Ćwiczenia X

Biochemia: Ćw. - Lipidy
LIPIDY
Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:
amoniak
azotan srebra
bezwodnik kwasu octowego
bromek jodu
chlorek baru
chlorek wapnia
chloroform
etanol 96%
kwas octowy lodowaty
kwas siarkowy
siarczan miedzi (II)
węglan sodu
woda bromowa
wodorosiarczan potasu
wodorotlenek potasu
wodorotlenek sodu
- C, N,
- C, N,
– C,
– C,
– T,
– Xi,
– Xn,
– F,
– C,
– C,
– Xn, N,
– X,
– C, N, Tn,
– C,
– C,
–C
1. WYKRYWANIE GLICEROLU
1.1. PRÓBA AKROLEINOWA
Produktami reakcji hydrolizy tłuszczów właściwych (kwasowej, zasadowej lub enzymatycznej z udziałem lipaz) są: glicerol i odpowiednie
kwasy tłuszczowe. Glicerol (propanotriol, nazwa zwyczajowa – gliceryna) ulega odwodnieniu w wysokiej temperaturze w obecności
czynników odciągających wodę (np. KHSO4). W wyniku tej reakcji powstaje nienasycony aldehyd kwasu akrylowego zwany akroleiną,
zgodnie z równaniem:
glicerol
akroleina
Pary akroleiny redukują jony Ag+ do Ag0, dlatego umieszczona w nich bibuła nasączona roztworem wodorotlenku diamoniakalnosrebrowego [Ag(NH3)2]OH przybiera kolor brunatny do czarnego, w zależności od stężenia akroleiny.
Wykonanie: Przygotować 1 krótką szklaną probówkę (suchą!) zawierającą ok. 0.2 g krystalicznego KHS04 a następnie dodać
do niej 5 kropli glicerolu (ok. 250 ul). U wylotu probówki zawiesić zagięty pasek bibuły nasączony świeżo przygotowanym
amoniakalnym roztworem AgNO3 (*). Probówkę ogrzewać w łaźni wodnej. Wydzielają się dymy akroleiny o drażniącym
zapachu (nie badamy próbek węchem!). Obserwujemy ciemnienie bibuły wskutek redukujących właściwości akroleiny.
(*) amoniakalny roztwór AgNO3 (odczynnik Tollensa): do jednej probówki pobierz 100 ul 10% wodnego roztworu AgNO3, do drugiej probówki dodaj 75 ul
H2O i 50 ul stężonego (25%) roztworu amoniaku. Po wymieszaniu, dodawaj cały czas mieszając 100 ul uzyskanego 10% roztworu NH3 do roztworu AgNO3.
Cały roztwór wykorzystaj do nasączenia paska bibuły (przechowywanie grozi powstaniem wybuchowego „srebra piorunującego”).
1.2. REAKCJA Z WODOROTLENKIEM MIEDZI
Glicerol będąc alkoholem trihydroksylowym tworzy z Cu(OH)2 połączenia kompleksowe o intensywnym niebieskim zabarwieniu.
Wykonanie: Przygotować krótką probówkę szklaną. Do 0.5 ml nasyconego roztworu CuSO 4 dodać kroplami 2M roztwór
NaOH, aż do wytrącenia się niebieskiego osadu Cu(OH)2. Po dodaniu kilku kropli glicerolu osad rozpuszcza się, a roztwór
przyjmuje intensywną niebieską barwę.
1
Biochemia: Ćw. - Lipidy
2.1. ROZPUSZCZALNOŚĆ TŁUSZCZÓW
Tłuszcze nie rozpuszczają się w wodzie. Ulegają emulgacji przy zmniejszonym napięciu powierzchniowym przez detergent. W etanolu
tłuszcze rozpuszczają się słabo. Bardzo dobrze rozpuszczają się w chloroformie.
