiku i limfocytach niż u kobiet przed
menopauzą, bądź też po menopauzie, ale stosujących terapię
estrogenową. Wykazano, że ekspresja RANKL jest odwrotnie skorelowana ze stężeniem w osoczu 17 β-estradiolu,
a dodatnio ze stężeniem markerów resorpcji kostnej. Estradiol może również hamować aktywność jednego z enzymów, biorących udział w kaskadzie sygnałowej wyzwolonej
aktywacją receptora RANK, tj. kinazy JNK [12].
Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) należy do
grupy chorób kości o podłożu zapalnym. W RZS obserwuje się okołostawową utratę kości i chrząstki. Wiele cytokin
stanu zapalnego posiada zdolność indukowania rekrutacji,
różnicowania i aktywacji osteoklastów. Objęta stanem zapalnym tkanka synowialna produkuje, wpływające na aktywność osteoklastów, cytokiny i hormony: RANKL, Il-1α,
Il-1β, TNF-α, IL-6, Il-17, MCSF i PTHrP (ang. parathyroid
hormone-related protein). Badania dostarczają niezbitych
dowodów na to, że RANKL jest produkowany przez aktywowane limfocyty T z tkanki synowialnej RZS oraz synowialne fibroblasty, powodując osteoklastyczną resorpcję
kości [13].
Inne choroby zapalne stawów, w których może występować podobny mechanizm lokalnej erozji kości to: łuszczycowe zapalenie stawów, młodzieńcze idiopatyczne
zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa czy zapalenie przyzębia [12,13].
Guzy kości zarówno pierwotne, tj.: szpiczak mnogi, pierwotny chłoniak kości, mięsaki kostne, jak i częściej przerzutowe guzy, występujące zwykle u pacjentów z pierwotnym
guzem prostaty, gruczołu sutkowego lub płuc, tworzą grupę
chorób, w których system RANKL/RANK/OPG odgrywa
istotną rolę. Wyniki badań wykazały, że guz zwiększa liczbę
i rozmiar osteoklastów w miejscu jego lokalizacji, nasilając osteolizę, objawiającą się nowotworowym bólem kości.
W osteolitycznych guzach kości wykazano zwiększone
poziomy RANKL i RANK. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że redukcja osteolizy spowodowanej
guzem zmniejszyła ból nowotworowy kości. Fakt ten potwierdza doświadczenie na myszach z nowotworem, który
wywołał osteolizę i ból. Podanie myszom osteoprotegeryny
znacząco zredukowało wskaźniki behawioralne i neurochemiczne bólu oraz osteolizę [14].
Badania naukowe wykazały, że szlak RANKL/RANK/
OPG uczestniczy także w patogenezie: osteoporozy posteroidowej, hiperparatyroidyzmu, hiperkalcemii złośliwej,
różnych postaci choroby Pageta (sporadyczna, rodzinna,
młodzieńcza) i postępującej hiperfosfatazji [12].
Ostatnio wykazano również, że szlak RANKL/RANK/
OPG pełni ważną rolę w chorobach naczyń krwionośnych [8]. Przeprowadzone badania wskazują, że RANKL
w mięśniach gładkich naczyń krwionośnych promuje kalcyfikację, natomiast OPG prawdopodobnie pełni funkcję protekcyjną. Wyniki najnowszych badań sugerują, że
OPG może pełnić rolę inhibitora kalcyfikacji, bez wpływu
na wielkość i liczbę zmian miażdżycowych, ilość cytokin
w naczyniach czy poziom cholesterolu [15]. Komórki śródbłonka i mięśni gładkich naczyń krwionośnych, zwłaszcza
w aorcie i naczyniach nerkowych, konstytutywnie produkują OPG. Natomiast w niezwapniałych naczyniach
i zastawkach RANK i RANKL są często niewykrywalne.
Zwiększony stosunek RANKL/OPG w komórkach śródbłonkowych, obserwowany w procesie kalcyfikacji, wydaje się być związany z zapalną naturą miażdżycy (RANKL
wzrasta, a OPG maleje), podobnie jak w innych tkankach
objętych procesem zapalnym. Śródbłonek (endothelium)
jest głównym koordynatorem odpowiedzi zapalnej i miejscem wytwarzania (obok limfocytów T) zwiększonych ilo-
39
ści RANKL. Pochodzący z komórek endothelium RANKL
pobudza ich proliferację, migrację chemotaktyczną, przeżywalność oraz angiogenezę. Podczas wapnienia mięśnie
gładkie naczyń ulegają różnicowaniu osteogenicznemu
i wytwarzają RANKL, który reguluje w nich ekspresję białek macierzy kostnej. RANKL wzmaga także rekrutację
i infiltrację monocytów/makrofagów, przez co stymuluje mineralizację mięśni gładkich naczyń krwionośnych
w miażdżycy. Ponadto indukuje w monocytach produkcję metaloproteazy MMP-9 (ang. matrix metalloprotease-9), która wspiera infiltrację i wzrost płytki miażdżycowej. W makrofagach oksydowane lipidy stymulują
czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF (ang.
vascular endothelial growth factor), który poprzez intensywne namnażanie komórek śródbłonka i indukcję ekspresji receptora RANK, nasila neoangiogenezę. Obecnie
uważa się, że zapalnie aktywowane komórki endothelium
przyczyniają się do pojawienia, funkcjonowania i przeżywalności komórek osteoklastopodobnych. Pojawiają
się one w zaawansowanych zmianach miażdżycowych
i biorą udział w remodelingu powstałej w naczyniach tkanki
kostnej. Wyniki badań sugerują, że produkcja RANKL przez
aktywowane limfocyty T, śródbłonek i wapniejące mięśnie
gładkie naczyń krwionośnych może pomagać w inicjowaniu i unieśmiertelnianiu procesów angiogenicznych, które
intensyfikują zapalenie i kalcyfikację [8]. W tym przypadku
OPG jest postrzegana jako czynnik ryzyka rozwoju miażdżycy i chorób układu sercowo-naczyniowego. Wysokie
stężenie OPG jest niezależnym czynnikiem ryzyka choroby
kardiowaskularnej [16]. Jednak OPG wydaje się być jedynie
markerem, a nie mediatorem miażdżycy [15].
Udział RANKL i OPG w kalcyfikacji naczyń popierają
następujące odkrycia:
fenotyp kalcyfikacji naczyń u myszy z genetycznym
brakiem OPG,
wzrost ekspresji RANKL z jednoczesnym spadkiem
OPG w zwapniałych naczyniach,
indukowanie przez RANKL kalcyfikacji i różnicowania
osteoplastycznegow miofibroblastach zastawek serca,
związek między chorobą wieńcową a poziomem osoczowym OPG i RANKL [17].
Odkrycie szlaku RANKL/RANK/OPG zapoczątkowało
badania nad nowymi możliwościami terapeutycznymi w leczeniu chorób tkanki kostnej.
Osteoprotegeryna otrzymana metodą inżynierii genetycznej stanowi znaczący inhibitor resorpcji kości [18].
Liczne przedkliniczne badania naukowe z użyciem osteoprotegeryny obejmują eksperymenty in vivo na modelach
zwierzęcych i doświadczenia in vitro. Przeprowadzono
także kilka badań klinicznych z zastosowaniem ludzkiej rekombinowanej OPG (hrOPG) jako inhibitora resorpcji kości. Cząsteczka hrOPG zawiera OPG (pozbawioną domeny
wiążącej heparynę) sprzężoną na N-końcu z fragmentem Fc
ludzkiej immunoglobuliny IgG1 [19,20,21]. Delecja domeny wiążącej heparynę i fuzja skróconej molekuły z IgG1 powoduje wydłużenie okresu półtrwania w organizmie [21].
Pierwsze randomizowane badanie kliniczne hrOPG
przeprowadzono na 52 zdrowych kobietach po menopauzie
40
przez pojedyncze podanie podskórne (sc). Uzyskane wyniki wykazały, że hrOPG szybko i znacząco zahamowała
resorpcję kostną u badanych kobiet bez istotnych działań
ubocznych [19].
W innym randomizowanym badaniu klinicznym
I fazy porównywano efekt antyresorpcyjny oraz bezpieczeństwo zastosowania hrOPG i pamidronianu. Badanie
przeprowadzono na 28 pacjentach ze szpiczakiem mnogim i 26 kobietach z rakiem gruczołu sutkowego, któremu towarzyszyły przerzuty do kości. Pojedyncze sc
podanie hrOPG spowodowało szybką i głęboką supresję
resorpcji kości u obydwu grup pacjentów, podobną jak
po stosowaniu pamidronianu. hrOPG była dobrze tolerowana [ 20].
Przeprowadzono również próbę zastosowania hrOPG
u dwojga pacjentów (rodzeństwa) z młodzieńczą postacią
choroby Pageta. Resorpcja kostna, mierzona poziomem
jej biochemicznych markerów, została zahamowana przez
dawki 0,3 i 0,4 mg/kg masy ciała, podawane sc raz w tygodniu przez okres 15 m-cy. Po tym czasie masa kości promieniowej wzrosła o 9% u jednego pacjenta oraz o 30% u drugiego. Z wyjątkiem łagodnej hipokalcemii i hipofosfatemii,
nie stwierdzono widocznych działań niepożądanych [22].
Ostatnio przeprowadzone badania in vitro wykazały, że
OPG może pełnić rolę czynnika protekcyjnego dla komórek
nowotworowych (raka gruczołu sutkowego, prostaty, jelita
grubego) [23,24]. Możliwym mechanizmem zwiększenia
ryzyka nowotworzenia jest blokowanie przez OPG czynnika TRAIL (ang. tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand), indukującego apoptozę różnych komórek
nowotworowych [23].
W ostatnich latach duże nadzieje na wprowadzenie do
lecznictwa wiązane są z denozumabem, który jest w pełni
ludzkim monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla
RANKL [25,26,27]. W przeciwieństwie do OPG charakteryzuje się znacznie dłuższym czasem półtrwania, co pozwala na rzadsze dawkowanie [28].
W randomizowanym badaniu klinicznym I fazy denozumab podawano 25 pacjentom ze szpiczakiem mnogim oraz 29 pacjentkom z przerzutami raka gruczołu sutkowego do kości w pojedynczej dawce sc. Wykazano, że
denozumab zmniejszał poziom markera resorpcji kostnej
N-telopeptydu (w moczu i osoczu) w ciągu jednego dnia.
Spadek utrzymywał się do 84 dni (dla dawek 1.0 lub 3.0
mg/kg.). Dla porównania pamidronian podawany w dawce
90 mg drogą dożylną (iv) również zmniejszał przebudowę
kostną lecz działanie utrzymywało się krócej. Denozumab
był dobrze tolerowany [25].
Badania kliniczne II fazy z zastosowaniem denozumabu zostały przeprowadzone na 412 kobietach po menopauzie z niską masą kostną. Przez 2 lata wszystkie kobiety otrzymywały denozumab (w dawkach 6, 14, 30 mg)
co 3 miesiące lub (14, 60, 100, 210 mg) co 6 miesięcy sc.
Po 2 latach podawania denozumabu kobiety podzielono
na 3 grupy badane. Grupa pierwsza otrzymywała badany
lek co 6 miesięcy przez kolejne 2 lata. W grupie drugiej
przerwano terapię, natomiast grupie trzeciej, po rocznej
przerwie, ponownie podawano denozumab w odstępach
sześciomiesięcznych przez okres roku. Czteroletnia terapia denozumabem u 262 pacjentek spowodowała wzrost
gęstości mineralnej kości BMD (ang. bone mineral density) kręgosłupa lędźwiowego o 9,4-11,8%, oraz biodra o 4,0-6,1%, a także zmniejszenie poziomu markerów
przebudowy kostnej BTM (ang. bone turnover markers)
w czasie stosowania. W ciągu pierwszych 12 m-cy od przerwania podawania denozumabu wykazano spadek BMD
o 6,6% w kręgosłupie lędźwiowym i o 5,3% w biodrze,
z jednoczesnym wzrostem BTM. Wznowienie leczenia denozumabem w tej grupie pacjentek spowodowało
wzrost wartości BMD kręgosłupa lędźwiowego o 9% (licząc od wartości wyjściowych przed rozpoczęciem terapii) oraz redukcję BTM. Lek był dobrze tolerowany,
a ilość zdarzeń niepożądanych była podobna jak po placebo
[26].
