Artykuł naukowy

Występowanie Leptotrichia amnioni sp. Nov u kobiet ciężarnych
The prevalence of Leptotrichia amnionii sp.nov. in pregnant women
Joanna Biegaj-Fic
Katedra i Klinika Położnictwa i Patologii Ciąży Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
ul. Staszica 16,20-081 Lublin Tel.: 081/ 532 66 12,Fax.:081/532 66 12
E-mail: [email protected]
Robert Nawrot
Zakład Wirusologii Molekularnej Uniwersytetu im. A. Mickiewicza
ul. Umultowska 89, 61-614 Poznań (Poland),Tel.: +48-61-829-5932; fax: +48-61-829-5590.
E-mail : [email protected]
Kwaśniewski Wojciech
STN przy Katedrze i Klinice Położnictwa i Patologii Ciąży Uniwersytetu Medycznego w Lublinie ul.
Staszica 16,20-081 Lublin Tel.: 081/ 532 66 12,Fax.:081/532 66 12
Dziedzic Anna
STN przy Katedrze i Klinice Położnictwa i Patologii Ciąży Uniwersytetu Medycznego w Lublinie ul.
Staszica 16,20-081 Lublin Tel.: 081/ 532 66 12,Fax.:081/532 66 12
Anna Goździcka-Józefiak
Zakład Wirusologii Molekularnej Uniwersytetu im. A. Mickiewicza
ul. Umultowska 89, 61-614 Poznań (Poland)
Tel.: +48-61-829-5932; fax: +48-61-829-5590.
E-mail : [email protected]
Anna Kwaśniewska
Katedra i Klinika Położnictwa i Patologii Ciąży Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
ul. Staszica 16,20-081 Lublin
Tel.: 081/ 532 66 12, Fax.:081/532 66 12
[email protected]
Streszczenie:
Wprowadzenie: Bakterie z rodzaju Leptotrichia należą do gram-ujemnych beztlenowców
kolonizujących najczęściej jamę ustną oraz narząd rodny. Leptotrichia sanquigenes jest
jednym z bakteryjnych czynników poporodowej bakteremii matki i noworodków a
Leptotrichia amnionii sp. nov. opisana po raz pierwszy w 2002 roku okazała się czynnikiem
etiopatogenetycznym ciąży obumarłej u pacjentki w II trymestrze ciąży.
Celem pracy była ocena częstości występowania Leptotrichia amnionii sp. nov w wymazach z
pochwy u kobiet ciężarnych w I, II i III trymestrze ciąży.
Materiał i metodyka badań: Badania przeprowadzono u 121 pacjentek . Reakcje amplifikacji
wykrywającą obecność RNA Leptotricha amnioni sp.nov. w wymazach przeprowadzono
stosując specyficzne startery komplementarne do 16SrRNA Leptotrichia amnionii -primer 1
Lam upper oraz primer 2 Lsp lower- komplementarny do 16SrRNA bakterii z rodzaju
Leptotrichia [22;23].Próby po amplifikacji nanoszono na 1% żel agarozowy w obecności
markera MassRuler (Fermentas). Następnie przeprowadzono ligację produktów reakcji PCR z
wektorem pGEM-T Easy a następnie transformację komórek kompetentnych E. coli DH5α
wektorem pGEM z insertem. Izolację plazmidowego DNA przeprowadzono przy użyciu
Plazmid Mini kit firmy A&A Biotechnology. Sekwencjonowanie insertów z oczyszczonych
plazmidów wykonano w Pracowni Technik Biologii Molekularnej Wydziału Biologii UAM.
Wyniki W grupie 121 badanych ciężarnych Leptotrichia amnionii sp. nov zidentyfikowano u
14 ciężarnych, co stanowi 11.57%.
Słowa kluczowe: Leptotrichia amnioni sp. nov, ciąża
Summary
Introduction: Leptotrichia bacteria belong to the group of Gram-negative anaerobes most
frequently colonizing the oral cavity and reproductive organs. Leptotrichia sanguinegens
constitute one of the bacterial factors in postpartum bacteremia of mothers and newborns,
whilst Leptotrichia amnionii sp. nov. described for the first time in 2002, has turned out to be
the etiopathogenetic factor in missed abortion in the second trimester of pregnancy.
Aim: The purpose of this study was evaluation of the frequency of occurrence of
Leptotrichia amnionii sp. nov in patients in the 1st, 2nd and 3rd trimester of pregnancy.
