Izolacja i badanie własciwości izohormonów prolaktyny z przysadek

&ARM0RZEGL.AUK†
)ZOLACJAIBADANIEWŒASCIWOuCIIZOHORMONÌWPROLAKTYNY
ZPRZYSADEKuWIÊSKICH
)SOLATIONANDINVESTIGATIONOFPROPERTIESOFTHEPROLACTINISOHORMONS
FROMPITUITARES
&LORIAN2YSZKA"ARBARA$OLIÊSKA,UCYNA,ESZCZYÊSKA!NETA/STR̘KA†#IEuLIK
+ATEDRA&ARMACJI3TOSOWANEJI4ECHNOLOGII,EKÌWgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNY7YDZIAŒ&ARMACEUTYCZNY
3OSNOWIEC
&ARMACEUTYCZNY:AKŒAD.AUKOWO†0RODUKCYJNY`"IOCHEFAn3OSNOWIEC
Streszczenie
Celem badań było opracowanie metody otrzymywania
prolaktyny i jej izohormonów – nieglikozylowanej prolaktyny (n-G-PRL) i glikozylowanej (G-PRL) oraz zbadanie
ich właściwości fizyko-chemicznych, biologicznych i immunologicznych.
Stosując metodę Box’a matematycznego planowania eksperymentu opracowano sposób otrzymywania kwaśnego
proszku acetonowego (KPA) z liofilizowanych przysadek
świńskich, zawierający obie formy prolaktyny. Oddzielono
białka balastowe poprzez rozpuszczenie KPA w 0,1M r-rze
CH3COOH i strącenie surowej prolaktyny doprowadzając
pH roztworu do 5,0. Uzyskany osad oddzielano i rozpuszczano w 0,05M r-rze buforu fosforanowego, pH 7,50 i adsorbowano na kolumnie wypełnionej DEAE-Sefadeksem
A-25. Prolaktynę nieglikozylowaną (n-G-PRL) eluowano
przy stężeniu NaCl 0,09 – 0,16M, a glikozylowaną prolaktynę (G-PRL) w zakresie stężeń 0,19 – 0,25M. Stosując
sączenie żelowe na kalibrowanej kolumnie wypełnionej
Sefadeksem G-100 określono, że G-PRL rozdziela się na
frakcje: 1-a o masie cząsteczkowej 25,2 kDa, a 2-ga o masie 17,4 kDa. n-G-PRL miała natomiast masę cząsteczkową – 23 kDa.
Czystość izohormonów została potwierdzona metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS.
Analiza glikozylowanej PRL wykazała obecność mannozy
i fukozy. Obie formy PRL wykazały wysoką aktywność
biologiczną testem na pseudociężarnych samicach szczura, a uzyskane przeciwciała królicze wykazały silne miano n-G-PRL. Miano przeciwciał dla G-PRL było znacznie
niższe.
Opracowano metodę otrzymywania nieglikozylowanej
prolaktyny (n-G-PRL) i glikozylowanej (G-PRL). Wykazano znaczące różnice w badanych ich właściwościach.
Abstract
The aim of this study was to develop a method for obtaining
prolactin and her isohormons-glycosylated form (G-PRL)
and to study their physico-chemical, biological and immunological properties.
Using the method of Box `a mathematical experiment planning method was developed for obtaining the acid acetone
powder (KPA) from freeze-dried pig hypophyses containing
both forms of prolactin. Ballast proteins separated by dissolving KPA in 0,1M solution CH3COOH and precipitation
of crude prolactin bring the solution pH to 5.0. The resulting precipitate separated and melt in 0.05 M phosphate
buffer solution, pH 7.50, and absorbed on the column filled
with DEAE-Sephadexem A-25. Prolactin not glycosylated
(n-G-PRL) eluate at 0,09-0,16 M NaCl concentration, and
glycosylated prolactin (G-PRL) in the concentration range
0,19-0,25 M. Applying gel filtration on a column calibrated
Sephadex G-100 states that G-PRL in the fractions are separated: the first molecular mass of 25.2 kDa and the other
with a mass of 17.4 kDA, n-G-PRL had a molecular mass
of - 23 kDa.
Purity of the isohormons was confirmed using gel electrophoresis in SDS containing polyacrylamide. Glycosylatet
analysis showed the presence of PRL mannose and fucose.