W innym badaniu klinicznym II fazy działanie denozumabu porównywano z różnymi bisfosfonianami (zoledronian, pamidronian, ibandronian). W tym celu denozumab
podawano 255 pacjentkom z przerzutami raka gruczołu
sutkowego do kości. Wpływ denozumabu na przebudowę
kości u tych pacjentek, w ciągu pierwszych 13 tygodni terapii, oceniano przez pomiar markera obrotu kostnego, tj. stosunek moczowego N-telopeptydu do moczowej kreatyniny
(uNTx/Cr). Pacjentki otrzymywały lek drogą iniekcji podskórnych co 4 m-ce (30, 120 lub 180 mg) lub co 12 m-cy (60
lub 180 mg) przez okres 24 m-cy. Bisfosfoniany podawano co 4 tygodnie iv. Wykazano, że denozumab u 74% osób
spowodował 65% zmniejszenie stosunku uNTx/Cr po 13
dniach stosowania, natomiast bisfosfoniany podobny rezultat wykazały u 63% chorych po 29 dniach. Nie stwierdzono
żadnych poważnych działań niepożądanych po podawaniu
denozumabu [27].
Obecnie prowadzone są dla denozumabu badania kliniczne III fazy, które zdecydują czy zostanie on wprowadzony do lecznictwa.
Piśmiennictwo
1. Ostrowska Z et al. Przebudowa kości, system RANKL/
RANK/OPG a melatonina. Ann Acad Med Siles 2008;
62: 79-84.
2. Lorenc RS, Kryśkiewicz E. Szlak RANKL/RANK/OPG
i jego znaczenie w fizjologii i patofizjologii kości. Terapia 2006; 14 (3): 58-63.
3. Kapczuk K, Sowińska-Przepiera E, Friebe Z. Układ
Osteoprotegeryna/RANKL/RANK w aspekcie terapii osteoporozy pomenopauzalnej. Ginekol Pol 2003;
74(4): 323-31.
4. Janiec W. Farmakodynamika leków wpływających na
układ kostny. W: Farmakodynamika. Podręcznik dla
studentów farmacji. Wydawnictwo Lekarskie PZWL,
Warszawa 2008; 858-908.
5. Wada T et al. RANKL-RANK signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Trends Mol Med 2006; 12(1): 17-25.
6. Murray RK, Granner DK. Biochemia komunikacji zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej. Błony:
struktura i funkcja. W: Biochemia Harpera. Red. Murray RK et al. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2008; 507-577.
7. Kłyszejko-Stefanowicz L. Błona plazmatyczna oraz
białka powierzchni komórkowej. W: Cytobiochemia.
Biochemia niektórych struktur komórkowych. Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 2002; 219-286.
8. Collin-Osdoby P. Regulation of vascular calcification by
osteoclast regulatory factors RANKL and osteoprotegerin. Circ Res 2004; 95(11): 1046-57.
9. Kim NS et al. Receptor activator of NF-kappaB ligand
regulates the proliferation of mammary epithelial cells
via Id2. Mol Cell Biol 2006; 26(3): 1002-13.
10.Lange AW, Yutzey KE. NFATc1 expression in
the developing heart valves is responsive to the
RANKL pathway and is required for endocardial
expression of cathepsin K. Dev Biol 2006; 292(2):
407-17.
11.Zheng H et al. RANKL stimulates inducible nitricoxide synthase expression and nitric oxide production
in developing osteoclasts. An autocrine negative feedback mechanism triggered by RANKL-induced interferon beta via NF-kappaB that restrains osteoclastogenesis and bone resorption. J Biol Chem 2006; 281(23):
15809-20.
12.Hofbauer LC, Shoppet M. Clinical implications of the
Osteoprotegerin/RANKL/RANK system for bone and
vascular diseases. JAMA 2004; 292(4): 490-5.
13.Anandarajah AP, Schwarz M. Anti-RANKL therapy
for inflammatory bone disorders: Mechanisms and
potential clinical applications. J Cell Biochem 2006;
97(2): 226-32.
14.Clohisy DR, Mantyh PW. Bone cancer pain and the
role of RANKL/OPG. J Musculoskelet Neuronal Interact 2004; 4(3): 293-300.
15.Morony S et al. Osteoprotegerin inhibits vascular calcification without affecting atherosclerosis in ldlr(-/-)
mice. Circulation 2008; 117(3): 411-20.
16.Kiechl S et al. Osteoprotegerin is a risk factor for progressive atherosclerosis and cardiovascular disease. Circulation 2004; 109(18): 2175-80.
17.Tintut Y, Demer L. Role of osteoprotegerin and its ligands and competing receptors in atherosclerotic calcification. J Investig Med 2006; 54(7): 395-401.
18.Gallagher JC. Advances in bone biology and new treatments for bone loss. Maturitas 2008; 60(1): 65-9.
19.Body JJ et al. A phase I study of AMGN-0007, a recombinant osteoprotegerin construct, in patients with multiple myeloma or breast carcinoma related bone metastases. Cancer 2003; 97(3 Suppl): 887-92.
20.Cundy T et al. Recombinant osteoprotegerin for juvenile
Paget’s disease. N Engl J Med 2005; 353(9): 918-23.
21.Vega D, Maalouf NM, Sakhaee K. Clinical Review: the role
of receptor activator of nuclear factor-kappaB (RANK)/
RANK ligand/osteoprotegerin: clinical implications.
J Clin Endocrinol Metab 2007; 92(12): 4514-21.
22.Pettersen I et al. Osteoprotegerin is expressed in colon carcinoma cells. Anticancer Res 2005; 25(6B):
3809-16.
41
23.Body JJ et al. A study of the biological receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand inhibitor, denosumab, in patients with multiple myeloma or bone
metastases from breast cancer. Clin Cancer Res 2006;
12(4): 1221-8.
24.Miller PD et al. Effect of denosumab on bone density and
turnover in postmenopausal women with low bone mass
after long-term continued, discontinued, and restarting
of therapy: a randomized blinded phase 2 clinical trial.
Bone 2008; 43(2): 222-9.
Dorota Bolek
ul. Jagiellońska 4, 41-200 Sosnowiec
tel. (032) 364 15 40
42
25.Lipton A et al. Randomized active-controlled phase II
study of denosumab efficacy and safety in patients with
breast cancer-related bone metastases. J Clin Oncol
2007; 25(28): 4431-7.
26.Kostenuik PJ. Osteoprotegerin and RANKL regulate
bone resorption, density, geometry and strength. Curr
Opin Pharmacol 2005; 5(6): 618-25.
Wrażliwość radiacyjna mikroorganizmów
Radiosensitivity of microorganisms
Sławomir Wilczyński
Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM w Katowicach
Kierownik Katedry: dr hab. n. fiz. Barbara Pilawa
Streszczenie
Wyjaławianie ma na celu zabicie lub usunięcie ze środowiska lub materiału wszystkich drobnoustrojów w ich
formach wegetatywnych i przetrwalnikowych. Problem
jałowości szczególnego znaczenia nabiera w kontekście
sterylności leków. Wybór metody wyjaławiana substancji
leczniczych zależy od rodzaju, właściwości oraz sposobu
ich produkcji.
Zastosowanie promieniowania gamma do sterylizacji leków,
także produktów spożywczych, materiałów do transplantacji, gleby i wielu innych, wynika z faktu, że wszystkie mikroorganizmy są w większym lub mniejszym stopniu wrażliwe na to promieniowanie [1]. Podstawowym parametrem,
który wpływa na efektywność inaktywacji drobnoustrojów,
a więc pośrednio na skuteczność sterylizacji, jest dawka
zastosowanego promieniowania gamma [2,3-8]. Niemniej
jednak promieniowanie gamma należy traktować jako
uniwersalny, nieselektywny czynnik biobójczy działający
w każdej dawce [3].
Na skuteczność procesu sterylizacji radiacyjnej wpływają trzy podstawowe parametry: poziom wstępnego zanieczyszczenia mikrobiologicznego, poziom SAL (Sterility
Assurance Level), który chcemy osiągnąć i wrażliwość
radiacyjna mikroorganizmów [9].
Jako czynniki potencjalnie patogenne, zanieczyszczające sterylizowane obiekty mogą być traktowane bakterie,
grzyby, glony i wirusy.
Abstract
Sterilization is process leading to elimination from environment or material microbes both vegetative and spore
forms. Microbial purity of drugs plays essential role in
treatment. Depending on type, characteristics and way of
production of pharmaceutics different methods of sterilizations are apply. It is possible to sterilize drugs, foodstuffs, transplantation materials, soil and many others with
gamma radiation because all microorganisms are less or
more radiosensitive [1]. The most important parameter
which impacts on radiosterilization efficiency is dose of
ionizating radiation [2, 3-8]. Nevertheless, ionizating radiation can be treat as non selective, universal lethal factor
which acts irrespective of radiation dose [3]. The efficiency of ionizing radiation depend on free basic parameters:
level of initial microbial contamination, sterility assurance
level and microorganisms sensitivity [9]. Among potentially pathogenic factors bacteria, fungi and algae can be
mentioned.
Key words: ionizing radiation, microorganisms, dose of
radiation
Słowa kluczowe: promieniowanie jonizujące, mikroorganizmy, dawka promieniowania
Wrażliwość radiacyjna bakterii
Bakterie są najmniej wrażliwymi na promieniowanie
gamma organizmami. Szczególnie oporne są bakterie wytwarzające przetrwalniki [2,9,10]. Generalnie można przyjąć, że im bardziej złożony organizm tym jest bardziej wrażliwy na promieniowanie gamma [2,11].
Wrażliwość bakterii na promieniowanie gamma zależy
od typu, gatunku i szczepu bakterii [4], dawki promieniowania [2,3-9], w niewielkim stopniu od mocy dawki [2],
temperatury napromieniowania, obecności tlenu, obecności
wody, obecności sensybilizatorów lub protektorów (substancji uczulających bądź chroniących przed promieniowaniem
gamma) [4-6,12].
Poszczególne gatunki bakterii bardzo różnią się między sobą pod względem wrażliwości radiacyjnej [2,3-8].
Generalnie można przyjąć, że bakterie Gram-dodatnie
są zazwyczaj bardziej oporne niż baterie Gram-ujemne, co
może wynikać z różnic w budowie ściany komórkowej [2].
Ponadto bardziej wrażliwe są bakterie tlenowe niż beztlenowe [2]. Wyniki otrzymane przez Farkas, Gazsó i Diósi
[4] w badaniach mikroflory gleby wskazują, że dawka D10
[kGy] powodująca dziesięciokrotne zmniejszenie populacji
dla badanych przez nich bakterii aerobowych waha się pomiędzy 0.8 a 2.44 kGy natomiast dla bakterii anaerobowych
oscyluje w granicach 1.86-4.93 kGy.
Dawki D10 dla różnych gatunków bakterii mogą się
różnić o kilka rzędów wielkości. Dawki D10 dla bakterii za-
43
siedlających produkty spożywcze (mięso wołowe) Bacillus cereus, Staphylococcus aureus czy Escherichia coli
wynoszą odpowiednio 0.663, 0.594 i 0.538 kGy [5]. Natomiast Gram-dodatnie bakterie z rodzaju Brevibacterium,
naturalnie występujące w glebie, przeżywały napromieniowanie nawet dawką 40 kGy [11]. Do najbardziej opornych
na promieniowanie gamma bakterii należy mutant popromienny Micrococcus radiodurans [2]. Parker i Vincent
[13] wyizolowali z torfu bakterię podobną do Micrococcus
radiodurans, która przetrwała napromieniowanie dawką
25 – 35 kGy.
Nie tylko sam gatunek bakterii determinuje jej radiowrażliwość. Także poszczególne szczepy bakterii tego samego gatunku mogą bardzo znacznie różnić się wrażliwością
radiacyjną [2,4]. Dla Escherichia coli różnica pomiędzy najbardziej a najmniej wrażliwym szczepem (Texas) w średniej
dawce letalnej jest prawie trzykrotna [2]. Może to wynikać
z faktu, że u różnych szczepów mogą występować różne
mechanizmy naprawcze [14].