Materials and methods: The study involved 121 patients. Amplification reactions detecting
the presence of Leptotrichia amnionii sp. DNA in the smears were performed using specific
starters complementary to gene encoding 16SrRNA of Leptotrichia amnionii - primer 1 Lam
upper and primer 2 Lsp lower – complementary to Leptotrichia 16SrRNA[22,23]. After
amplification, the specimens were placed on 1% agarose gel in the presence of MassRuler
marker (Fermentas). Next, PCR products were ligated to pGEM-T Easy Vector and then
competent E. coli DH5α cells were transformed with pGEM vector with an insert. Plasmid
DNA isolation was performed using Plasmid Mini kit from A&A Biotechnology..
Results: In the group of 121 pregnant patients Leptotrichia amnionii sp. nov. was identified in
14 women, which is 11.57%.
Key words: Leptotrichia amnioni sp. nov , pregnancy
Wstęp
Istotną rolę w etiopatogenezie wielu patologii ciąży odgrywają czynniki infekcyjne,
spośród których najmniej dotychczas poznanymi są zakażenia bakteriami beztlenowymi oraz
wirusami. Dzięki nowoczesnym metodom diagnostycznym, pojawiły się możliwości
identyfikacji wielu nowych bakterii, wśród których znajduje się Leptotrichia amnioni sp. nov.
Bakterie z rodzaju Leptotrichia należą do Gram-ujemnych, beztlenowych Coccobacilli z
rodziny Fusobacteriacae. Stanowią one część flory fizjologicznej jamy ustnej, dróg rodnych
ludzi i zwierząt [14,18] . Końcowym produktem przemiany materii tych beztlenowców jest
kwas mlekowy, co jest cechą charakterystyczną tej rodziny [6,11] Nosicielstwo rodzaju
Leptotrichia u dzieci poniżej pierwszego roku życia wynosi ok. 40% [17]. Występowanie
Leptotrichia buccalis, związana jest z występowaniem zapalenia osierdzia u dzieci z
zespołem Downa[5] oraz bakteremii u dzieci oraz dorosłych z neutropenią [17,19,21] .
Leptorichia sanquigenes jest jednym z bakteryjnych czynników poporodowej bakteremii u
matki i noworodków [2] . W 2007 r. Caram i wsp. opisali dwa pierwsze przypadki zapalenia
osierdzia wywołanego przez L. goodfellowii sp. nov. Natomiast Miki Goto i wsp. [9] opisali
przypadek zapalenia stawów wywołanego przez Leptotrichię amnioni. W 2001 r. Collins i
wsp. [2] zidentyfikowali trzy szczepy bakterii z których jeden został uzyskany z płynu
owodniowego, a dwa pozostałe z krwi kobiet nieciężarnych. Szczepy te wykazywały
podobieństwo do L. sanguinegens [2]. Z kolei w 2002 r. Shukla i wsp. po raz pierwszy przy
pomocy metody PCR wyizolowali z płynu owodniowego 27-letniej kobiety z ciążą obumarłą
w drugim trymestrze
nowy gatunek bakterii z rodzaju Leptotrichia, której homologia
genotypu z L. sanguinegens wynosiła 97% [18]. Zaproponowali oni nazwę Leptotrichia
amnioni.
Celem pracy była ocena częstości występowania w wymazach z pochwy Leptotrichia
amnionii sp. nov. u kobiet ciężarnych.
Materiał i metodyka badań
Badania przeprowadzono u 121 pacjentek hospitalizowanych w Katedrze i Klinice
Położnictwa i Patologii Ciąży Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Średnia wieku
pacjentek wynosiła 26.2 lat. Grupę pacjentek I trymestru ciąży, miedzy 7 a 12 tygodniem jej
trwania stanowiło 40 pacjentek. W II trymestrze ciąży (13-24 tydzień trwania) przebadano 41
pacjentek. Grupę pacjentek III trymestru ciąży (26-40 tygodni) reprezentowało 40 pacjentek.
Pacjentki ciężarne z grupy I trymestru ciąży były hospitalizowane z powodu poronienia
zagrażającego. Z grupy 41 pacjentek II trymestru trwania ciąży 18 ciężarnych było
hospitalizowanych z powodu poronienia zagrażającego,
10 pacjentek z powodu
niewydolności cieśniowo-szyjkowej, 8 z powodu ciąży obumarłej, a 5 kobiet z powodu
chorób endokrynologicznych. Rozpoznania kliniczne w grupie 40 ciężarnych III trymestru
ciąży były następujące: poród przedwczesny zagrażający (20 pacjentek), przedwczesne
odpłyniecie płynu owodniowego (15 pacjentek), polihydramnion (2), GDM (3).