Both forms of PRL showed high biological activity test for
pseudo-pregnant female rat, and rabbit antibodies obtained
showed a strong antibody titres to the n-G-PRL. The titre of
antibodies to G-PRL was significantly lower, however.
Developed a method of receiving not glycosylated prolactin
(n-G-PRL) and glycosylated (G-PRL). Shown significant
differences in the test properties.
Key words:Isolation, investigation, purification, pig hypophysis, isohormons, prolactin
Słowa kluczowe: Otrzymywanie, oczyszczanie, przysadki
świńskie, izohormony, prolaktyna
* Praca naukowa finansowana ze środków na naukę
w latach 2006 – 2008 jako projekt badawczy własny Nr N405 002 31/0124
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
'˜ ւ
Prolaktyna (PRL) jest hormonem polipeptydowym przysadki mózgowej. Zbudowana jest z 200 reszt aminokwasowych i posiada 3 mostki di siarczkowe. Jest jednym z najstarszych hormonów, gdyż wykryto ją nawet u owadów. Jest
jednocześnie jednym z najwszechstronniejszych hormonów.
U człowieka powoduje ponad trzysta efektów metabolicznych [1,2]. Większość poznanych funkcji PRL związana jest
przede wszystkim z utrzymaniem homeostazy organizmu
i rozmnażaniem [3].
Prolaktyna jest przedmiotem obszernych badań, a jej
właściwości opisano w licznych pracach poglądowych
i przeglądowych [1,2,4,5].
Badania ostatnich lat pozwoliły wykazać, że różnorodność form prolaktyny związana jest z licznymi modyfikacjami posttranslacyjnymi: proteolizą, glikozylacją, fosforylacją, sulfatacją, deamidacją, polimeryzacją oraz z kompleksowaniem z innymi białkami [1,2].
Poza badaniami nad rolą prolaktyny w ustroju oraz jej
znaczeniem diagnostycznym [5,6], zwróciliśmy uwagę
na możliwości jej zastosowania jako substancji leczniczej
w kardiologii [7-11], ortopedii w celu zwiększenia gęstości
kości [12,13] oraz jako składnik płynów do przechowywania narządów w transplantacji [14-16]. Interesujące wydaje
się także jej zastosowanie dla stymulacji laktacji u loch [17]
oraz dla stymulacji wzrostu i rozwoju prosiąt [18].
Ze względu na praktyczne aspekty stosowania prolaktyny (n-G-PRL) i jej glikozylowanego izohormonu (G-PRL)
celem badań była modyfikacja metody otrzymywania obu
form prolaktyny oraz określenie wybranych ich właściwości
[20,21].
- R–l-tŸlŸuR |J¬
Otrzymywanie kwaśnego proszku acetonowego (KPA)
Przysadki świńskie liofilizowane ekstrahowano 70% zakwaszonym acetonem o pH 1,3. Objętość ekstrahenta była
stała i wynosiła 10 objętości na jednostkę masy surowca
(10:1). Eksperyment przeprowadzono zgodnie z zastosowaniem matematycznego planowania eksperymentu w układzie 23 (metoda Box’a). Badano wpływ 3 czynników: czasu
ekstrakcji – X1 (15 i 45 minut), objętości acetonu do strąca-
Nr doświadczenia
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Wartość
czynnika w
bezwzględnym
układzie
współrzędnych
Z1 Z2 Z3
-1
-1
-1
+1
-1
-1
-1
+1
-1
+1
+1
-1
-1
-1
+1
+1
-1
+1
-1
+1 +1
+1
+1 +1
Wartość czynnika
w naturalnym
układzie
współrzędnych
X1
15
15
15
15
45
45
45
45
30
X2
2
2
4
4
2
2
4
4
3
X3
-20
+20
-20
+20
-20
+20
-20
+20
0
Tabela I. Macierz planowania eksperymentu 23 (Metoda
Box’a)
nia – X2 (2 i 4 litry) oraz temperatury strącania – X3 (-20oC
i +20oC) na zmienne zależne: masa osadu KPA (Y1) oraz
zawartość w nim białka (Y2).
Plan eksperymentu przedstawiono w tabeli I.