Kolejnym parametrem mogącym nieznacznie wpływać
na skuteczność sterylizacji (wynikającej z wrażliwości bakterii) jest moc dawki [2]. Dawki podawane impulsowo lub
w stosunkowo dużym przedziale czasowym mogą dać szansę na włączenie przez komórkę mechanizmów naprawczych,
a więc zwiększyć przeżywalność bakterii. Z praktycznego
punktu widzenia nie ma to jednak większego znaczenia,
ponieważ wytwórcy starają się zdeponować jak największą
dawkę w jak najkrótszym czasie, aby ze względów ekonomicznych jak najbardziej przyspieszyć ten etap technologiczny. Ponadto różnice we wrażliwości radiacyjnej nawet
skrajnie różnych mocy dawki nie są duże [2].
Ogromne znaczenie w przebiegu procesu sterylizacji
ma obecność lub brak wody w sterylizowanym obiekcie
[2,4,5,12]. Wynika to faktu, iż promieniowanie gamma prowadzi do radiolizy wody, której produkty mogą działać letalnie na bakterie [5,8,9,11,12,15]. Pośród produktów radiolizy
wody: eaq-, H3O+, ·OH, H, H2 i H2O2, największe zniszczenia u bakterii powoduje rodnik ·OH [12]. Powstające wolne
rodniki (powstające zewnątrz- i wewnątrzkomórkowo [11])
zakłócają organizację biochemiczną organizmu, co prowadzi do śmierci komórki [9]. Między innymi niska zawartość
wody może powodować małą wrażliwość na promieniowanie gamma przetrwalników bakterii [2]. Natomiast z drugiej
strony, jeśli przetrwalniki (w obecności tlenu) znajdują się
blisko stanu maksymalnego wysuszenia są bardzo wrażliwe na promieniowanie gamma [2]. McNamara, Black,
Beresford i Parekh [11] zauważyli, że sterylizacja mokrej
gleby jest efektywniejsza niż suchej ponieważ bakterie
w mokrej glebie są bardziej wrażliwe na promieniowanie niż
w suchej.
Na wrażliwość radiacyjną bakterii ma również duży
wpływ temperatura napromieniowania, a w przypadku produktów spożywczych także temperatura przechowywania
produktów po napromieniowaniu [14,16]. Zmniejszanie
temperatury powoduje unieruchomienie wolnych rodników, co prowadzi do zmniejszenia skuteczności pośredniego działania promieniowania gamma [14]. Dawka D10 dla
Listeria monocytogenes napromieniowanej w -72°C była
wyższa niż dla próbki napromieniowanej w 0°C – immobilizacja wolnych rodników zadziałała jako czynnik radiopro-
44
tekcyjny [14]. Dla Yersinia enterocolitica i Escherichia coli
nie zaobserwowano takiego efektu [14].
Zwiększanie temperatury podczas napromieniowywania
może zwiększać skuteczność sterylizacji poprzez synergistyczne działanie tych dwóch czynników wyjaławiających.
Jednak metoda ta nie znajduje praktycznego zastosowania
ze względu na duże koszty [2].
Zaobserwowano również wpływ środowiska (gazu w jakim prowadzi się napromieniowanie) na wrażliwość bakterii
na promieniowanie gamma [6,12].
W literaturze szeroko prowadzi się dyskusję nad wpływem tlenu na wrażliwość radiacyjną mikroorganizmów
– zjawisko to nazywane jest efektem tlenowym [6,12].
Porównując wrażliwość przetrwalników Clostridium botulinum typu E zaobserwowano, że najkorzystniejszym środowiskiem do ich niszczenia było powietrze [13]. Mniejszą
skuteczność promieniowania gamma dla zarodników Clostridium botulinum zaobserwowano odpowiednio dla atmosfery N2O i N2 [13]. Wrażliwość przetrwalników Clostridium
w powietrzu mogła wynikać z tworzenia się rodników peroksylowych i działania tlenu zawartego w powietrzu jako
utleniacza [12]. Innym czynnikiem mogącym mieć wpływ
na uwrażliwianie bakterii w środowisku tlenowym (powietrzu) jest aktywność ligazy DNA, która naprawia uszkodzony przez promieniowanie kwas deoksyrybonukleinowy. Enzym ten w środowisku tlenowym nie był w stanie
połączyć rozerwanych łańcuchów DNA [12]. Efekt wpływu
atmosfery napromieniowania na wrażliwość bakterii zaobserwowali również Borsa, Lacroix, Ouattara i Chiasson [6].
Wykazali oni, że zastosowanie środowiska składającego się
z 60% tlenu, 30% dwutlenku węgla i 10% azotu (mieszanina
MAP) powoduje zmniejszenie dawki D10 z 0.126 kGy (kontrola-powietrze) do 0.086 kGy (MAP) dla Escherichia coli oraz
z 0.526 kGy (kontrola-powietrze) do 0.221 (MAP) dla Salmonella typhi [6].
Oprócz wyżej wspomnianych czynników ważnym elementem wpływającym na skuteczność przebiegu procesu
wyjaławiania jest obecność różnych substancji chemicznych modyfikujących odpowiedź bakterii na promieniowanie gamma. Substancje te można podzielić na dwie grupy:
substancje powodujące uwrażliwienie na promieniowanie gamma oraz substancje działające radioprotekcyjnie
[6,12,17]. Do substancji mogących działać radioprotekcyjnie należą niektóre poliaminy. Poliaminy dzięki ładunkowi
jaki posiadają, mogą łączyć się z kwasem deoksyrybonukleinowym. Takie połączenie zmienia konformację DNA i
wpływa na mechanizmy naprawcze [17]. Do innych radioprotektorów można zaliczyć chlorek sodu czy tioglikolan
sodu, które zwiększają przeżywalność gamma napromieniowanych przetrwalników Clostridium botulinum [12].
Jednym z mechanizmów działania radioprotekcyjnego niektórych substancji może być zmiatanie wolnych rodników
i stabilizowanie helisy DNA [12].
Do substancji mogących zwiększać wrażliwość radiacyjną bakterii Borsa, Lacroix, Ouattara i Chiasson [6] zaliczyli tymol, karwakrol oraz aldehyd trans-cynamonowy.
Już 0.1% (m/m) tymolu znacząco zwiększa wrażliwość Salmonella typhi zakażających mieloną wołowinę [6] Podobne,
ale już nie takie spektakularne efekty zaobserwowano dla
karwakrolu i aldehydu trans-cynamonowego [6].
Na wrażliwość bakterii na promieniowanie gamma
wpływa również aktywność metaboliczna i faza cyklu życiowego mikroorganizmu [11].
Wrażliwość radiacyjna grzybów
Grzyby są bardziej wrażliwe na promieniowanie gamma niż bakterie [2,7,11,15,18]. Podobnie jak w przypadku
bakterii, także u grzybów można zauważyć znaczne różnice
w oporności na promieniowanie gamma w zależności od gatunku [2,7,11,15].
Zarodniki, grzybnie, skleroty czy inne struktury morfologiczne mogą wykazywać różną wrażliwość radiacyjną [2].
Można przyjąć, że zarodniki są bardziej odporne niż formy
wegetatywne, szczególnie zarodniki wielokomórkowe. Inną
przyczyną zmniejszonej wrażliwości niektórych zarodników może być ich wielojądrzastość [2].
Podobnie jak w przypadku bakterii, zwiększanie dawki
promieniowania gamma zwiększa skuteczność sterylizacji (zwiększa ilość inaktywowanych grzybów) [2,7,11,15].
W przypadku sterylizacji gleby dawka 10 kGy eliminuje
większość (>99%) grzybów glebowych [7,11]. Niektóre gatunki grzybów, jak np. Aspergillus spp., zasiedlający
stare książki i dokumenty, jest odporna nawet na dawkę 20
kGy [15]. Równie wysoką odpornością wykazuje się gatunek Cladosporium spp. Ciemny barwnik, melanina, pełni
w wypadku tego gatunku rolę radioprotektora i zwiększa
jego radioodporność [15].
Promieniowanie gamma stosowane jest także do sterylizacji (przede wszystkim odgrzybiania) zbóż [5]. Dawka
4 kGy powoduje całkowite usunięcie grzybów z ziaren
Oryza sativa (ryż siewny) i Cicer arietinum (ciecierzyca
pospolita) oraz eliminuje ryzyko zatrucia niebezpiecznymi
toksynami produkowanymi przez niektóre gatunki grzybów
zasiedlających te zboża [18]. Ponadto, zastosowanie takich
dawek promieniowania gamma nie wpływa znacząco na potencjał kiełkowania tych zbóż [18].
Podobnie, jak w przypadku bakterii, zaobserwowano
wpływ tlenu na skuteczność eliminacji grzybów. Zauważono, że dawka eliminująca 99.9% zarodni Rhizopus stolonifer zmienia się z 3 kGy w środowisku tlenowym do 4 kGy
w środowisku beztlenowym [2].
Mechanizmy działania
promieniowania gamma na mikroorganizmy
Śmierć komórki pod wpływem promieniowania gamma nie jest natychmiastowa. Niektóre z funkcji komórki
mogą być zachowane po gamma napromieniowaniu [2].
Związane jest to często z dużą odpornością enzymów, które
mogą pozostać aktywne nawet po zaabsorbowaniu bardzo
wysokich dawek promieniowania [2,11]. Zaobserwowano,
że napromieniowanie gleby dawką 20 kGy, która skutecznie eliminuje zdecydowaną większość grzybów i bakterii,
nie powoduje dezaktywacji enzymów [11]. Nawet po tak
wysokiej dawce promieniowania gamma, fosfatazy, urazy,
sacharozy czy inne enzymy proteolityczne pozostają aktywne jeszcze przez wiele tygodni [11]. Napromieniowanie
gleby dawką 75 kGy zmniejszyło aktywność fosfataz do
około 70% aktywności wyjściowej, dekarboksylaz o 0.5%
w stosunku do aktywności wyjściowej, a aktywność ureaz
nie uległa zmianie [11]. Podobnie jak w przypadku bakterii
czy grzybów obecność wody zwiększa wrażliwość enzymów na promieniowanie gamma [11].
Komórka jest najbardziej wrażliwa na promieniowanie
gamma w fazie S (podziału komórkowego) [2]. Promieniowanie gamma oddziaływując z mikroorganizmem może powodować jego uszkodzenia bezpośrednie (jonizacja powoduje uszkodzenia DNA <mutacje>, które często są letalne),
może również działać pośrednio przez produkty jonizacji
(radiolizy) wody czy innych struktur komórki. Wytworzone
w ten sposób reaktywne formy tlenu (w tym wolne rodniki)
mogą zaburzać działanie podstawowych struktur organizmu
i prowadzić do śmierci komórki [11].
Większa odporność niektórych mikroorganizmów na
promieniowanie gamma wynika z rozwiniętych mechanizmów naprawczych. Zmienione zasady azotowe są enzymatycznie wycinane, a brakujące elementy łańcucha DNA
są odbudowywane na podstawie nici komplementarnej [2].
Niektóre mikroorganizmy, jak np.: jednokomórkowy glon
Euglena gracilis posiada system chroniący DNA aktywowany światłem białym [19].
W przypadku niektórych mikroorganizmów (np.: Cladosporium spp.) funkcje radioprotekcyjne może pełnić produkowana i magazynowana w grzybni melanina [15].
Piśmiennictwo
1. Farkas J. Microbiological of irradiated foods. Int J Microbiol 1989; 9: 1-45.
2. Zagórski ZP. Sterylizacja radiacyjna. Warszawa: PZWL;
1991.
3. Katušin-Ražem B, Novak B, Ražem D. Microbiological
decontamination of botanical raw materials and corresponding pharmaceutical products by irradiation. Rad
Phys Chem 2001; 62: 261-275.
4. Farkas G, Gazsó LG, Diósi G. Radiosensitivity of subterranean bacteria in the Hungarian upper permian siltstone formation. J Env Rad 2002; 61: 233-239.
5. Jo C I wsp. Inactivation of foodborne pathogens in marinated beef rib by ionizing radiation. Food Microbiol
2004; 21: 543-548.
6. Borsa J i wsp. Radiosterilization: enhancing the radiation inactivation of foodborne bacteria. Rad Phys Chem
2004; 71: 135-139.