Od każdej pacjentki z dolnego sklepienia pochwy podczas rutynowych badań
położniczych pobierano wymaz bakteriologiczny. Wymaz umieszczano w próbówce
transportującej i zamrażano w temp. -86 stopni C. Identyfikację bakterii Leptotrichia amnioni
sp. nov przeprowadzono metodą sekwencjonowania 16SrRNA w Zakładzie Wirusologii
Molekularnej Uniwersytetu im. A. Mickiewicza w Poznaniu.
Całkowity DNA izolowano z wymazów zgodnie ze standardową procedurą przy
pomocy fenolu, chloroformu, 7.5 mM roztworu octanu amonu oraz etanolu absolutnego.
Ilościowe oznaczanie otrzymanego DNA przeprowadzano metodą spektrofotometryczną
wykorzystując automatyczny spektrofotometr firmy Pharmacia. Reakcje amplifikacji
wykrywającą obecność RNA Leptotricha amnionii sp. w wymazach przeprowadzono stosując
specyficzne startery komplementarne do 16SrRNA Leptotrichia amnionii -primer 1 Lam
upper oraz primer 2 Lsp lower- komplementarny do 16SrRNA bakterii z rodzaju Leptotrichia
[23].Próby po amplifikacji nanoszono na 1% żel agarozowy w obecności markera MassRuler
(Fermentas). Produkt amplifikacji wynosił ok. 1000 pz. Następnie przeprowadzono ligację
produktów reakcji PCR z wektorem pGEM-T Easy a następnie transformację komórek
kompetentnych E. coli DH5α wektorem pGEM z insertem [6]. Izolację plazmidowego DNA
przeprowadzono
przy
użyciu
Plazmid
Mini
kit
firmy
A&A
Biotechnology.
Sekwencjonowanie insertów z oczyszczonych plazmidów wykonano w Pracowni Technik
Biologii Molekularnej Wydziału Biologii UAM.
Wyniki
W grupie 121 badanych ciężarnych Leptotrichia amnionii sp. nov zidentyfikowano u
14 ciężarnych, co stanowi 11.57%. 10 pacjentek u których stwierdzono Leptotrichia amnionii
sp. nov, to pacjentki w III trymestrze ciąży, hospitalizowane z powodu porodu
przedwczesnego zagrażającego. U jednej pacjentki zdiagnozowano wewnątrzmaciczne
niesymetryczne zahamowanie wzrostu płodu. Trzy pacjentki, w II trymestrze ciąży
hospitalizowano z powodu poronienia zagrażającego. Przeanalizowano przebieg porodu i
połogu u 10 pacjentek, które rodziły w Katedrze i Klinice Położnictwa i Patologii Ciąży AM
w Lublinie. W grupie tych pacjentek przebieg porodów i połogów nie odbiegał od normy.
Dalszy los przebiegu ciąży, porodu i połogu u czterech pacjentek nie byliśmy w stanie ustalić.
Dyskusja
Kliniczna infekcja wskazująca na związek z Leptotrichia sp.nov. jest rzadko
opisywana. Powodem są prawdopodobnie skomplikowane metody identyfikacji tej bakterii
oparte na metodach biologii molekularnej, które nie możemy przeprowadzić rutynowo w
przyklinicznych laboratoriach mikrobiologicznych.
W niniejszej pracy kryterium doboru grupy badanej były pacjentki ciężarne z
najczęstszymi schorzeniami wikłającymi I, II i III trymestr trwania ciąży. W grupie 121
pacjentek ciężarnych stwierdzono występowanie w wymazach z pochwy Leptotrichia
amnionii sp.nov. u 14 pacjentek , co stanowi 11, 6 %. Uzyskane wyniki świadczą o
stosunkowo częstym występowaniu Leptotrichia amnionii u kobiet ciężarnych a
równocześnie wskazują na możliwość kolonizacji przez te bakterię wyższych pięter narządu
rodnego.
Częstość występowania Leptotrichia amnionii sp. nov w porównaniu z naszymi
wcześniejszymi badaniami [15]
kształtuje się na tym samym poziomie. Badania
przeprowadzone przez Nawrot i wsp. [16]
wykazały, ze w grupie kobiet nieciężarnych
częstość ta wynosi 13.7% (19/139).
Jak wynika z dostępnych naukowych baz danych (Medline, Pub Med.) dotychczas
ukazały się doniesienia opisujące 22 przypadki infekcji wywołanej przez Leptotrichia u
kobiet w okresie ciąży, porodu, połogu i u noworodków.