Czynnik A – czas ekstrakcji surowca;
Czynnik B – objętości acetonu zużytego do strącania białek z ekstraktu;
Czynnik C – temperatura strącania białek ekstraktu.
W planie eksperymentu doświadczenie nr 9 odpowiada
poziomowi podstawowemu. Jednostkowy przedział zmian
dla czasu ekstrakcji (X1) = 30 min.; objętości acetonu (X2)
=3 l; temperatury strącania (X3) = 20oC.
Otrzymywanie surowej prolaktyny (P2)
10g osadu KPA otrzymany według wariantu 7 zawieszano w 1 litrze 0,1M roztworu kwasu octowego. Część nierozpuszczalną oddzielano wirowaniem, a nadsącz doprowadzano do wartości pH 5,0 za pomocą 2M roztworu amoniaku.
Strącanie prolaktyny prowadzono w temperaturze od 2 do
6oC. Sformowany osad surowej prolaktyny oddzielano wirowaniem. Otrzymany osad zawieszano w wodzie i liofilizowano, a nadsącz wylewano [20].
Oczyszczanie surowej prolaktyny (P2)
1g osadu surowej prolaktyny (P2) rozpuszczano w 200
ml 0,05M roztworu buforu fosforanowego, pH 7,5 i wnoszono na kolumnę chromatograficzną o wymiarach 20 x 4,2
cm, która wypełniona była DEAE-Sefadeksem A-25, który
zrównoważono tym samym buforem. Zaadsorbowane substancje eluowano w gradiencie stężenia NaCl od 0,00 do
0,40M w buforze fosforanowym, pH 7,5. Zawartość białka
w otrzymanych eluatach oznaczano spektrofotometrycznie
przy długości fali λ=278 nm. Uzyskane zeluowane frakcje
białek, od 12 do 16 i od 28 do 36, łączono ze sobą i strącano
50% etanolem w temperaturze 2 – 4oC. Otrzymane osady
zawieszano w wodzie i liofilizowano. Uzyskano 2 frakcje:
P4 i P5.
Frakcję - P5 rozpuszczano w 0,1M roztworze kwasu
octowego i wnoszono na kolumnę wypełnioną Sefadeksem
G-100, który zrównoważono 0,1M roztworem kwasu octowego. Uzyskano 2 frakcje: P6 i P7.
Badania analityczne
W procesie izolacji i oczyszczania białek określano następujące ich właściwości:
- Zawartość białka - Metodą spektrofotometryczną mierząc ekstynkcję 0,05% roztworu białka przy długości fali
λ=278 nm. Pomiarów absorbancji dokonywano w kuwetach kwarcowych o grubości 1 cm przy użyciu spektrofotometru UV-VIS “Cecil 3021” (Anglia). Dokładność
fotometryczna spektrofotometru wynosiła + 0,005 A.
- Współczynnik optyczny [K] - Mierzono ekstynkcję
0,05% roztworu białka przy długości fali λ=250 nm
i λ=278 nm. Współczynnik [K] obliczano jako stosunek
ekstynkcji przy długości fali λ=278 nm/λ=250 nm.
&ARM0RZEGL.AUK
- Stosunek tyrozyny [Tyr] do tryptofanu [Trp] - Mierzono
ekstynkcję 0,05% roztworu białka w 0,1 M roztworze
NaOH przy długości fali λ=280 nm i λ=294 nm. Wartość stosunku wyliczono ze wzoru: [Tyr]/[Trp] = [0,592
x E(294) – 0,263 x E(280)] / [0,263 x E(280)] – 0,170 x
E(294)], gdzie: E – wartość absorbancji przy odpowiedniej długości fali [22].
- Zawartość cukrów – fukozy i mannozy. Zawartość fukozy oznaczano metodą w obecności cysteiny i kwasu
siarkowego, a zawartość mannozy – metodą orcynolową
[23].
- Masę cząsteczkową - Określano wobec wzorca Molecular weight markers 12.300 – 78.000 firmy Sigma metodą
elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem
SDS [24].
- Oznaczanie aktywności biologicznej – Badanie przeprowadzono wobec II Międzynarodowego Wzorca PRL na
22-dniowych pseudociężarnych szczurzycach szczepu
Wistar o masie ciała 44 – 52 g. Badania przeprowadzono
za zgodą Komisji Etycznej Śl.A.M. [25].