7. McNamara NP i wsp. The sensitivity of a forest soil
microbial community to acute gamma-irradiation. Appl
Soil Ecol 2007; 37: 1-9.
8. Ishii N i wsp. Takahashi S. Impact of gamma irradiation
on the transformation efficiency for extracellular plasmid DNA. J Env Rad 2007; 97: 159-167.
9. Pourahmad R, Pakravan R. Radiosterilization of disposable medical devices. Radiat Phys Chem 1997; 49: 285286.
10. Ražem D, Katušin-Ražem B. Dose requirements for microbial decontamination of botanical materials by irradiation. Rad Phys Chem 2002; 63: 697-701.
11. McNamara NP i wsp. Effects of acute gamma irradiation
on chemical, physical and biological properties of soils.
Appl Soil Ecol 2003; 24: 117-132.
45
12. Lim YH, Hamdy MK, Toledo RT. Combined effects of
ionizing-irradiation and different environments on Clostridium botulinum type E spores. Int Food Microbiol
2003; 89: 251-263.
13. Parker FE, Vincent JM. Sterilization of peat by gamma
radiation. Plant Soil 1962; 94: 71-74.
14. Kamat A i wsp. Low-dose irradiation as a measure to
improve microbial quality of ice cream. Int J Food Microbiol 2000; 62: 27-35.
15. Da Silva M i wsp. Inactivation of fungi from deteriorated paper materials by radiation. Int Biodeter Biodegr
2006; 57: 163-167.
16. Adu-Gyamfi A, Nketsia-Tabiri J, Apea Bah F. Radiosensitivities of bacterial isolates on minced chicken and poached
chicken meal and their elimination following irradiation
and chilled storage. Rad Phys Chem 2008; 77: 174-178.
17. Kim IG, Oh TJ. SOS induction of the recA gene by UV-,
γ-irradiation and mitomycin C is mediated by polyamines
in Escherichia coli K-12.Tox Lett 2000; 116: 143-149.
18. Maity JP i wsp. Radiation-induced effects on some common storage edible seeds in India infested with surface
microflora. Rad Phys Chem 2004; 71: 1065-1072.
19. Hayashi H i wsp. Light dependency of resistance to ionizing radiation in Euglena gracilis. J Plant Physiol 2004;
161: 1101-1106.
Sławomir Wilczyński
Katedra i Zakład Biofizyki, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM w Katowicach
tel. 32-3641162,
kom. 507169625; e-mail: [email protected]
46
Białko opiekuńcze GRP94 i jego rola w terapii nowotworów
Chaperon GRP94 and its role in anti-cancer therapy
Marzanna Cechowska-Pasko
Zakład Biochemii Farmaceutycznej
Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
Kierownik Zakładu: Marzanna Cechowska-Pasko
Streszczenie
Summary
Indukcja białek chaperonowych, należących do rodziny GRP (białka regulowane przez glukozę), jest mechanizmem obronnym komórek, adaptującym je do stresu
retikuloendoplazmatycznego. Jednym z nich jest białko
GRP94. Specyficzne warunki stresowe, niedobór glukozy czy hipoksja, w mikrośrodowisku guzów litych mogą
prowadzić do indukcji GRP. Poznano budowę GRP94
oraz niektóre czynniki i mechanizmy regulujące jego
ekspresję. Podczas gdy wzmożona ekspresja GRP może
zmniejszać uszkodzenie organów narażonych na stres RE,
ich indukcja w komórkach nowotworowych i antyapoptotyczne działanie może pobudzać rozwój nowotworów
i powodować ich oporność na leki. Wyjaśnienie funkcji
GRP i regulacji ich syntezy otwiera nowe możliwości
w leczeniu nowotworów oraz chorób związanych z zaburzeniami homeostazy siateczki endoplazmatycznej.
The induction of chaperon proteins, which belong to GRPs
(glucose-regulated proteins) family, is a mechanism which
protects the cells against the endoplasmic reticulum stress.
GRP94 is a member of GRPs family. Solid tumours are
often placed under stress conditions, such as glucose starvation and hypoxia. These conditions result in enhanced
expression of GRPs. The structure as well as some factors
and mechanisms which regulate the expression of GRP94
were described. Whereas GRPs overexpression could limit
damage in organs exposed to ER stress, the anti-apoptotic
function of the GRPs also predicts that their induction in
neoplastic cells could lead to cancer progression and drug
resistance. The explanation of GRPs function and regulation of their synthesis create new therapeutic possibilities
in neoplasm diseases and those induced by endoplasmic
reticulum stress.
Słowa kluczowe: białka chaperonowe, GRP94, siateczka
endoplazmatyczna, terapia nowotworów
Key words: chaperons, GRP94, endoplasmic reticulum,
anti-cancer therapy
Wstęp
Formowanie struktury przestrzennej białka i jej stabilność jest w dużym stopniu uzależniona od ich interakcji
z białkami opiekuńczymi (ang. molecular chaperones). Chaperony wiążą się w sposób odwracalny
z niesfałdowanym fragmentem polipeptydu, który w innym przypadku mógłby służyć jako ośrodek agregacji
lub błędnego fałdowania nowopowstałych cząsteczek.
Białka, które wchodzą w interakcję z chaperonami, są
określane jako ich substraty. Białka opiekuńcze wiążą się
z częściowo sfałdowanymi łańcuchami umożliwiając im
kontynuację zwijania się w sposób najbardziej korzystny
energetycznie. Pomagają białkom w porządkowaniu ich
struktury przestrzennej, a niektóre z nich chronią białka
komórkowe przed skutkami działania czynników stresowych; hipertermii, głodu, niedotlenienia, infekcji, toksyn,
promieniowania UV. [1,2]
Białka opiekuńcze cechują się wysokim powinowactwem
do hydrofobowych odcinków łańcuchów polipeptydowych
i wykazują aktywność ATP-azową [1,3]. Występują one
w cytosolu, w organellach cytoplazmatycznych, takich jak:
mitochondria i siateczka endoplazmatyczna oraz w jądrze
komórkowym [1,3-5]. Fałdowanie bądź renaturacja białek
wymaga energii w postaci ATP. W jej uwalnianiu uczestniczy aktywność ATP-azowa chaperonów.
Niedobór glukozy pobudza ekspresję różnych białek
opiekuńczych w siateczce śródplazmatycznej, tzw. GRPs
(glucose-regulated proteins) [6,7]. Jednym z nich jest białko GRP94 [8]. Wartość liczbowa, następująca po symbolu
GRP, oznacza masę cząsteczkową tego białka, wyrażoną
w kilodaltonach. Indukcja białek należących do rodziny
GRP jest mechanizmem obronnym komórek, przystosowującym je do stresu retikuloendoplazmatycznego (stres RE),
powodowanego głównie przez niedobór tlenu [5] i niedostatek glukozy, jako substratu energetycznego [9-11].
Budowa GRP94
Dojrzałe szczurze białko GRP94 składa się z 782 reszt
aminokwasowych. Monomeryczna postać tego białka powstaje po odcięciu sekwencji sygnałowej, złożonej z 21
reszt aminokwasowych. W białku tym można wyróżnić kilka domen strukturalnych (Ryc.1), ale ich znaczenie funkcjonalne nie zostało dotąd dostatecznie poznane. Sekwen-
47
Ryc.1. Model struktury GRP94. Dwa monomery tego białka asocjują ze sobą za pomocą domeny dimeryzacji tworząc dimer. Sekwencja
N-końcowa i C-końcowy tetrapeptyd KDEL są odpowiedzialne za kierowanie GRP94 do siateczki śródplazmatycznej. N-końcowa domena
jest miejscem miejscem wiązania nukleotydów, antybiotyków (geldanamycyna, radicicol) oraz oligosacharydów (CHO). Pierwsza z domen
kwasowych jest odpowiedzialna za regulację wiązania leków. Aminokwasy od 421 do 448 tworzą 7 powtarzających się sekwencji, podobnych do tzw. „suwaka leucynowego”, które mogą być odpowiedzialne za interakcje białko-białko. Domena ta posiada trzy miejsca glikozylacji
(XXX). Następna domena o nieznanej funkcji, od 559 do 609 aminokwasu, zawiera sekwencję KEKE, która prawdopodobnie odpowiada
za interakcje między białkami [12]. Fragment C-końcowy, zbudowany z 60 aminokwasów, stanowi drugą domenę kwasową, homologiczną
z domenami występującymi w wielu białkach jądrowych, także w czynnikach transkrypcyjnych, regulujących funkcję polimerazy RNA.
cja aminokwasowa N-końcowej domeny GRP94 wykazuje
wysoki stopień homologii do innego białka chaperonowego;
HSP90. Jest ona miejscem wiązania nukleotydów, oligosacharydów oraz antybiotyków (geldanamycyna, radicicol).
Po niej występuje domena kwasowa, która w GRP94 jest
krótsza niż w homologicznej domenie HSP90. Jest ona odpowiedzialna za regulację wiązania leków.
Aminokwasy od 421 do 448 tworzą 7 powtarzających się
sekwencji, podobnych do tzw. „suwaka leucynowego”, które
mogą być odpowiedzialne za interakcje białko-białko. Domena
ta posiada trzy miejsca glikozylacji (Ryc.1). Następna domena
o nieznanej funkcji, od 559 do 609 aminokwasu, zawiera sekwencję Met-Gln-Met-Gln, wyrażaną w jednoliterowym
kodzie aminokwasowym, jako KEKE, która prawdopodobnie odpowiada za interakcje między białkami [12]. Fragment
C-końcowy, zbudowany z 60 aminokwasów, stanowi drugą
domenę kwasową, homologiczną z domenami występującymi
w wielu białkach jądrowych, także w czynnikach transkrypcyjnych, regulujących funkcję polimerazy RNA. N-końcowa sekwencja sygnałowa i C-końcowy tetrapeptyd Lys-Asp-Glu-Leu
(KDEL w kodzie jednoliterowym) kierują GRP94 do siateczki
endoplazmatycznej. Białko to występuje w postaci dimeru (Ryc.1)
[13]. Asocjację monomerów składowych umożliwiają fragmenty
C-końcowe, zwane domenami dimeryzacji (23 kDa), a ściślej 44aminokwasowy fragment tej domeny wykazuje autonomiczną aktywność dimeryzacji na drodze interakcji hydrofobowych [8].
Posttranslacyjne modyfikacje GRP94
GRP94 jest glikoproteiną, która posiada sześć potencjalnych miejsc glikozylacji. Są nimi atomy azotu zawarte w
grupach amidowych reszt asparaginy (Asn), ale zazwyczaj
tylko Asn196 jest glikozylowana [14]. W warunkach fizjologicznych GRP94 występuje w siateczce śródplazmatycznej.
W łańcuchach oligosacharydowych dominuje mannoza. Są
one wrażliwe na hydrolityczne działanie endoglikozydazy
H. W warunkach fizjologicznych GRP94 jest w małym stopniu glikozylowane. Proces ten nasila się, kiedy ekspresja
48
tego białka rośnie [15]. Glikozylacja GRP94 nie jest warunkiem
jego zdolności do interakcji z substratami białkowymi. Zaobserwowano bowiem, iż nawet nieglikozylowane GRP94 może
także asocjować z nowo powstającymi polipeptydami [16].
GRP94 może być fosforylowane. Miejscem wiązania
fosforanu są reszty serylowe i treonylowe, natomiast reszty
tyrozylowe nie ulegają fosforylacji. Nie jest poznany mechanizm enzymatyczny tego procesu. In vitro fosforylacja
GPR94 jest katalizowana przez kinazę kazeinową II [17],
jednak nie wykryto tego enzymu w siateczce śródplazmatycznej. Fosforylacja reguluje aktywność GRP94. Przykładem jest zanik zdolności fosforylowanego GRP94 do interakcji z lekkimi łańcuchami immunoglobulin [16].
Wiązanie wapnia
GRP94 jest białkiem zdolnym do wiązania dużej ilości
wapnia, chociaż powinowactwo tego białka do Ca2+jest niewielkie. Jest ono jednym z głównych białek regulujących
homeostazę wapnia w siateczce śródplazmatycznej. Posiada
15 miejsc wiązania Ca2+, z których 4 wykazują umiarkowane
powinowactwo (KD ~2 µM) i 11 niskie powinowactwo (KD
~600 µM) [18]. Miejsca wiązania wapnia są rozmieszczone
w kilku ujemnie naładowanych rejonach monomeru GRP94.