Wykonanie: Przygotować cztery probówki szklane. Do każdej z nich dodać 3 krople oleju roślinnego. Następnie do pierwszej
wlać 0.5 ml wody destylowanej, do drugiej – 0.5 ml detergentu rozcieńczonego 4-krotnie wodą destylowaną, do trzeciej – 0.5
ml 96% etanolu a do czwartej – 0.5 ml chloroformu. Zawartość probówek wymieszać dokładnie na wortexie. Obserwować
rozpuszczalność tłuszczu.
2.2. ROZPUSZCZALNOŚĆ BARWNIKÓW W TŁUSZCZACH
Sudan III to czerwony barwnik disazowy rozpuszczalny w benzenie, acetonie i etanolu Długi, niepolarny łańcuch węglowodorowy
wchodzący w skład tego barwnika, sprawia, że związek ten dobrze rozpuszcza się w tłuszczach.
Sudan III
Wykonanie: Przygotować jedną krótką probówkę. Dodać 2 ml wody destylowanej i odrobinę (!) barwnika Sudan III – barwnik
nie rozpuszcza się w wodzie. Następnie dodać 0.5 ml oleju i zamieszać zawartość probówki – barwnik rozpuszcza się
w oleju.
3. ZMYDLANIE TŁUSZCZÓW
Hydroliza zasadowa (np. z udziałem wodorotlenku sodu lub potasu) prowadzi do powstania gliceryny oraz soli kwasów organicznych, czyli
mydeł, dlatego nazywana jest zmydlaniem tłuszczu. Reakcja ta wykorzystywana jest przy produkcji mydła. Z mydła można odzyskać
wolne kwasy tłuszczowe dodając roztworu stężonego kwasu.
3.1. OTRZYMYWANIE MYDŁA
Wykonanie: W porcelanowej parownicy rozgrzać na kuchence elektrycznej ok. 1 g smalcu. Do gorącego smalcu dodać
1.6 ml 30% NaOH, a następnie 1 ml etanolu. Mieszając tłuczkiem, ogrzewać do utworzenia się jednolitej masy mydła.
Dodając stopniowo gorącą wodę (ok. 150 ml), przelać roztwór mydła do zlewki o objętości 250 ml i kontynuować ogrzewanie,
ciągle mieszając bagietką, aż do całkowitego rozpuszczenia się mydła.
3.2. OTRZYMYWANIE MYDŁA NIEROZPUSZCZALNEGO
Wykonanie: Przygotować trzy krótkie probówki. Do każdej z nich dodać po 2 ml roztworu mydła a następnie do pierwszej –
0.5 ml 1% roztworu CaCl2, od drugiej – 0.5 ml 1% roztworu BaCl2. Trzecią pozostawić jako próbę kontrolną do porównania.
W probówce z chlorkami: wapnia i baru wytrąca się osad nierozpuszczalnych mydeł wapniowych i barowych.
3.3. WYSALANIE MYDŁA
Wykonanie: Do probówki z 2,5 ml roztworu mydła wprowadzać porcjami NaCl in substantia, aż do wysycenia roztworu.
Wytrąca się kłaczkowaty osad mydła, który rozpuszcza się po dodaniu wody w nadmiarze.
2
Biochemia: Ćw. - Lipidy
3.4. WYTRĄCANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
Wykonanie: Do probówki z 1 ml roztworu mydła dodawać porcjami 1M kwas siarkowy aż do momentu, gdy wytrąci się biały
osad kwasów tłuszczowych (roztwór powinien mieć odczyn kwaśny). Osad nie rozpuszcza się po dodaniu wody
w nadmiarze.
3.5. TWORZENIE TRWAŁEJ EMULSJI TŁUSZCZU W OBECNOŚCI MYDŁA
Wykonanie: Przygotować dwie krótkie probówki. Do pierwszej probówki dodać 4 ml wody destylowanej, 0.5 ml oleju oraz
odrobinę Sudanu III a do drugiej 4 ml roztworu mydła, 0.5 ml oleju oraz odrobinę Sudanu III. Zawartość probówek silnie
wstrząsnąć. W probówce z mydłem wytwarza się trwała emulsja.