Wariant
1
2
3
4
5
6
7
8
9
X1
X2
X3
Kwaśny proszek acetonowy (KPA)
Masa [g/kg]
Zawartość białka [mg/g]
19,8 + 4,3
662,5 + 143,8
17,6 + 2,9
678,1 + 111,7
23,9 + 5,2
752,2 + 163,7
23,8 + 4,8
631,6 + 126,8
20,7 + 2,3
627,1 + 69,7
19,7 + 3,9
670,3 + 132,7
25,5 + 4,1
627,0 + 100,8
22,5 + 1,9
593,3 + 50,1
18,8 + 2,9
629,3 + 97,1
Poziom istotności
n.s.
n.s.
0.002
n.s.
n.s.
n.s.
Korelacja cząstkowa (r)
X1
X2
X3
0,362
0,838
0,149
0,182
-0,092
-0,564
Tabela II. Wpływ warunków otrzymywania kwaśnego proszku acetonowego (KPA) na jego masę i zawartość białka.
n.s. – nieistotne statystycznie
Metody immunologiczne
Do badań nad uzyskaniem przeciwciał użyto po 6 młodych królików o masie ciała około 6 kg [26]. Każdemu
królikowi podano 500 μg prolaktyny rozpuszczonej w 1 ml
0,9% roztworu NaCl oraz 250 μl zhomogenizowanego pełnego adiuwanta Freuda. Dawki przypominające podawano
po 100 μg hormonu. Szczepienie prowadzono do uzyskania
miana n-G-PRL około 40.000/ml surowicy. Po uzyskaniu
odpowiedniego miana pobierano u królików krew z żyły
brzeżnej ucha na skrzep lub heparynę i uzyskiwano surowicze przeciwciała, które przechowywano w zamrażarce.
Przeciwciała na G-PRL uzyskiwały miano na poziomie
10.000/ml surowicy.
Oznaczanie zawartości PRL metodą RIA
Do oznaczenia zawartości PRL zastosowano królicze
przeciwciała oraz jodowaną czystą PRL (n-G-PRL). Swoiste wiązanie n-G-PRL było na poziomie 30% co odpowiadało wymaganiom.
Obliczenia matematyczne i statystyczne
Wyniki przedstawiono jako średnią (x). Obliczono odchylenie standardowe (Sd).
'¬ylpl
Otrzymywanie kwaśnego proszku acetonowego (KPA)
Kwaśny proszek acetonowy otrzymywano z 200 g przysadek świńskich liofilizowanych według schematu 23. Uzyskane wyniki zestawiono w tabeli II.
gdzie ekstrakcję prowadzono tylko 15 minut i strącano
4 objętościami acetonu w temperaturze -20oC. Czynnikiem
warunkującym wydajność KPA było stężenie acetonu przy
strącaniu. Zawartość białka w KPA związana natomiast była
z temperaturą strącania.
Otrzymywanie surowej PRL
Osad prolaktyny – frakcja (P1) otrzymany w optymalnym wariancie (Tabela 2, pozycja 7) rozpuszczano w 0,1M
roztworze kwasu octowego i doprowadzano do pH 5,0.
Osad oddzielano wirowaniem, zawieszano w wodzie i liofilizowano – frakcja (P2). Z 10 g frakcji (P1) o aktywności
14,5 j.m./mg otrzymywano 2,4 g osadu – frakcja (P2) o aktywności 21,1 j.m./mg z wydajnością – 40,5%. Właściwości
frakcji (P1) zestawiono w tabeli III.
Izolacja izohormonów PRL
Osad (P2) rozpuszczano w 0,05M roztworze buforu fosforanowego, pH 7,5 i wnoszono na kolumnę wypełnioną
DEAE-Sefadeksem A-25. Niezaadsorbowana frakcja białka (P3) była nieaktywna. Aktywne frakcje eluowano przy
stężeniu NaCl 0,09 – 0,16M – frakcja (P4) i 0,19 – 0,25M
– frakcja (P5). Wykonywano sączenie żelowe otrzymanych frakcji na kolumnie wypełnionej Sefadeksem G-100
w 0,1M roztworze kwasu octowego. Frakcja (P4) eluowała
się w postaci 1-go szczytu i jej masa cząsteczkowa wynosiła
~ 23 kDa. Frakcję (P5) rozdzielono na 2 frakcje: (P6) o masie cząsteczkowej 25 kDa i (P7) o masie cząsteczkowej 17,4
kDa. Wybrane właściwości poszczególnych frakcji przedstawiono w tabeli IV.