Związanie wapnia z GRP94 moduluje strukturę i aktywność tego białka. In vitro, obecność Ca2+ w stężeniu 100 nM
powoduje zmianę konformacji, polegającą na zmniejszeniu
udziału struktury α-helikalnej z 40% do 34% [18]. Oczyszczone GRP94, in vitro, w obecności Ca2+wiąże kalmodulinę, hamując tą drogą jego interakcję z filamentami aktynowymi [19].
Jest prawdopodobne, że związanie wapnia reguluje interakcje
GRP94 z białkami siateczki śródplazmatycznej także in vivo.
Wiązanie leków/ATP
N-końcowy, 35 aminokwasowy fragment dojrzałego
białka GRP94 wykazuje unikatową sekwencję, bez cech
homologii z HSP90 (Fig.1), podczas gdy sekwencja 35-274
jest wysoce homologiczna do fragmentu 9-236 ludzkiego
HSP90 oraz do fragmentu 1-220 HSC82 drożdży [20,21].
W HSP90 ta domena odpowiadająca za fałdowanie białek,
pośredniczy w wiązaniu trzech strukturalnie niepodobnych
małych cząsteczek: ATP oraz leków przeciwnowotworowych: geldanamycyny i radicicolu. Wszystkie trzy cząsteczki wiążą się z tym samym miejscem w cząsteczce GRP94.
Miejsce wiązania tworzy wiele helis, które są ułożone na powierzchni utworzonej przez strukturę pofałdowanej kartki.
W GRP94 wszystkie reszty aminokwasowe, zaangażowane
w tworzenie miejsc wiążących są wysoce konserwatywne,
wiążą geldanamycynę i radicicol na drodze mechanizmu
zależnego od ATP [22]. Zapotrzebowanie na wiązanie ATP/
leków jest różne pomiędzy HSP90 i GRP94. Podczas gdy
w HSP90 N-końcowa domena jest wystarczająca do wiązania, w GRP94 dodatkowo konieczna jest pierwsza kwasowa domena (266-347) [22]. Ta różnica pomiędzy GRP94,
a HSP90 może mieć znaczenie w przypadku kiedy lek musi
rozróżnić te dwa białka. Wykazano, że związanie geldanamycyny przez GRP94 ma ważne funkcjonalne konsekwencje. Wykazano, że kompleks GRP94 z geldanamycyną
i białkiem erbB2 – jednym z substratów tego chaperonu,
rozpada się i substrat jest kierowany do degradacji w proteasomach [23,24]. Wiązanie radicicolu wywołuje podobny
efekt na losy lekkich łańcuchów immunoglobulin, które są
także substratem tego chaperonu.
Wiązanie białek
Zasadniczą różnicą pomiędzy GRP94 a białkami opiekuńczymi takimi jak GRP78 czy kalneksyna jest fakt, że
GRP94 wchodzi w interakcje ze ściśle określonymi substratami białkowymi. Podczas gdy GRP78 rozpoznaje
i wiąże się z dużą liczbą białek, które podlegają fałdowaniu w siateczse śródplazmatycznej, kalneksyna rozpoznaje glikanową część wspólną dla wielu glikoprotein,
GRP94 asocjuje ze ściśle określonymi kilkoma białkami:
z łańcuchami immunoglobulin [25], z białkiem MHC klasy
II [26], tyreoglobuliną [27], białkiem erbB2 [23], glikoproteinami herpes virus [28], z apolipoproteiną B [29], kolagenem [30], białkiem C [31] oraz białkiem BSDL [32]. Nie
oddziaływuje natomiast z wieloma innymi glikoproteinami
wirusowymi, nawet z białkiem MHC klasy I. Przypuszczalnie ta specyficzność substratowa jest funkcją struktur białkowych, które GRP94 rozpoznaje.
Interakcje z łańcuchami lekkimi immunoglobulin jest
relatywnie dobrze zbadana. Preferowanym substratem jest
prekursor w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego, połączony wiązaniami siarczkowymi [33,34]. Asocjacja
z GRP94 występuje przez większość czasu, kiedy łańcuchy
lekkie immunoglobulin przebywają w siateczce śąródplazmatycznej, w przeciwieństwie do interakcji z GRP78, które
występują w pierwszych kilku minutach po zsyntetyzowaniu
immunoglobulin [33]. Podczas syntezy MHC klasy II, GRP94
wiąże się z prekursorem w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego [26]. W przypadku esterazy cholesterolowej GRP94 wiąże się mocno z natywnym białkiem i transportuje je. GRP94 wydaje się asocjować z prekursorem białka w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego czy
z niekompletnie utworzonym oligomerem, ale nigdy z formą wczesną fałdującego się białka. Ta preferencja łączenia
się ze sfałdowanym prekursorem białka jest również zgodna
z preferencjami HSP90 do substratów podczas rozwijania
ich struktury in vitro [35-37]. Podczas wiązania z białkiem
w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego GRP94
uczestniczy w jego zatrzymywaniu w siateczce śródplazmatycznej, podobnie jak inne białka opiekuńcze, ale brak na to
bezpośrednich dowodów.
Inną cechą oddziaływań GRP94 z białkami jest fakt,
że każdy z jego substratów białkowych wykazuje zdolność do interakcji zarówno z GRP78 jak i kalneksyną
[26,27,30,33,38]. Spostrzeżenia te sugerują, iż w ochronie
nowosyntetyzowanych białek i w ułatwianiu ich fałdowania
współdziałają różne białka opiekuńcze.
Przez analogię do HSP90 jest prawdopodobnym, że
działanie GRP94 nasila się poprzez interakcje z innymi białkami opiekuńczymi. Ponadto, nie ma dowodów na istnienie
w siateczce śródplazmatycznej homologów, zasocjowanych
z HSP90 białek tj. p23, Hop, FKBP51 czy Cyp40 [39,40].
Podsumowując, GRP94 jest specyficznym białkiem
opiekuńczym, zaangażowanym w późnym stadium zwijania łańcucha peptydowego prekursorów syntezowanego
białka, który współpracuje z innymi białkami opiekuńczymi. Zatem, w świetle siateczki śrórplsazmatycznej
występuje system chaperonów bardzo podobny w komórkach eukariotycznych, jak i u bakterii, gdzie GRP94
bierze udział w procesie fałdowania, jako „kończące”
białko opiekuńcze [34]. Ważnym celem dalszych badań
jest sprecyzowanie cech strukturalnych, które powodują
wiązanie GRP94.
Wiązanie peptydów
Liczne dowody sugerują, że GRP94 wiąże peptydy.
Najbardziej przekonywujących dowodów dostarczają badania immunologiczne Srivastava i wsp. [41], Arnolda
i wsp. [42] oraz elucja antygenu peptydowego pochodzącego
z oczyszczonego GRP94 z komórek zainfekowanych wirusem pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej – VSV [43].
W innym układzie doświadczalnym Lammerta i wsp. [44]
wprowadzono światłoczułe peptydy do cytosolu używając
streptolizyny O. Peptydy te asocjowały tylko z kilkoma białkami siateczki śródplazmatycznej. Głównym akceptorem była
izomeraza disiarczkowa oraz GRP94 [44]. Większość z tych
peptydów posiada właściwości peptydów przenoszonych przez
białka transportujące w siateczce śródplazmatycznej związane
z prezentacją antygenu. Ponadto badano grupę białek, które
były systematycznie mutowane w pozycji 2 i 9. GRP94 przyłączał się preferencyjnie do peptydów z aminokwasami pozbawionymi ładunku w tych pozycjach [45]. Te badania wykazały
specyficzność wiązania peptydów przez GRP94.
Peptydy wiążące się z GRP94 wchodzą do siateczki endoplazmatycznej zarówno przy udziale białek transportujących, związanych z prezentacją antygenu (TAP) jak i drogą
niezależną od tych transporterów, co sugeruje że GRP94
włącza je do całkowitej puli peptydów siateczki śródplazmatycznej [44-46]. Nie znaleziono wspólnego fragmentu
49
znajduje się miejsce wiązania peptydu. Prawdopodobnie występują inne czynniki
zaangażowane in vivo, które
ułatwiają te procesy.
Obecny stan wiedzy na
temat aktywności wiązania
peptydów przez GRP94 nie
pozwala określić zakresu
substratów białkowych oraz
ich preferencji do fałdowania
prekursorów. Badania białka
HSP90 wykazały, że posiada
ono oddzielne miejsca wiązania peptydów, jedno na każdym końcu cząsteczki [49,50]
oraz dodatkowo C-końcowa
domena może wiązać białka
zawierające powtarzający się
fragment (tetratrico peptide
repeat – TPR) [51]. Prawdopodobnie GRP94 jest zbudowany podobnie, posiada
miejsce wiązania peptydów
oddzielone od domeny interakcji z innymi białkami.
Rola ATP w funkcjonowaniu GRP94
Zasadniczym problemem
w badaniach nad GRP94
i innymi białkami z grupy
HSP90, jest relacja pomięRyc.2. Indukcja GRP i ochrona komórki. Stres retikuloendoplazmatyczny aktywuje transkrypcję genów
wiązaniem substratu,
GRP za pośrednictwem sekwencji ERSE, czego skutkiem jest wzrost ekspresji białek chaperonowych. dzy
Pobudzanie promotora GRP może być wykorzystane do transkrypcji celowanej w terapii genowej. Eks- a wiązaniem i hydrolizą ATP.
presja GRP może być blokowana na poziomie transkrypcji przez leki hamujące ich syntezę np. geniste- Wszystkie białka opiekuńina. Stabilność i translacja GRP może być także hamowana przez stosowanie wektorów z rybozymami,
czewiążące peptydy, któczy antysensami. Hamowanie syntezy GRP w warunkach stresu retikuloendoplazmatycznego prowadzi
rych działanie jest poznane
do podwyższonej cytotoksyczności i apoptozy.
w szczegółach, wykazują akw budowie tych peptydów, który wymusza wiązanie się tywność ATP-azową. Wykazano, że GRP94 wiąże [52,53]
z GRP94. Nawet w przypadku kiedy średnio powinowac- i hydrolizuje ATP [54]. Jednak aktywność ATP-azowa GRP94
two GRP94 do peptydów jest 10 razy niższe niż do MHC jest niższa niż GRP78, a zdolność do wiązania ATP jest przyklasy I, nadmiar GRP94 (i innych białek wiążących peptydy najmniej 20 razy słabsza niż w przypadku GRP78 [53]. Pow świetle ER) działa jak „zlew” znacznie zmniejszający nadto wiązanie peptydów in vitro przez GRP94 jest niezależne
pulę wolnych peptydów w świetle siateczki śródplazma- od ATP [55], asocjacja z łańcuchami immunoglobulin in vivo
tycznej. Nie ma wyraźnych przesłanek, że GRP94 asocjuje jest utrzymywana nawet, gdy zawartość ATP w komórce jest
z kompleksami białek TAP jak również nie jest bezpośred- bardzo niska [25]. Dlatego rola nukleotydów adeninowych
nio przyciągany przez klasę I peptydów [47].
w funkcjonowaniu GRP94 jest ciągle nieznana.
Wiązanie GRP94 przez peptydy in vitro powoduje zmiany konformacyjne, które wykazano przez rosnące wiązanie
barwników hydrofobowych, fluorescencji Trp i wrażliwości
na proteazy [48]. Obecne badania nie pozwalają na wyznaczenie powinowactwa GRP94 do peptydów, ale umożliwiają wyjaśnienie mechanizmu wiązania peptydów. Jest bardzo
ważnym wyznaczenie, dlaczego przyłączenie peptydu do
GRP94 jest nieefektywne w porównaniu z białkami opiekuńczymi takimi jak GRP78, jaki mechanizm prowadzi
do odłączenia peptydu i w jakiej części cząsteczki GRP94
50
GRP jako cel chemioterapii nowotworów
Podczas gdy wzmożona ekspresja GRP może zmniejszać
uszkodzenie organów narażonych na stres ER, ich indukcja
w komórkach nowotworowych i antyapoptotyczne działanie
może pobudzać rozwój nowotworów i powodować ich oporność na leki (Ryc.2). W różnych liniach komórek nowotworowych i w guzach ludzkich, poziom GRP78 i GRP94 jest
podwyższony i koreluje ze złośliwością guza [7,56]. Dodatkowo wykazano, że wzmożona indukcja GRP78 chroni ko-
mórki nowotworowe, podczas gdy zahamowanie ekspresji
tego białka nasila apoptozę, hamuje wzrost guza i zwiększa
podatność na działanie czynników cytotoksycznych [7,57].