W 1995 roku Hanff i wsp. [13] opisali 7 przypadków bakteriemii wywołanej przez
Leptotrichia sanquinegens. U czterech pacjentek stwierdzono w przebiegu stanu septycznego
endometritis, u 2 noworodków bezgorączkową bakteremię. Jedna z prezentowanych w pracy
położnic była hospitalizowana z powodu przedwczesnego odpłynięcia wód płodowych
(PROM) i gorączki. We wszystkich opisywanych powyżej przypadkach czynnikiem
etiopatogenetycznym była Leptotrichia sanquinegens.
W 2001 roku Collins i wsp. [2] izolowali Leptotrichia z płynu owodniowego (1 przypadek) i
z krwi (2 przypadki). Badania te zostały rozszerzone o 2 kolejne przypadki izolacji
Leptotrichia amnionii z płynu owodniowego przez Gardella i wsp.[8] w roku 2004. W 2002
roku Shukla i wsp. [18] opisali przypadek wewnątrzmacicznej śmierci płodu wywołanej przez
bakterię Leptotrichia, którą nazwali Leptotrichia amninii. W 2004 roku De Martino i wsp. [3]
opisali 3 przypadki porodowej i połogowej bakteremii u pacjentek od których wyizolowano
Leptotrichia amnionii oraz Leptotrichia sanquinegens. W 2004 roku Hebb i wsp. [14] opisali
występowanie bakteryjnego fenotypu Leptotrichia spp. u 3 pacjentek leczonych z powodu
salpingitis. We Francji w 2003 r. Gundi VA i wsp. [10] opisali przypadek 41-letniej kobiety
nieciężarnej u której rozpoznano ropne zapalenie jajowodu spowodowane przez Leptotrichia
amnioni. W 2007 r. w Danii Boennelycke M. i wsp. [1] opisali pierwszy przypadek
poronienia u 29-letniej ciężarnej ( II C, 15 hbd) u której wystąpiło krwawienie z dróg rodnych
z gorączką 39ºC. W tym samym roku w Norwegii Thielsen C. i wsp. [20] opisali dwa
przypadki kliniczne. W pierwszym z nich u 33-letniej pacjentki u której podejrzewano
infekcję dróg moczowych, doszło do poronienia całkowitego w 13 tygodniu ciąży. Drugi
dotyczył 24-letniej kobiety u której w 5 dni po niepowikłanym porodzie siłami natury, z
rozpoznaną w trzecim trymestrze infekcją dróg moczowych zdiagnozowano ropień nerki. W
obu przypadkach wyizolowano Leptotrichia amnioni z krwi obwodowej. Z badań DiGiulio i
wsp. [4] z 2008 r. wynika, że bakterie identyfikowane jedynie przy użyciu metody PCR
stanowią aż 25% patogenów izolowanych z płynu owodniowego. Ich występowanie koreluje
z wykładnikami biochemicznymi, histopatologicznymi chorioamnionitis oraz skróceniem
wieku ciążowego. Podobne wyniki uzyskali w 2009 roku. Yping W . Han i wsp. [12] ,
którzy wykazali, że zastosowanie
u kobiet
PCR do identyfikacji bakterii , których
identyfikacja jest niemożliwa na standardowych pożywkach (w tym L. amnioni) koreluje z
biochemicznymi markerami zapalnymi w płynie owodniowym (IL-6), histopatologicznymi
cechami chorioamnionitis oraz występowaniem stanów septycznych u noworodków.
Powyższe doniesienia świadczą o możliwym związku etiopatogenetycznym występowania
Leptotrichia amnioni. i nieprawidłowym przebiegu ciąży.
Wniosek: Leptotrichia amnionii sp. nov jest bakterią, która stosunkowo często występuje w
wymazach z pochwy u kobiet ciężarnych.
Piśmiennictwo:
1. Boennelycke M, Christensen JJ, Arpi M, Krause S. Leptotrichia amnionii found in
septic abortion in Denmark. Scand J Infect Dis. 2007;39(4):382-3.
2. Collins MD, Hoyles L, Tornqvist E. et al. Characterization of some strains from
human clinical sources witch resemble Leptotrichia sanquinegens description of
Sneathia sanquingengs sp.nov. Syst. Appl. Microbiol. 2001; 24: 358-361.
3. De Martino SJ, ,Mahoudeau I, Bretters JP.et al. Peripartum Bacteriemias due to
Leptorichia amnioni and Snaethia sanquines, rare causes of fever during and after
delivery. J Clin Microbiol 2004; 42:5940-5943.