Porównać wyniki uzyskane w doświadczeniach 2.1 (rozpuszczalność tłuszczu w roztworze detergentu), 2.2 oraz 3.5. Wyciągnąć wnioski.
4. ROZRÓŻNIANIE MIEDZY NASYCONYMI I NIENASYCONYMI KWASAMI TŁUSZCZOWYMI
4.1. REAKCJA ADDYCJI BROMU
Tłuszcze roślinne i zwierzęce różnią się rodzajem kwasów tłuszczowych, którymi zestryfikowany jest glicerol. Tłuszcze roślinne są
związkami nienasyconymi, a więc estrami gliceryny i nienasyconych kwasów karboksylowych, natomiast tłuszcze zwierzęce to związki
nasycone – estry gliceryny i nasyconych kwasów karboksylowych. Aby odróżnić tłuszcz roślinny od zwierzęcego można użyć wody
bromowej (nasycony, wodny roztwór bromu o intensywnie żółtej barwie). Reakcja przyłączania chlorowców pozwala na wykrycie
obecności nienasyconych wiązań oraz jest podstawą ich ilościowego oznaczania (oznaczanie liczby jodowej). Tłuszcze roślinne
zawierające wiązania podwójne przyłączając brom powodują odbarwienie wody bromowej.
Wykonanie: Przygotować 3 krótkie i 3 długie szklane probówki. Nad palnikiem roztopić niewielką ilość masła zwierzęcego
w pierwszej krótkiej szklanej probówce. Do drugiej krótkiej probówki dodać 0.2 ml stopionego masła a do trzeciej 0.2 ml oleju
roślinnego. Do drugiej i trzeciej probówki dodać po 0.5 ml etanolu. Rozmieszać dokładnie zawartość obu probówek.
Do trzech długich probówek odmierzyć po 0.5 ml wody bromowej pod dygestorium (!). Do pierwszej dodać 0.5 ml etanolu
(próba kontrolna), do drugiej – 0.5 ml masła zwierzęcego w etanolu a do trzeciej – 0.5 ml oleju roślinnego w etanolu.
Wymieszać zawartość probówek. Obserwować zmianę barwy roztworów.
4.2. REAKCJA Z MANGANIANEM (VII) POTASU
Wykonanie: Przygotować 1 krótką szklaną probówkę. Dodać 0.2 ml oleju a następnie 1 ml 1% roztworu Na2CO3. Lekko
ogrzać i wstrząsając, dodawać stopniowo świeżo przygotowany roztwór KMnO4* (ok. 1 ml). Roztwór manganianu (VII)
potasu początkowo odbarwia się a następnie zaczyna wydzielać się brunatny osad MnO2. Jeżeli osad jest słabo widoczny,
roztwór przenieść do probówki wirowniczej o obj. 2 ml i zwirować.
* kryształek KMnO4 rozpuścić w niewielkiej objętości wody destylowanej, zamieszać
5. ANALIZA JAKOŚCIOWA CHOLESTEROLU
Cholesterol to nienasycony jednowodorotlenowy alkohol zaliczany do endogennych steroli zwierzęcych. Wchodząc w skład błon
organizmów eukariotycznych modulując ich płynność. Jest również prekursorem hormonów steroidowych.
3
Biochemia: Ćw. - Lipidy
5.1. PRÓBA SALKOWSKIEGO
Stężony kwas siarkowy powoduje odłączenie od cholesterolu cząsteczki wody, w wyniku czego powstaje kwas disulfonowy
bicholestadienu barwiący warstwę chloroformową na kolor malinowy.