Dlatego celowane hamowanie ekspresji i funkcji GRP w komórkach nowotworowych jest nowym kierunkiem w chemioterapii nowotworów.
Genisteina, flawonoid o działaniu przeciwnowotworowym, zmniejsza syntezę GRP, hamuje wzrost guzów indukowanych karcynogenami u szczurów oraz komórek ludzkiej białaczki, przeszczepianych do myszy [58]. Wykazano
także, że GRP94 asocjuje z erbB2 (także określany jako
HER-2/neu), który ulega powszechnie ekspresji w raku sutka i jest związany ze złym rokowaniem [59]. Traktowanie
komórek raka sutka geldanamycyną pobudza rozpad kompleksów GRP94-p185 i degradację p185.
Indukcja GRP w wielu liniach ludzkich komórek nowotworowych nadaje im oporność na leki będące inhibitorami
topoizomerazy II (np. etoposid) [60,61]. Bezpośrednie hamowanie syntezy GRP94 metodą wbudowywania antysensów
skutkuje zwiększoną wrażliwością na cytotoksyczne działanie
leku cytostatycznego - etoposidu [62]. Apoptozie wywołanej
przez etoposid towarzyszy proteoliza GRP94 katalizowana
przez kalpainę, która także trawi antyapoptotyczne białko Bcl
-xL, przekształcając je w białko proapoptotyczne [62,63].
Specyficzne warunki stresowe w mikrośrodowisku guzów litych mogą prowadzić do indukcji GRP. Funkcja chaperonowa GRP jest konieczna do ich działania cytoprotekcyjnego. Prawdopodobnie zatrzymują one nowo syntetyzowane receptory czynników wzrostowych w siateczce
śródplazmatycznej. Wynikający stąd niedobór receptorów
błonowych prowadzi do zahamowania podziału komórek
w fazie G1 i oporności na leki cytotostatyczne działające
w fazie S cyklu komórkowego [60]. Inny mechanizm ochrony, w którym pośredniczą GRP, polega na ich interakcji
z czynnikami proapoptotycznymi, co zmniejsza ich aktywność
a w konsekwencji skuteczność farmakoterapii nowotworów.
Rola GRP w immunoterapii
Wykazano, że GRP94 towarzyszy wielu peptydom, zarówno tym, które powstają przez degradację białek prawidłowych, jak i białek nowotworowych, bakteryjnych, czy
wirusowych [64]. Nowotworowy GRP94 przenosi peptydy
antygenowe guza na powierzchnię komórki. W podobny
sposób GPR94 syntetyzowany w komórkach zainfekowanych przez wirusy przenosi antygeny wirusowe na powierzchnię komórki. Procesy te noszą nazwę prezentacji antygenu. W warunkach prawidłowych GRP94 jest zlokalizowany wewnątrz komórki. Rozpad komórek nekrotycznych
uwalnia kompleksy GRP94-peptyd, które są przenoszone
na powierzchnię żywych komórek. Prezentacja antygenów
peptydowych na powierzchni komórek prowadzi do stymulacji limfocytów T i odpowiedzi prozapalnej.
Kompleksy GRP94 z peptydami wywołują odpowiedź
immunologiczną specyficzną dla chronionych przez GRP94
antygenów peptydowych [65]. Nie obserwowano autoimmunizacji, co sugeruje, że odpowiedź immunologiczna jest
skierowana przeciwko peptydom, a nie przeciwko GRP94.
Wykorzystując wnioski z badań na zwierzętach podjęto
próbę immunizacji pacjentów onkologicznych kompleksami
GRP94-peptyd, pochodzącymi z ich własnych nowotworów.
Ten eksperyment terapeutyczny stwarza perspektywę uzyskania specyficznej szczepionki, przydatnej w immunoterapii
ludzkich nowotworów [65]. Ostatnio wykazano, że także inne
białko z rodziny GRP, określane symbolem GRP170/ORP150,
jest skuteczne jako szczepionka przeciwnowotworowa [66].
Promotor genu GRP78
w przeciwnowotworowej terapii genowej
W agresywnych nowotworach na skutek niedokrwienia i braku składników odżywczych miejscowo rozwija się
hipoksja i kwasica. W tych warunkach dochodzi do specyficznej aktywacji promotora genu GRP78. Użycie indukowanego przez stres promotora GRP78, jako nośnika
w celu wprowadzenia terapeutycznego genu samobójczego,
otwiera nowe możliwości terapii genowej słabo unaczynionych guzów czy chorób niedokrwiennych. Enzym, kodowany
przez terapeutyczny gen samobójczy, umożliwia przekształcenie nieaktywnego proleku w aktywny lek, którego działanie
zwiększa wrażliwość komórki nowotworowej na chemio- lub
radioterapię, prowadząc w konsekwencji do jej śmierci.
Promotor GRP78 cechuje się wyższą efektywnością
niż promotory wirusowe w niszczeniu dużych guzów, np.
doświadczalnych mysich nowotworów: włókniakomięsaka
i raka sutka [67,68]. Dodatkowo promotor genu GRP78 jest
zawsze pobudzany w przebiegu terapii laserowej (terapia
fotodynamiczna), która pobudza rozwój stresu oksydacyjnego i niedokrwienie in vivo [69], umożliwiając kontrolowaną
ekspresję genu terapeutycznego.
Praktyczne aspekty badań
nad białkami opiekuńczymi
Odkrycie GRP78 i GRP94 zapoczątkowało gwałtowny
rozwój wiedzy na temat syntezy i funkcji GRP w hodowlach
komórkowych. Współczesne badania skupiają się na fizjologicznej roli GRP in vivo i zmierzają do poznania ich roli
w patomechanizmie i farmakoterapii chorób nowotworowych. Już wiadomo, że indukcja chaperonów w komórkach
nowotworowych i ich antyapoptotyczne działanie może
pobudzać rozwój nowotworów i powodować ich oporność
na leki. Postęp w badaniach nad farmakologiczną regulacją
syntezy GRPs otwiera nowy kierunek w leczeniu nowotworów oraz chorób związanych z zaburzeniami homeostazy
siateczki endoplazmatycznej.
Piśmiennictwo
1. Wójcik C, Moskalewski S. Wybrane procesy cytoplazmatyczne. W: Seminaria z cytofizjologii dla studentów
medycyny, weterynarii i bologii. Red. Kawiak J, Zabel
M Urban & Partner. Wrocław 2002, 214-215.
2. Widłak W. Odpowiedź na stres komórkowy I ekspresja
genów Hsp 70 w męskich komórkach rozrodczych. Postepy Biochem 2006; 52: 289-295.
51
3. Marzec Ł i wsp.: Białka szoku termicznego 72 (Hsp72) w
chorobach nerek. Nefrol Dial Pol 2007; 11: 78-82.
4. Little E i wsp.: The glucose- regulated proteins (GRP78
and GRP94): functions, gene regulation, and applications.
Crit Rev Eukaryot Gene Expr 1994; 4: 1-18.
5. Cechowska-Pasko M, Bańkowski E, Chene P. The effect of
hypoxia on the expression of 150 kDa oxygen-regulated
protein (ORP 150) in HeLa cells. Cell Physiol Biochem
2006; 17: 89-96.
6. Lee AS. Mammalian stress response: induction of the glucose-regulated protein family. Curr Opin Cell Biol 1992;
4: 267–273.
7. Little E i wsp.: The glucose-regulated proteins (GRP78
and GRP94): functions, gene regulation, and applications.
Crit Rev Eukaryotic Gene Expr 1994; 4: 1–18.
8. Wearsch PA, Nicchitta CV. Endoplasmic reticulum chaperone GRP94 subunit assembly is regulated through a
defined oligomerization domain. Biochemistry 1996; 35:
16760–16769.
9. Cechowska-Pasko M, Bańkowski E, Chene P. Glucose effect on the expression of 150 kDa oxygen-regulated protein in HeLa cells. Biochem Biophys Res Commun 2005;
337: 992-997.
10. Cechowska-Pasko M, Pałka J, Bańkowski E. Glucose-depleted medium reduces the collagen content of human skin
fibroblast cultures. Mol Cell Biochem 2007; 305: 79-85.
11. Cechowska-Pasko M, Surażyński A, Bańkowski E. The effect of glucose deprivation on collagen synthesis in fibroblast
cultures. Mol Cell Biochem 2009; 327: 211-218.
12. Realini C, Rogers SW, Rechsteiner M. KEKE motifs.
Proposed roles in protein–protein association and presentation of peptides by MHC class I receptors. FEBS Lett
1994; 348: 109–113.
13. Wearsch PA, Nicchitta CV. Purification and partial molecular characterization of GRP94, an ER resident chaperone. Prot Expr Pur 1996; 7: 114–121.
14. Qu D, Mazzarella RA Green M. Analysis of the structure and
synthesis of GRP94, an abundant stress protein of the endoplasmic reticulum. DNA Cell Biol 1994; 13: 117–124.
15. Lenny N, Green M. Regulation of endoplasmic reticulum
stress proteins in COS cells transfected with immunoglobulin u heavy chain cDNA. J Biol Chem 1991; 266:
20532–20537.
16. Melnick J. Duke Univ, PhD thesis 1995.
17. Cala SE, Jones LR. GRP94 resides within cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles and is phosphorylated by casein kinase II. J Biol Chem 1994; 269: 5926–5931.
18. Van PN, Peter F, Soling HD. Four intracisternal calcium-binding glycoproteins from rat liver microsomes with high affinity for calcium. No indication for calsequestrin-like proteins
in inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive calcium sequestering
rat liver vesicles. J Biol Chem 1989; 264: 17494–17501.
19. Koyasu S i wsp.: HSP100, a 100-kDa heat shock protein,
is a Ca2+-calmodulin-regulated actin-binding protein. J
Biol Chem 1989; 264: 15083–15087.
20. Stebbins CE i wsp.: Crystal structure of an Hsp90-geldanamycin complex: targeting of a protein chaperone by an
antitumor agent. Cell 1997; 89: 239–250.
21. Prodromou C i wsp.: A molecular clamp in the crystal
structure of the N-terminal domain of the yeast Hsp90
chaperone. Nat Struct Biol 1997; 4: 477–482.
52
22. Schulte TW i wsp.: Interaction of radicicol with members
of the HSP90 family of molecular chaperones. Mol Endocrinol 1999; 13: 1435-1448.
23. Chavany C i wsp.: p185erbB2 binds to GRP94 in vivo.
Dissociation of the p185erbB2/GRP94 heterocomplex
by benzoquinone ansamycins precedes depletion of
p185erbB2. J Biol Chem 1996; 271: 4974–4977.
24. Mimnaugh EG, Chavany C, Neckers L. Polyubiquitination
and proteasomal degradation of the p185c-erbB-2 receptor
protein-tyrosine kinase induced by geldanamycin. J Biol
Chem 1996; 271: 22796–22801.
25. Melnick J, Aviel S, Argon Y. The endoplasmic reticulum
stress protein GRP94, in addition to BiP, associates with
unassembled immunoglobulin chains. J Biol Chem 1992;
267: 21303–21306.
26. Schaiff WT i wsp.: HLA-DR associates with specific
stress proteins and is retained in the endoplasmic reticulum in invariant chain negative cells. J Exp Med 1992;
176: 657–666.
27. Kuznetsov G, Chen LB, Nigam SK. Several endoplasmic
reticulum stress proteins, including ERp72, interact with
thyroglobulin during its maturation. J Biol Chem 1994;
269: 22990–22995.
28. Ramakrishnan M i wsp.: Conformation-defective herpes
simplex virus 1 glycoprotein B activates the promoter of the
grp94 gene that codes for the 94-kD stress protein in the endoplasmic reticulum. DNA Cell Biol 1995; 14: 373–384.