4. DiGiulio DB, Romero R, Amogan HP, Kusanovic JP, Bik EM, Gotsch F, Kim CJ, Erez
O, Edwin S, Relman DA. Microbial prevalence, diversity and abundance inamniotic
fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation.
2008,
26;3(8);PloS ONE: e3056.
5. Duperval R, Beland S, Marcoux JA.et al. Infective endocarditic due to Leptorichia
buccalis: a case report. Can Med Assoc J 1984; 130:422-424.
6.Eribe ER, Olsen I.-Leptotrichia species in human infections. Anaerobe. 2008
Jun;14(3):131-7.
7. Eribe ER, Paster BJ, Caugant DA.et al. Genetic diversity of Leptorichia and
description of Leptorichia goodfelowii sp.nov., Leptorichia hofstadii sp.nov.,
Leptorichia shhii sp. nov and Leptorichia wadei sp.vov. Int J Syst Evol Microbiol
2004; 54:583-592.
8. Gardella C, Riley DE, Hitti J.et al. Identification and sequencing of bacterial rDNAs
in culture-negative amniotic fluid from women in premature labor. Am J Perinatol
2004; 21:319-323
9. Goto M., S. Hitomi, and T. Ishii. 2007. Bacterial arthritis caused by
Leptotrichia amnionii. J. Clin. Microbiol. 45:2082-2083.
10. Gundi VA,Desbriere R,La SB. Leptotrichia amnioni and the female reproductive
tract. Emerg Infect Dis 2004;10:2056-57
11. Hamilton RD, Zahler
1957;73:386-93
SA.
A
study of
Leptotrichia buccalis.
J.Bacteriol
12. Han YW, Shen T, Chung P, Buhimschi IA, Buhimschi CS-Uncultivated bacteria as
etiologic agents of intra-amniotic inflammation leading to preterm birth. J. Clin.
Microbiol .2009, p. 38-47, Vol. 47, No. 1
13. Hanff PA, Rosol-Donoghue CA, Spigel KH.et al. Leptorichia sanquinegens sp. nov. a
new agent of postapartum and neonatal bacteremia. Clin Infect Dis 1995; 20:237-239.
14. Hebb JK, Cohen CR, Astete SG. et al. Detection of novel organisms
salpnigitis, by use of 16SrDNA polymerase chain reaction. J
associated with
Infect Dis 2004;
190:2109-2120.
15. Kwasniewska A., Nawrot R., Skoczyński M., Semczuk-Sikora A., Kużma D.,
Goździcka-Jozefiak A.; Częstośc wystepowania Leptotrichia amnioni sp. nov. U
kobiet cięzarnych. Gin.Pol. 2006, 7; 523526.
16. Nawrot R., Kamieniarz K., Malinowska M., Józefiak A., Kędzia W., Kwaśniewska
A., Kuźma D., Goździcka-Józefiak D.: The prevalence of Leptotrichia amnionii in
cervical swabs of HPV positive and negative women .Eur J Gynecol Oncol 2009( dane
nieopublikowane, praca w druku)
17. Reig,
m., F.Baquero, M.Garcia-Campello,
and E.Loza. 1985.
Leptotrichia
buccalis bacteriemia in neutropenoc children. J. clin. Micrbiol.22:320-321
18. Shukla SS, Meier PR, Mitchell PD.et al. Leptorichia amnioni sp.nov.,a novel
bacterium isolated from the amniotic fluid of a women after intrauterine fetal demise.
J Clin Microbiol 2002 ;40 :3346-3349.
19. Tee W, Midolo P, Janssen PH .et al. Bacteremia due to Leptorichia trevisanii sp. nov.
Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001; 20:765-769.
20. Thilesen CM, Nicolaidis M, Lökebö JE, Falsen E, Jorde AT, Müller F. Leptotrichia
amnionii, an emerging pathogen of the female urogenital track. J Clin Microbiol.
2007 Jul;45(7):2344-7. Epub 2007 May 23.
21. Weinberger,
M.,
T.
Wu,
M.
Robin,
V.
J.
Gill,
and
P.
A.Pizzo.
Leptotrichia buccalis bacteremia in patients with cancer: report of four cases and
review. Rev. Infect. Dis. 1991, 13:201-206.
22. Woo. PC, Ng KH, Lau SK. et al.Usefulness of the MicroSeq50016S ribosomal DNAbased bacterial identification system for identification of clinically significant
biochemical profiles. J Clin Microbiol 2003; 41:1996-2001.
23. Zhou X, Bent SJ, Schneider MG.et al. Characterization of vaginal microbial
communities in adult healthy women using cultivation-independent methods.
Microbiology 2004;150:2565-2573.