Wykonanie: Przygotować trzy krótkie szklane probówki – suche (!). Do pierwszej dodać 0.5 ml 0.2% chloroformowego
roztworu cholesterolu, do drugiej – 1 ml stopionego masła w chloroformie (0.3 ml masła + 0.7 ml chloroformu) a do trzeciej
1 ml stopionego smalcu w chloroformie (0.3 ml smalcu + 0.7 ml chloroformu). Wszystkie roztwory podwarstwić kilkoma
kroplami stęż. H2SO4. Warstwa chloroformowa barwi się na kolor malinowy, natomiast dolna warstwa wykazuje zieloną
fluorescencję. Jeśli zmiana koloru nie zajdzie od razu po dodaniu H2SO4, probówkę odstawić na kilkanaście minut.
5.2. PRÓBA LIEBERMANA I BURCHARDA
W obecności kwasu siarkowego i bezwodnika kwasu octowego z cholesterolu powstaje kwas monosulfonowy bicholestadienu barwiący
roztwór na kolor zielony.
Wykonanie: Przygotować 2 krótkie probówki szklane – suche (!). Do jednej dodać 0.5 ml 0.2% chloroformowego roztworu
cholesterolu a do drugiej 1 ml masła rozpuszczonego w chloroformie (0.3 ml masła + 0.7 ml chloroformu). Do obu probówek
dodać 0.5 ml bezwodnika kwasu octowego a następnie ostrożnie po ściankach obu probówek po 2 krople stęż. H 2SO4.
Pojawia się zielone zabarwienie.
6. ANALIZA JAKOŚCIOWA LECYTYNY
Lecytyna (fosfatydylocholina) należy do glicerofosfolipidów. Reszta fosforanowa zestryfikowana jest choliną. Oprócz glicerolu w jej skład
wchodzą także kwasy tłuszczowe. Dzięki obecności fosfocholiny o charakterze hydrofilnym lecytyna tworzy w wodzie dość trwałe emulsje.
lecytyna
6.1. WYKRYWANIE CHOLINY
Cholina jest czwartorzędowym kationem amoniowym. W środowisku silnie zasadowym zostaje w wyniku hydrolizy uwolniona z lecytyny
i rozpada się do trimetyloaminy i glikolu etylenowego. Lotną trimetyloaminę można zidentyfikować na podstawie charakterystycznego
zapachu solanki śledziowej oraz odczynu zasadowego.
Wykonanie: Przygotować probówkę zawierającą 0.1 ml etanolowego roztworu lecytyny. Dodać 2,5 ml 30% roztworu NaOH
starając się, aby wewnętrzne ścianki probówki u wylotu pozostały suche. Ogrzewać ok. 5 min. we wrzącej łaźni wodnej. Do
wylotu probówki zbliżyć zwilżony wcześniej wodą papierek uniwersalny (nie badamy próbki węchem!). Obserwować zmianę
barwy papierka i zmianę konsystencji roztworu (powstaje mydło sodowe).
6.2. WYTRĄCANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
Wykonanie: Do 1 ml roztworu mydła uzyskanego z lecytyny w ćwiczeniu 6.1 dodawać stężony kwas octowy aż do momentu,
gdy roztwór stanie się klarowny i pojawi się delikatny osad kwasów tłuszczowych.
4
Biochemia: Ćw. - Lipidy
7. WSKAŹNIKI WŁAŚCIWOŚCI TŁUSZCZÓW
Do chemicznych wskaźników właściwości tłuszczów zaliczamy:
1. liczbę kwasową (liczba Kottstorfera) – ilość mg KOH zużytego do zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych w 1g tłuszczu,
2. liczbę zmydlania – ilość mg KOH potrzebna do zmydlenia 1g tłuszczu,
3. liczbę jodową – ilość gram wolnego I2 przyłączonego do 100g tłuszczu,
7.1. OZNACZANIE LICZBY KWASOWEJ TŁUSZCZÓW
Triacyloglicerole stanowiące główny składnik masła zwierzęcego, roślinnego oraz olejów roślinnych mają odczyn obojętny. W wyniku
jełczenia następuje częściowa hydroliza tłuszczu. Wolne kwasy tłuszczowe nadają tłuszczom odczyn kwaśny. Określenie zawartości
wolnych kwasów tłuszczowych daje odpowiedź, czy tłuszcz jest świeży, czy zjełczały. Zawartość wolnych kwasów tłuszczowych mierzy się
wyznaczając wartość liczby kwasowej; w tym celu próbkę tłuszczu miareczkuje się mianowanym roztworem KOH.