29. Linnik KM, Herscovitz H. Multiple molecular chaperones
interact with apolipoprotein B during its maturation. The
network of endoplasmic reticulum-resident chaperones
(ERp72, GRP94, calreticulin, and BiP) interacts with apolipoprotein b regardless of its lipidation state. J Biol Chem
1998; 273: 21368–21373.
30. Ferreira LR i wsp.: Association of Hsp47, Grp78, and Grp94
with procollagen supports the successive or coupled action of
molecular chaperones. J Cell Biochem 1994; 56: 518–526.
31. Katsumi A i wsp.: Protein C Nagoya, an elongated mutant
of protein C, is retained within the endoplasmic reticulum
and is associated with GRP78 and GRP94. Blood 1996;
87: 4164–4175.
32. Bruneau N, Lombardo D, Bendayan M. Participation of
GRP94-related protein in secretion of pancreatic bile saltdependent lipase and in its internalization by the intestinal
epithelium. J Cell Sci 1998; 111: 2665–2679.
33. Melnick J, Dul JL, Argon Y. Sequential interaction of the
chaperones BiP and GRP94 with immunoglobulin chains in
the endoplasmic reticulum. Nature 1994; 370: 373–375.
34. Melnick J, Argon Y. Molecular chaperones and the biosynthesis of antigen receptors. Immunol Today 1995; 16: 243–250.
35. Wiech H i wsp.: Hsp90 chaperones protein folding in vitro. Nature 1992; 358: 169–170.
36. Jakob U i wsp.: Transient interaction of Hsp90 with early
unfolding intermediates of citrate synthase. Implications for
heat shock in vivo. J Biol Chem 1995; 270: 7288–7294.
37. Freeman BC, Morimoto RI. The human cytosolic molecular chaperones hsp90, hsp70 (hsc70) and hdj-1 have
distinct roles in recognition of a non-native protein and
protein refolding. Embo J 1996; 15: 2969–2979.
38. Ferreira LR i wsp.: Hsp47 and other ER-resident molecular chaperones form heterocomplexes with each other and with collagen type IV chains. Connect Tissue Res 1996; 33: 265–273.
39. Johnson JL, Toft DO. A novel chaperone complex for steroid receptors involving heat shock proteins, immunophilins, and p23. J Biol Chem 1994; 269: 24989–24993.
40. Chen S i wsp.: Differential interactions of p23 and the
TPR-containing proteins Hop, Cyp40, FKBP52 and
FKBP51 with Hsp90 mutants. Cell Stress Chaperones
1998; 3: 118–129.
41. Suto R, Srivastava PK. A mechanism for the specific immunogenicity of heat shock protein-chaperoned peptides.
Science 1995; 269: 1585–1588.
42. Arnold D i wsp.: Cross-priming of minor histocompatibility
antigen-specific cytotoxic T cells upon immunization with the
heat shock protein gp96. J Exp Med 1995; 182: 885–889.
43. Nieland TJ i wsp.: Isolation of an immunodominant viral peptide that is endogenously bound to the stress protein GP96/
GRP94. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 6135–6139.
44. Lammert E i wsp.: The endoplasmic reticulum-resident
stress protein gp96 binds peptides translocated by TAP.
Eur J Immunol 1997; 27: 923–927.
45. Spee P, Neefjes J. TAP-translocated peptides specifically bind proteins in the endoplasmic reticulum, including
gp96, protein disulfide isomerase and calreticulin. Eur J
Immunol 1997; 27: 2441–2449.
46. Arnold D i wsp.: Influences of transporter associated with
antigen processing (TAP) on the repertoire of peptides associated with the endoplasmic reticulum-resident stress
protein gp96. J Exp Med 1997; 186: 461–466.
47. Lammert E i wsp.: Expression levels of stress protein gp96
are not limiting for major histocompatibility complex class
I-restricted antigen presentation. Eur J Immunol 1996; 26:
875–879.
48. Wearsch PA, Voglino L, Nicchitta CV. Structural transitions accompanying the activation of peptide binding to
the endoplasmic reticulum Hsp90 chaperone GRP94. Biochemistry 1998; 37: 5709–5719.
49. Scheibel T, Weikl T, Buchner J. Two chaperone sites in
Hsp90 differing in substrate specificity and ATP dependence. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 1495–1499.
50. Young JC, Schneider C, Hartl FU. in vitro evidence that
hsp90 contains two independent chaperone sites. FEBS
Lett 1997; 418: 139–143.
51. Young JC, Obermann WM, Hartl FU. Specific binding of
tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa
domain of hsp90. J Biol Chem 1998; 273: 18007–18010.
52. Clairmont CA, Maio A De, Hirschberg CB. Translocation
of ATP into the lumen of rough endoplasmic reticulumderived vesicles and its binding to luminal proteins including BiP (GRP 78) and GRP 94. J Biol Chem 1992; 267:
3983–3990.
53. Dierks T i wsp.: A microsomal ATP-binding protein
involved in efficient protein transport into the mammalian endoplasmic reticulum. EMBO J 1996; 15:
6931–6942.
54. Li Z, Srivastava PK. Tumor rejection antigen gp96/grp94
is an ATPase: implications for protein folding and antigen
presentation. EMBO J 1993; 12: 3143–3151.
55. Wearsch PA, Nicchitta CV. Interaction of endoplasmic
reticulum chaperone GRP94 with peptide substrates is
adenine nucleotide-independent. J Biol Chem 1997; 272:
5152–5156.
56. Fernandez PM i wsp.: Overexpression of the glucose-regulated stress gene GRP78 in malignant but not benign human
breast lesions. Breast Cancer Res Treat 2000; 59: 15–26.
57. Jamora C, Dennert G, Lee AS. Inhibition of tumor progression by suppression of stress protein GRP78/BiP induction
in fibrosarcoma B/C10ME. Proc Natl Acad Sci USA 1996;
93: 7690–7694.
58. Zhou Y, Lee AS. Mechanism for the suppression of the
mammalian stress response by genistein, an anticancer phytoestrogen from soy. J Natl Cancer Inst 1998; 90: 381–388.
59. Chavany C i wsp.: p185erbB2 binds to GRP94 in vivo.
Dissociation of the p185erbB2/GRP94 heterocomplex
by benzoquinone ansamycins precedes depletion of
p185erbB2. J Biol Chem 1996; 271: 4974–4977.
60. Tomida A, Tsuruo T. Drug resistance mediated by cellular
stress response to the microenvironment of solid tumors.
Anticancer Drug Des 1999; 14: 169–177.
61. Belfi CA i wsp.: Increased sensitivity of human colon cancer
cells to DNA cross-linking agents after GRP78 up-regulation.
Biochem Biophys Res Commun 1999; 257: 361–368.
62. Reddy RK, Lu J, Lee AS. The endoplasmic reticulum chaperone glycoprotein GRP94 with Ca2+-binding and antiapoptotic
properties is a novel proteolytic target of calpain during etoposide-induced apoptosis. J Biol Chem 1999; 274: 28476–28483.
63. Nakagawa T, Yuan J. Cross-talk between two cysteine
protease families. Activation of caspase-12 by calpain in
apoptosis. J Cell Biol 2000; 150: 887–894.
64. Binder RJ, Han DK, Srivastava PK. CD91: a receptor for
heat shock protein gp96. Nat Immunol 2000; 1: 151–155.
65. Janetzki S i wsp.: Immunization of cancer patients with
autologous cancer-derived heat shock protein gp96 preparations: a pilot study. Int J Cancer 2000 88: 232–238.
66. Wang XY i wsp.: Characterization of heat shock protein 110
and glucose regulated protein 170 as cancer vaccines and the
effect of fever-range hyperthermia on vaccine activity. J Immunol 2001 166: 490–497.
67. Gazit G i wsp.: Use of the glucose-starvation inducible
GRP78 promoter in suicide gene therapy of murine fibrosarcoma. Cancer Res 1999; 59: 3100–3106.
68. Chen X i wsp.: Eradication of murine mammary adenocarcinoma through HSVtk expression directed by the glucose-starvation inducible GRP78 promoter. Breast Cancer
Res Treat 2000; 59: 81–90.
69. Gomer CJ i wsp.: Glucose regulated protein induction and
cellular resistance to oxidative stress mediated by porphyrin photosensitization. Cancer Res 1991; 51: 6574–6579.0
Marzanna Cechowska-Pasko
Zakład Biochemii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku
ul. Mickiewicza 2A
15-089 Białystok
tel. 085 748 56 91
53
54
55
INFORMATION FOR AUTHORS AND GUIDELINES FOR THE PREPARATION OF
MANUSCRIPTS FOR THE SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY
1. SCIENTIFIC REVIEW IN PHARMACY is a peer-reviewed
transdisciplinary journal covering the fields of pharmacy,
medicine and related sciences. The journal publishes
conference reports and materials, conference announcements,
as well as letters to the Editor.
2. All manuscripts should be sent to the Editor, both in a printed
and an electronic form. Electronic versions of articles are to
be sent to [email protected] or supplied on CD-ROM disks.
Printed copies (together with tables, diagrams and figures)
should be addressed to:
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
41-200 Sosnowiec
ul. Jedności 8
3.
4.
5.
6.
7.
8.
56
Disk label should contain the first name(s) and surname(s)
of the Author(s), and the title of the paper. Text and graphics
should be included in separate files. Do not paste pictures and
graphics to text files. The Editor advises to use Star Office,
Word, or Word Perfect. The preferred graphics format is *.
TIFF, color: CMYK resolution: 300 dpi.
All submitted manuscripts are reviewed initially by the Editorin-Chief. The Authors are encouraged to suggest their
reviewers, however the final selection of a reviewer is up to
the Editorial Board. The Editors-in-Chief reserves the right to
correct or abbreviate the text (after the Author’s approval).
The manuscript that has been rejected by the Scientific
Review in Pharmacy should not be resubmitted.
A cover letter should be included with the manuscript,
containing a declaration that the manuscript has not been
previously published in print or electronic format and is not
under consideration by another journal or electronic medium,
signed by all the Authors. It should also include written
approval from the head of the institution in which the study
was conducted.
All human and animal research will have obtained ethical
consent from the local Bioethical or Ethical Committee.
The material sent in and the review will remain among the
documentation of the Board of Editors.
Editor purchases, on the basis of exclusiveness, the whole
of the copyrights for the published papers (including the right
to publishing in print, on electronic media, such as CD-ROM
disks, and on the Internet). Reprinting the paper summaries is
allowed without any written permission of the Editor.
Instructions for authors:
8.1. Manuscript Page Setup
• Paper: white, A4 format.
• Margins: 2.5cm (top, left, right, bottom)
• Font: Times New Roman, no smaller than 12 points.
• Text: Double-spaced, one side of the page only.
• Numbering: Insert page numbers at bottom right of each
page.
• Paragraphs: Indent first line 12.7 mm. Do not use an extra
line space between paragraphs.
• Subheads: All subheads should be flush with the left
margin, with one line above. Indent first line after a
subhead. Use an extra line space between the subhead
and the text.
• TITLE or HEADING OF THE ARTICLE: all capitals,
boldface, on separate line.
• Second-Level Subhead: initial capitals, boldface, on
separate line.
• Third-Level Subhead: initial capitals, italic, on the same
line as the text, with extra letter space between the
subhead and the text.
8.2. Organization of Manuscript
• Title page should include: submission date and Author(s)
full names, i.e. first name(s) and surname(s), Authors’
full current affiliations (for papers with multiply authors,
please enumerate the authors and their affiliations in
the following way: Author1, Author2, etc; 1Affiliation,
Affiliation, etc.). Affiliations should contain the full name
and academic degrees/titles of the head of the institution.
One corresponding author must be designated for papers
with coauthors. At the bottom of the page the full name,
academic degrees/titles, and address of the corresponding
author should be given, including the telephone number, fax
number and/or e-mail address. If research has been funded,
please indicate the source of funding (including grant index/
symbol, grant agencies, corporations, or sponsors).
• The second page should include an abstract (150-250
words). The abstract must be self-contained, and must
not require reference to the paper to be understood.