1/
Największą wydajność KPA uzyskano gdy czas ekstrakcji wynosił 45 minut, do strącenia białek użyto 4 objętości
acetonu, a temperatura strącania wynosiła: -20oC. Największa zawartość białka w 1 g KPA uzyskano w wariancie 3
- μg/mg białka;
- maksymalna aktywność biologiczna – 40,0 j.m./mg;
Każdy etap oczyszczania frakcji (P1) i (P2) zwiększa
zawartość białka oraz aktywność biologiczną o około 50%.
Również zwiększa się stosunek tyrozyny do tryptofanu, któ2/
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Surowa prolaktyna (P1)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
2,92 + 1,11
3,81 + 1,21
2,70 + 0,70
3,71 + 0,90
3,58 + 1,78
3,01 + 1,11
3,90 + 1,00
3,20 + 1,62
2,96 + 0,51
Aktywność
biologiczna
[j.m./mg]
3,7 + 1,0
6,2 + 1,9
8,4 + 2,0
8,7 + 0,8
9,2 + 1,3
14,2 + 1,9
12,7 + 1,1
14,5 + 1,2
8,9 + 1,3
X1
X2
X3
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
0.013
X1
X2
X3
-0,947
0,956
-0,871
0,602
0,349
0,749
Wariant
Masa [g/kg]
Współczynnik optyczny [K]
Wydajność [j.m./kg]
0,99
1,34
1,37
1,38
1,40
1,56
1,80
1,57
1,26
Poziom istotności
n.s.
n.s.
0.046
Korelacja cząstkowa (r)
0,658
0,460
0,693
10,804
23,622
22,680
32,277
32,936
42,742
49,530
46,400
26,344
0,011
n.s.
n.s.
0,796
0,917
0,961
Tabela III. Wpływ warunków otrzymywania kwaśnego proszku acetonowego (KPA) na właściwości surowej prolaktyny (P1)
Właściwości
Zawartość białka [%]
Stosunek [Tyr]/[Trp]
Współczynnik optyczny [K]
Aktywność biologiczna [j.m./
mg]2/
Masa cząsteczkowa [kDa]
Masa osadu [g]
P1
P2
54,6 + 2,9
2,63 + 0,81
1,39 + 0,06
14,5 + 2,5
15-60
10,2
60,2 + 3,0
2,93 + 1,00
1,28 + 0,03
21,1 + 3,1
15-45
2,4
Tabela IV. Właściwości prolaktyny na etapach jej oczyszczania
ry świadczy o zmniejszeniu się ilości białek balastowych.
Frakcja (P3) była nieaktywna, a jej obraz w elektroforezie
nie odpowiadał czystej PRL. Aktywność biologiczna frakcji (P4) wynosiła 25 j.m./mg, a masa cząsteczkowa 23 kDa.
Odpowiada to właściwościom nieglikozylowanej prolaktyny (n-G-PRL). Inne badane właściwości odpowiadały czystej PRL. Współczynnik optyczny [K] wynosił 1,50, a stosunek [Tyr]/[Trp] – 3,51. Odpowiadało to zawartości tych
reszt aminokwasowych w cząsteczce n-G-PRL. Nie stwierdzono obecności fukozy, a tylko śladowe ilości mannozy.