Wykonanie: Do dwóch kolb stożkowych dodać po 3 g masła świeżego i nieświeżego i roztopić tłuszcze. W tym celu kolby
zawierające masło lekko podgrzać nad palnikiem i energicznie zamieszać. Następnie dodać po 15 ml etanolu (UWAGA:
łatwopalny!) i dokładnie wymieszać. Do trzeciej kolby (próba ślepa) dodać tylko etanol. Do wszystkich roztworów dodać po
200µl
1%
etanolowego
roztworu
fenoloftaleiny.
Szybko
miareczkować
za
pomocą
0.01
M
KOH
w obecności fenoloftaleiny do słabo różowego zabarwienia.
Opracowanie wyników: liczbę kwasową (LK) dla masła policzyć wg wzoru:
LK = 5.611 (a – b)/c
gdzie:
a – objętość 0.1 M KOH zużyta na miareczkowanie próby badanej [ml]
b – objętość 0.1 M KOH zużyta na miareczkowanie elanolu [ml] (próba ślepa)
c – ilość tłuszczu [g]
7.2. OZNACZANIE LICZBY JODOWEJ TŁUSZCZÓW
Tłuszcze o dużej zawartości estrów nienasyconych kwasów tłuszczowych (oleje roślinne) cechują się dużą wartością liczby jodowej,
natomiast tłuszcze zawierające niewiele wiązań podwójnych (masło zwierzęce, smalec) mają małą liczbę jodową.
Wykonanie: Przygotować trzy kolby stożkowe o pojemności 100 ml z doszlifowanym korkiem. Na folii aluminiowej odważyć
dokładnie 0.1 g oleju i 0.2 g masła zwierzęcego a następnie przenieść olej i masło do kolb, zwilżając uprzednio korek
roztworem KI. Następnie do każdej z kolb dodać 5 ml chloroformu przepłukując folie, na których został zważony tłuszcz
(kolba trzecia będzie zawierała wyłącznie chloroform – próba kontrolna). Dokładnie rozpuścić tłuszcz. Dodać 7.5 ml
odczynnika Hanusa. Kolbę starannie zamknąć korkiem i po wymieszaniu pozostawić w ciemności na 30 min. Po upływie
tego czasu dodać 7.5 ml 10% roztworu KI (zmywając nim szyjkę kolby i korek) oraz 25 ml wody destylowanej. W wyniku
reakcji IBr i KI uwalnia się I2. Powstały jod odmiareczkować za pomocą 0.1 M roztworu Na2S2O3 do słabo różowego
zabarwienia. Następnie dodać kilka kropli 1% wskaźnika skrobiowego i skończyć miareczkowanie.
Opracowanie wyników: liczbę jodową (LJ) policzyć wg wzoru:
LJ = 1.269 (a – b)/c
gdzie:
a – objętość 0.1 M Na2S2O3 zużyta na miareczkowanie próby kontrolnej [ml]
b – objętość 0.1 M Na2S2O3 zużyta na miareczkowanie próby badanej [ml]
c – ilość tłuszczu [g]
Spodziewane wartości liczby jodowej:
masło zwierzęce: 25 – 38
olej słonecznikowy: 120 – 145
Zalecana literatura:
"Biochemia” J. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, PWN, W-wa 2005; rozdział "Lipidy i błony biologiczne", str. 319 – 342 (lub odpowiedni rozdział we wcześniejszych lub późniejszych
wydaniach).
5