The abstract should present objectives and scope of the
study or reasons for writing the paper. The methods and
techniques or approaches should be described only to
the extent necessary for comprehension. The findings
and conclusions should be concise and informative. The
abstract should be followed by the key words consistent
with the Medical Subject Headings Index Medicus, and
should not contain unfamiliar terms that are not defined,
undefined acronyms and reference citations. Neither
displayed equations or lists should appear in the abstract.
• Body text should be organized as follows:
original paper - introduction, material and methods
descriptions, research results, discussion;
review papers – free structure;
case studies – introduction (motivation for the study), case
descriptions, discussion of the characteristic symptoms,
treatment results etc.
• Figures (diagrams, drawings, color or black-and-white
photographs) should be put into a separate envelope. On
each figure there should be its number (Arabic numerals),
the name(s) of the author(s) paper title, and “top” marking.
Figure captions should be placed on separate pages and
numbered consecutively using Arabic numerals. Previously
published visual materials should be supplied together
with the written consent of the Publisher for reprint.
• Tables, each on a separate page, should be numbered
using Roman numerals and preceded by their captions.
Table captions should be placed on separate pages,
numbered using Roman numerals.
• The papers should not exceed the following limitations:
original and review work – 10 pages and others – 5
pages.
8.3. References to the works cited should be presented at the end
of the paper and arranged according to the sequence of citations
in the body text. The acronyms for journal titles should be used
according to Index Medicus. Each entry, starting with a new line,
should be given a number and must be presented as follows:
• journal citation:
Varga J, Abraham D: Systemic sclerosis: a prototypic
multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.
If there are more than three authors, the name of the first
one should be given, followed by an ,,et all” annotation.
Komosińska-Vassev K et all: Graves’ disease-associated
changes in the serum lysosomal glycosidases activity and
glycosoaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331:
97-102.
• the specific chapter:
Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. Biochemia
Harpera. Murray RK et all. Wydawnictwo Lekarskie PZWL.
Warszawa 1994, 59-69.
• monograph:
Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wroclaw
2004.
2
References to the works cited within the text should be
numbered using Arabic numerals and placed between brackets,
e.g. [1]. The references should not exceed the following limitations:
original work – 20, review – 30 and others – 10 bibliography
entries.
REGULAMIN REDAGOWANIA PRAC W FARMACEUTYCZNYM PRZEGLĄDZIE NAUKOWYM
1. FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY publikuje recenzowane prace oryginalne – doświadczalne, kliniczne oraz
poglądowe, z zakresu nauk: farmaceutycznych, medycznych i
pokrewnych. Ponadto, czasopismo zamieszcza informacje na
temat konferencji, zjazdów i kongresów, jak również listy do
Redakcji.
2. Manuskrypt w języku polskim lub angielskim należy przesyłać
w formie elektronicznej na adres: [email protected] (w wyjątkowych przypadkach na dysku CD-ROM) oraz – w jednym
egzemplarzu wydruku komputerowego (z tabelami, wykresami
i rycinami) na adres Redakcji:
Farmaceutyczny Przegląd Naukowy
41-200 Sosnowiec
ul. Jedności 8
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Opis dysku powinien zawierać imię i nazwisko autora(ów)
i tytuł pracy. Teksty i grafiki powinny tworzyć osobne zbiory.
Nie należy umieszczać rycin i fotografii w plikach tekstowych.
Redakcja zaleca użycie edytorów tekstów: Star Office, Word,
Word Perfect. Preferowany format dla grafiki to *.TIFF, kolor:
CMYK, rozdzielczość 300 dpi.
Manuskrypty podlegają ocenie przez recenzentów wyznaczonych każdorazowo przez Redaktora Naczelnego. Zachęca się
autorów do proponowania nazwisk recenzentów. Redakcja
zastrzega sobie prawo do ostatecznego wyboru recenzenta,
jak również dokonywania poprawek i skrótów tekstu (w porozumieniu z autorem). Manuskrypt, który został odrzucony
przez recenzenta nie może być ponownie przedkładany
Redakcji Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego.
Do pracy należy dołączyć oświadczenie, że praca nie była
uprzednio publikowana ani nie została wysłana do redakcji
innego czasopisma. Ponadto, oświadczenie powinno zawierać również podpisy wszystkich autorów pracy oraz – zgodę
Kierownika Jednostki, skąd praca pochodzi, na zamieszczenie
publikacji w czasopiśmie.
Wszystkie badania prowadzone na ludziach lub zwierzętach,
które są przedmiotem pracy naukowej, opisanej w manuskrypcie, muszą mieć akceptację, odpowiednio, Komisji Bioetycznej
lub Etycznej.
Przesłane materiały wraz z recenzją pozostają w dokumentacji Redakcji.
Wydawca nabywa na zasadzie wyłączności ogół praw autorskich do wydrukowanych prac (w tym prawo do wydania drukiem, na nośnikach elektronicznych CD i innych oraz w Internecie). Dopuszcza się natomiast drukowanie streszczeń bez
zgody Wydawcy.
Instrukcje dla autorów
8.1 Wymagania dotyczące przygotowania manuskryptu
• Maszynopis powinien być drukowany jednostronnie, na
białym papierze formatu A4, z zachowaniem podwójnego
odstępu między kolejnymi wierszami.
• Marginesy – 2,5 cm (górny, lewy, prawy i dolny).
• Czcionka – styl: Times New Roman, rozmiar: 12 pt.
• Numeracja stron – kolejne numery stron, począwszy od
strony tytułowej powinny być umieszczone w prawym, dolnym rogu.
• Akapit – wcięcie akapitu 12,7 mm. Nie wprowadzać dodatkowych odstępów pomiędzy kolejnymi akapitami.
• Rozdział – wszystkie rozdziały powinny być wyrównane
do lewego marginesu. Pomiędzy danym rozdziałem a tekstem należy wprowadzić jeden odstęp.
• TYTUŁ PRACY – powinien być napisany dużymi literami,
pogrubioną czcionką i w oddzielnej linii.
• Tytuł Rozdziału – kolejne wyrazy tytułu rozdziału powinny być napisane pogrubioną czcionką i w oddzielnej linii,
zaś pierwsze litery tych wyrazów powinny być napisane
dużymi literami.
• Tytuł Podrozdziału – kolejne wyrazy tytułu podrozdziału
powinny być napisane pochyloną czcionką i w tej samej
linii co tekst tego podrozdziału, z zachowaniem odstępu
pomiędzy tytułem i tekstem. Ponadto, pierwsze litery wy-
razów tytułu podrozdziału powinny być napisane dużymi
literami.
8.2 Układ manuskryptu
• Strona tytułowa powinna zawierać: imię i nazwisko autora(ów) w pełnym brzmieniu – w przypadku prac wieloośrodkowych przy nazwiskach autorów należy zaznaczyć afiliację każdego z nich, w następujący sposób Autor1, Autor2,
…; 1Afiliacja, 2Afiliacja, tytuł pracy w języku polskim i angielskim, nazwę placówki naukowej, oraz tytuł lub stopień
naukowy, imię i nazwisko kierownika placówki naukowej,
skąd pochodzi praca. U dołu strony należy podać imię
i nazwisko oraz adres, telefon i e-mail autora odpowiedzialnego za korespondencję, dotyczącą manuskryptu.
W przypadku badań finansowanych prosimy o wskazanie
źródła finansowania (w tym numery dotacji grantów, dotacji agencji, dotacji spółek, lub sponsorów).
• Druga strona manuskryptu powinna zawierać streszczenie
(150-250 słów w języku polskim i angielskim), będące autonomiczną częścią pracy, w której nie można umieszczać
odnośników literaturowych. Streszczenie powinno zawierać
krótkie wprowadzenie, cel badania, podstawowe procedury
(wybór badanych osób lub zwierząt doświadczalnych, metody badań), główne wyniki oraz wnioski. Pod streszczeniem
należy umieścić słowa kluczowe w języku polskim i angielskim, zgodnie z Medical Subject Headings Index Medicus.
• Tekst manuskryptu powinien być podzielony na rozdziały,
według następującego schematu:
prace oryginalne – wstęp, materiał i metody, wyniki badań,
dyskusja oraz wnioski;
prace poglądowe – struktura dowolna, podzielona na rozdziały i podrozdziały;
prace kazuistyczne – wprowadzenie, opis przypadku/choroby, charakterystyczne objawy, rezultaty leczenia, itp.
• Ryciny (wykresy, rysunki, fotografie czarno-białe i kolorowe)
powinny być umieszczone w osobnej kopercie, ponumerowane, opatrzone nazwiskiem autora i tytułem pracy, z zaznaczeniem „góra”, „dół”. Opisy rycin należy podać na oddzielnej stronie z numerami ilustracji podanymi cyframi arabskimi. Materiały ilustracyjne, poprzednio publikowane, należy zaopatrzyć
w pisemną zgodę Wydawcy na ponowną publikację.
• Tabele, umieszczone każda na osobnej stronie, należy ponumerować cyframi rzymskimi i opatrzyć tytułami umieszczonymi nad tabelą. Opisy tabel należy podać na oddzielnej
stronie z numerami tabel, podanymi cyframi rzymskimi.
• Zalecana objętość pracy oryginalnej i poglądowej powinna
wynosi 10, a pozostałych – 5 stron.
8.3 Piśmiennictwo powinno być ułożone wg kolejności cytowania w tekście pracy. Skróty tytułów czasopism powinny być
zgodne z Index Medicus. Każda pozycja – pisana od nowego
wiersza, powinna być opatrzona numerem oraz zredagowana
zgodnie z niżej podanym przykładem:
• czasopismo naukowe:
np.: Varga J, Abraham D: Systemic sclerosis: a prototypic multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117: 557-67.
Jeżeli autorów jest więcej niż trzech, wówczas należy podać nazwisko pierwszego z nich, z dopiskiem „i wsp.”.
np.: Komosińska-Vassev K i wsp.: Graves’ disease-associated changes in the serum lysosomal glycosidases activity and the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta
2003; 331: 97-102.
• wydawnictwo zbiorowe:
np.: Rodwell VW. Białka: struktura i właściwości. W: Biochemia Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. Warszawa 1994, 59-69.
• monografia:
np.: Bańkowski E. Biochemia. Urban & Partner. Wrocław
2004.
Powołania w tekście, umieszczone w nawiasach kwadratowych, powinny być oznaczone cyframi arabskimi, np. [1]. Liczbę
pozycji piśmiennictwa należy ograniczyć: w pracach oryginalnych
do 20, w poglądowych do 30 i w pozostałych do 10 pozycji.
57
Farmaceutyczny
Przegląd Naukowy
Miesięcznik
Prosimy o wypełnienie kuponu drukowanymi literami
o dokonanie wpłat na poczcie lub w banku.
Będziemy wdzięczni za użycie naszego kuponu.
Pierwszy egzemplarz pisma w ramach wykupionej prenumeraty otrzymają Państwo po około 2 tygodniach
od dokonania wpłaty.
Dodatkowych informacji udziela Dział Prenumeraty
i Kolportażu:
Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiego
ul. Wiśniowa 25/2, 43-303 Bielsko-Biała
TEL. 033 817 38 99
WYDAWCA
Nr rachunku odbiorcy:
0
IC Value - Current 3.66
MNiSW 4
PRENUMERATA
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
ODBIORCA:
kwota:.......................................................................................
wpłacający:..............................................................................
.................................................................................................
.................................................................................................
Zamawiam
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
Nr ............
Nr rachunku odbiorcy:
0
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
43-303 Bielsko-Biała, ul. Wiśniowa 25/2
74 1050 1070 1000 0090 6083 4158
ODBIORCA:
kwota:.......................................................................................
wpłacający:..............................................................................
.................................................................................................
.................................................................................................
Zamawiam
FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY
Nr ............
PRENUMERATA FARMACEUTYCZNY PRZEGLĄD NAUKOWY

Scientific Review in Pharmacy - Farmaceutyczny Przegląd Naukowy

Transkrypt

Podobne dokumenty

Załącznik do pobrania. - Sekcja Rehabilitacji Kardiologicznej i

Cena 79,00 zł

FULL TEXT - Polski Przegląd Otorynolaryngologiczny

Porfiria skórna późna

pobierz plik do druku

slajdy - Wszechnica Żywieniowa w SGGW

RANKL i osteoprotegeryna, czynniki regulują…