Frakcje (P5) oczyszczano za pomocą sączenia żelowego na
Sefadeksie G-100. Pozwoliło to otrzymać jednorodną frakcję (P6) odpowiadającą glikozylowanej PRL (G-PRL) oraz
frakcję (P7). Masa cząsteczkowa G-PRL określona metodą
sączenia żelowego na kolumnie wypełnionej Sefadeksem
G-100 oraz elektroforezą w żelu PAA z dodatkiem SDS
Właściwości
Zawartość białka
Stosunek [Tyr]/[Trp]
Współczynnik optyczny [K]
Zawartość fukozy [μg/mg]1/
Zawartość mannozy [μg/mg]1/
Aktywność biologiczna [j.m./mg]2/
Masa cząsteczkowa [kDa]
wynosiła 25,4 + 0,6 kDa. Aktywność biologiczna G-PRL
wynosiła 38 j.m./mg. Zawartość mannozy odpowiadała 15
resztom, a fukozy 1 reszcie na cząsteczkę glikozylowanej
PRL. Stosunek [Tyr]/[Trp] wynosił 3,12, a współczynnik
[K] – 1,54. Otrzymana frakcja (P5) jest więc glikozylowanym izohormonem PRL.
Właściwości otrzymanych izohormonów prolaktyny zestawiono w tabeli V.
Frakcja (P7) jest stosunkowo niskocząsteczkowa – 17,4
kDa. Jej niska aktywność biologiczna – 12,2 j.m./mg sugeruje, że może być fragmentem G-PRL, o czym świadczy zawartość 2 reszt mannozy. Charakterystyczny jest natomiast
wysoki współczynnik optyczny [K] – 1,75. Frakcja ta będzie
przedmiotem specjalnych badań, ze względu na jej możliwe
nowe właściwości biologiczne i perspektywę zastosowania.
Badania immunologiczne
Immunizacja królików n-G-PRL pozwoliła otrzymać
przeciwciała o zadawalającym mianie – około 40.000/ml,
a także dobry stopień wiązania – 30%. W badanych warunkach
G-PRL wykazała niskie zdolności wytworzenia przeciwciał, co
może sugerować o możliwościach jej stosowania u ludzi.
Przeciwciała anty n-G-PRL zostały wykorzystane do
oznaczania zawartości PRL na etapach jej oczyszczania.
n-G-PRL
81,5 + 2,7
3,51 + 0,26
1,48 + 0,02
ślady
<0,3
25,8 + 2,9
23,0
Frakcje prolaktyny
G-PRL
90,0 + 1,4
3,12 + 0,2
1,51 + 0,10
1,5 + 0,4
48,5 + 2,1
38,2 + 3,9
25,4
P7
86,2 + 1,5
3,4 + 1,1
1,75 + 0,88
0,91 + 0,02
22,5 + 2,4
17,4 + 1,0
17,4
Tabela V. Właściwości izohormonów prolaktyny (n-G-PRL), (G-PRL) i P7
1/
- μg/mg białka;
2/
- maksymalna aktywność biologiczna – 40,0 j.m./mg;
&ARM0RZEGL.AUK
Frakcje PRL
P-1
P-2
P-3
P-4
(n-G-PRL)
P-5
P-6
(G-PRL)
P-7
CPM
równoległe
5.513
5.681
4.473
4.353
12.277
12.499
2.549
2.445
10.198
10.442
11.799
12.089
12.204
11.978
Zawartość PRL
[ng/ml]
[%]
Średnia
Wartość netto
(T-K)
% wiązania
5.597
5.166
35
64
32
4.416
3.985
27
85
42,5
12.388
11.957
81
7
3,5
2.497
2.066
14
190
95
10.320
9.889
67
15
7,5
11.944
11.513
78
9
4,5
12.091
11.600
79
10
5
Tabela VI. Zawartość prolaktyny we frakcjach oznaczona metodą RIA
Wyniki zestawiono w tabeli VI.
Tabela VI. Zawartość prolaktyny we frakcjach oznaczona metodą RIA
Na początkowych etapach oczyszczania zawartość PRL
we frakcjach (P4) i (P5) jest znaczna – do 40%. Frakcja
(P3) praktycznie nie zawiera PRL. Wysoką zawartość PRL
stwierdzono natomiast we frakcji (P4) – do 90%. Glikozylowana PRL wykazuje słabe właściwości antygenowe co
z punktu widzenia jej możliwości stosowania u ludzi jest
zjawiskiem pozytywnym.
¬˜p¥˜o-ŸŸ
Duże podobieństwo w budowie cząsteczek PRL pochodzących od różnych gatunków zwierząt i ludzi daje możliwość stosowania tego hormonu pochodzenia zwierzęcego
w medycynie. Tym bardziej, że zawartość PRL w przysadkach mózgowych świń, krów i owiec jest około 50 razy
wyższa niż w przysadce człowieka – 25-50 μg/g. Długi czas
uważano, że polifunkcjonalność prolaktyny, podobnie jak
innych hormonów białkowo-peptydowych, związana jest z
budową samego hormonu. Następnie stwierdzono, że PRL
może istnieć w postaci monomeru, dimeru lub w postaci zagregowanej lub częściowo jako prolaktyna sfragmentowana o różnej masie cząsteczkowej [1-3]. Następnym etapem
było wykrycie glikozylowanej prolaktyny (G-PRL) u różnych gatunków zwierząt [1,2]. Stwierdzono, że glikozylacja
ma różny wpływ na aktywność biologiczną hormonu [1,2].
Zwiększa lub zmniejsza jego aktywność. Ostatnio stwierdzono, że różnorodność cząsteczek PRL związana jest z posttranslacją. Jednym z najciekawszych kierunków badania
frakcji PRL jest jej immunogenność, jak i angiogenność. Te
właściwości związane są z glikozylacją oraz z fragmentacją
cząsteczki PRL [1,2].
Stosując metodę ekstrakcji świeżych przysadek, wykryto w przysadkach świń glikozylowaną prolaktynę (G-PRL)
o masie cząsteczkowej 25 kDa [27]. Wśród węglowodanów
stwierdzono obecność heksozamin, mannozy, galaktozy
oraz fukozy. W naszych badaniach zastosowaliśmy ekstrakcję przysadek liofilizowanych zakwaszonym acetonem
z następowym oczyszczaniem osadu białek poprzez strącenie ich w punkcie izoelektrycznym przy pH=5,0. Metodą
chromatografii jonowymiennej na DEAE-Sefadeksie A-25
otrzymaliśmy nieglikozylowaną (nG-PRL) oraz glikozylowaną prolaktynę (G-PRL). Sączenie żelowe G-PRL na
kolumnie z Sefadeksem G-100 pozwoliło uzyskać 2 frakcje istotnie różniące się między sobą masą cząsteczkową,
ruchliwością elektroforetyczną oraz właściwościami fizykochemicznymi. Pierwsza frakcja o masie cząsteczkowej – 25
kDa, zawierała około 15 reszt mannozy oraz 1 resztę fukozy,
a jej aktywność biologiczna wynosiła około 38,2 j.m/mg.
Druga frakcja - niskocząsteczkowa o masie cząsteczkowej
17,4 kDa posiadała znacznie niższą aktywność biologiczną
– 16,0 j.m./mg i mniejszą zawartość węglowodanów.
Uzyskane wyniki wskazują na istnienie różnych izoform
prolaktyny, co byłoby istotnym uzasadnieniem polifunkcjonalności tego hormonu, w tym jego różnorodnym działaniem oraz możliwością szerszego stosowania nie tylko
w weterynarii [17,18, ale również w badaniach klinicznych
i zastosowaniu praktycznym [9-11,15].
'yl|˜Rp
Opracowano metodę izolacji izohormonów prolaktyny
- nieglikozylowanej (n-PRL) i glikozylowanej (G-PRL) z
przysadek świńskiich i wykazano ich różnice we właściwościach.
Piśmiennictwo
1. Ryszka F, Dolińska B, Leszczyńska L. Izomery prolaktyny i ich funkcja biologiczna. Farm. Przegląd Naukowy 2008; 7-8: 49-53.
2. Michalik J, Bartoszewicz Z. Prolaktyna (PRL)- wielofunkcyjny hormon peptydowy. Postępy Biochemii 2002;
4: 296-305.
3. Endocrinology Basic and Clinical Principles. Reds.
Melmed S, Conn P.M. Humana Pres, New Jersey 2005,
204-206.
4. Parata-Turska J. Prolaktyna w układach chorobowych tkanki łącznej. Postępy Hig Med Dośw 2006;
60: 278-285.
5. Kałużny M, Bolanowski M. Hiperprolaktynemia: Przyczyny, objawy kliniczne i możliwości terapeutyczne. Postępy Hig Med Dośw 2005; 59: 20-27.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
6. Vonderhaar B. K. Prolactin involvement in breast cancer.
Endocrine-related Cancer 1999; 6: 389-404.
7. Ryszka F, Chylak M, Dolińska B. et al. Uptake of prolactin and tyroliberin by the heart. Int J Tissue React 2000;
4: 101-104.
8. Ryszka F, Dolińska B, Suszka-Świtek A. Distribution of
prolactin in selected rats organs and tissues. Int J Tissue
React 2002; 1: 99-109.
9. Ryszka F, Dolińska B, Suszka-Świtek A. The effect multiple doses of Biolactin (PRL) on the systolic blood pressure in rats with spontaneous arterial hypertension. Die
Pharmazie 1998; 53: 886-889.
10. Maciejewska I, Wieczorek M, Ryszka F. Effect of prolactin upon changes in the functioning and structure of
the heart after adrenaline. Ann Acad Med Siles 1995; 29:
19-26.
11. Ryszka F, Dolińska B. Wpływ prolaktyny na wybrane
wskaźniki gazometryczne i biochemiczne krwi konserwowanej płynem ACD. Ann Aced Med Siles 1995; 29:
27-33.
12. Ryszka F, Dolińska B. Innitial studies on the administration route of prolactin. Boll Chim Farm 2001; 3:
169-171.
13. Ryszka F, Dolińska B, Suszka-Świtek A. The influence of prolactin upon bones mineral density (BMD) and
some biochemical marker sow rat females after ovariectomy. Acta Pol Bioch 2008; 3: 97-99.
14. Szulc-Musioł B. i wsp. The influence of prolactin on
the chosen biochemical parameters of the rabbit liver in
ischemia. Acta Pol Pharm 2004; 6: 477-482.
15. Ryszka F. i wsp. Effect of prolactin on release of selected
enzymes from the isolated rabbit liver. Transplant Proc
2004; 36: 2583-2585.
16. Ryszka F. i wsp. Effect of prolactin on microsomal cytochrom P-450 system diuring warm ischemia injures. Pol
J Pharmacol Suppl 2004; 56: 205-206.
17. Dusza L, Murdza A, Dolińska B, Ryszka F. Effect of
exogenous prolactin (PRL) on primaparous sows with
agalactia. Endocrinol Farm Animals 1989; 2: 237-241.
18. Ryszka F. Sposób przyspieszenia rozwoju prosiąt ssących. Zgłoszenie Patentowe RP nr P-386294, 2008.
Zgłoszenie Europejskie EP09460028, 13.07.2009.
19. Ryszka F. i wsp. Wpływ warunków otrzymywania kwaśnego proszku acetonowego (KPA) na parametry surowej prolaktyny. Ann Acad Med Siles 2003; 4: 56-57.
20. Ryszka F, Dolińska B. Sposób otrzymywania prolaktyny. Zgłoszenie Patentowe RP nr P376248; 2005.
21. Ryszka F, Dolińska B. Isolation and properties of glucosylated pig prolactin (G-PRL). Boll Chim Farm 2004:
4: 166-169.
22. Ryszka F. Badania nad izolacją i właściwościami wybranych hormonów przysadki mózgowej. Rozprawa habilitacyjna, Zabrze 1981.
23. Kłyszejko-Stefanowicz I. Ćwiczenia z biochemii. PWN,
Warszawa 1999,191-210, 103-110.
24. Lambin P, Rodin D, Fine J. A new method for determination of molecular weights of proteins by electrophoresis
cross a sodium dodecyl sulfate PAGE. Animals Biochem
1973; 74: 567-575.
25. Ryszka F. i wsp. Wpływ prolaktyny na masę macic
szczurzych. Ann Acad Med Siles. 2003; 56-57: 39-42.
26. Kokot F, Strupnicki R. Metody radioimmunologiczne i radiokompetencyjne stosowane w klinice. PZWL, Warszawa 1985.
27. Lewis U. Chemistry of prolactin In „ Compative endocrinology of prolactin:. Eds. By Dellman h.D., Johnson
I.A., Klubko D.M., Plenum Press New York 1997.
Adres do korespondencji:
Dr hab. n. farm. Barbara Dolińska
Farmaceutyczny Zakład Naukowo-Produkcyjny „Biochefa”, 41-205 Sosnowiec,
Kasztanowa 3
tel.: (32) 291 69 68
e-mail: [email protected]