CSA II Biotin-free Tyramide Signal Amplification System Nr

CSA II
Biotin-free
Tyramide Signal
Amplification System
Nr kat. K1497
Do uŜytku z pierwotnymi przeciwciałami mysimi
Ograniczona licencja
na uŜytkowanie
W tym systemie wykorzystano na mocy licencji technologię opracowaną przez firmę NEN Life Science
Products, Inc. (patent USA nr 5,196,306).
Ten produkt jest rozpowszechniany i sprzedawany UŜytkownikowi Końcowemu zgodnie z licencją udzieloną
przez NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC., uprawniającą UŜytkownika Końcowego do wykorzystania
produktu w procesie ręcznego lub zautomatyzowanego przetwarzania wyłącznie szkiełek mikroskopowych lub
innych materiałów pomocniczych (z wyjątkiem mikromacierzy i biochipów) zawierających próbki komórkowe
lub tkankowe przy uŜyciu przyrządów Dako do mikroskopowego badania tych próbek (takŜe przy uŜyciu
zautomatyzowanych systemów akwizycji i analizy obrazów) w celu wykrywania określonych kwasów
nukleinowych lub białek. Zakup nie jest równoznaczny z uzyskaniem lub przeniesieniem prawa do
odsprzedaŜy lub przenoszenia prawa własności do tego produktu jako do produktu autonomicznego lub jako
do składnika innego produktu. Wykorzystanie produktu w sposób inny niŜ określony w licencji bez wyraźnej
pisemnej zgodny NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. jest surowo zabronione.
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Niniejsze instrukcje dotyczą produktu CSA II (nr kat K1497). CSA II to niezawierający biotyny tyramidowy
system amplifikacji odczynów do badań immunohistochemicznych.
Opisywany system jest przeznaczony do stosowania z pierwotnymi przeciwciałami mysimi wybranymi przez
UŜytkownika, w celu jakościowej identyfikacji antygenów w preparatach tkanek prawidłowych i zmienionych
chorobowo utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie. Identyfikację prowadzi się w mikroskopie
świetlnym. Ten system moŜe być uŜywany w procedurach ręcznych i/lub w urządzeniach firmy Dako.
W dokumencie „General Instructions for Immunohistochemical Staining” („Instrukcje wykonywania odczynów
immunohistochemicznych”) opisano następujące zagadnienia: (1) Zasady procedury, (2) Niezbędne materiały
niedostarczone z zestawem, (3) Przechowywanie, (4) Przygotowanie preparatu, (5) Wykonanie odczynu,
(6) Kontrola jakości, (7) Rozwiązywanie problemów, (8) Interpretacja wyniku odczynu, (9) Ograniczenia metody.
Streszczenie
i informacje ogólne
CSA II System to wysoce czuła procedura wykonywania odczynu immunohistochemicznego (IHC), w której
wykorzystywana jest metoda amplifikacji oparta na katalizowanym przez peroksydazę odkładaniu się
znakowanego fluoresceiną związku fenolowego, po której następuje reakcja wtórna ze skoniugowanym
z peroksydazą przeciwciałem przeciwko fluoresceinie.1-5 W ramach procedury najpierw pierwotne przeciwciało
mysie jest wykrywane przy uŜyciu skoniugowanego z peroksydazą przeciwciała wtórnego. W następnym kroku
związana peroksydaza jest wykorzystywana jako katalizator utleniania fenolu skoniugowanego z fluoresceiną
(fluorescyl-tyramid), który następnie wytrąca się na próbce. W dalszych etapach procedury następuje detekcja
związanej fluoresceiny przez skoniugowane z peroksydazą przeciwciało przeciwko fluoresceinie.
Wykonywanie odczynu kończy uŜycie diaminobenzydyny/nadtlenku wodoru w charakterze
chromogenu/substratu, zaś wynik moŜna obserwować w mikroskopii świetlnej. W porównaniu ze
standardowymi metodami immunohistochemicznymi, takimi jak znakowanie streptawidyną-biotyną (LSAB) lub
kompleksami awidyna-biotyna (ABC), metody amplifikacji z wykorzystaniem tyramidu są, jak stwierdzono w
badaniach, wielokrotnie bardziej czułe.3,4 CSA II System to uproszczona wersja niezwykle czułego systemu
amplifikacji Catalyzed Signal Amplification System (nr kat. K1500), w którym wykorzystywany jest odczynnik
Biotinyl-Tyramide. Wysoce czuły CSA II System umoŜliwia detekcję bardzo małych ilości białka docelowego,
a takŜe zastosowanie przeciwciał o słabym powinowactwie. UŜywanym odczynnikiem jest FluorescylTyramide, a nie Biotinyl-Tyramide, zaś system nie obejmuje odczynników zawierających awidynę/biotynę, co
eliminuje ewentualny odczyn tła spowodowany reaktywnością z biotyną endogenną.6,7
Zasady procedury
Próbki najpierw inkubowane są przez pięć minut w obecności odczynnika blokującego peroksydazę w celu
wygaszenia aktywności endogennej peroksydazy. Następnie próbki inkubowane są przez pięć minut w obecności
odczynnika blokującego białko w celu wyeliminowania nieswoistego wiązania następnych odczynników; po tej
inkubacji następuje 15-minutowa inkubacja z prawidłowo dobranymi i rozcieńczonymi pierwotnymi przeciwciałami
mysimi lub kontrolą ujemną (nie wchodzi w skład zestawu). Po tym etapie następuje seria 15-minutowych
inkubacji z przeciwciałami skierowanymi przeciw antygenom mysim skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową
(HRP), odczynnikiem amplifikującym (Fluorescyl-Tyramide z nadtlenkiem wodoru) i przeciwciałami przeciwko
fluoresceinie skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową. Wykonywanie odczynu kończy pięciominutowa
inkubacja z tetrachlorowodorkiem 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)/nadtlenkiem wodoru, która skutkuje wytrąceniem
się brązowego osadu w miejscu występowania antygenu.
(127882-001)
P04037PL_01/K1497/2015.07 s. 1/10
Dostarczany
odczynnik
Nr kat. K1497
W skład tego zestawu wchodzą następujące materiały:
Ilość
1x15 mL
Opis
Odczynnik blokujący peroksydazę
3% roztwór nadtlenku wodoru w wodzie.
1x15 mL
Odczynnik blokujący białko
Białko niesurowicze w buforze z azydkiem sodu w stęŜeniu 0,015 mol/L.
1x15 mL
Przeciwciała przeciwko mysiej immunoglobulinie skoniugowane z HRP
Przeciwciała przeciwko mysiej immunoglobulinie skoniugowane z peroksydazą chrzanową
w buforze zawierającym białko stabilizujące i środek przeciwbakteryjny.
1x15 mL
Odczynnik amplifikujący
Fluorescyl-Tyramide i nadtlenek wodoru w buforze zawierającym białko stabilizujące i środek
przeciwbakteryjny.
1x15 mL
Przeciwciała przeciwko fluoresceinie skoniugowane z HRP
Przeciwciała przeciwko fluoresceinie skoniugowane z peroksydazą chrzanową w buforze
zawierającym białko stabilizujące i środek przeciwbakteryjny.
1x18 mL
Substrat w buforze
Bufor zawierający nadtlenek wodoru i konserwant.
1x1 mL
Płynny chromogen DAB+
Roztwór chromogenu, 3,3'-diaminobenzydyny
Materiały wymagane,
ale niedostarczane
Rozcieńczalnik do przeciwciał, taki jak Antibody Diluent with Background Reducing Components
(nr kat. S3022)
Próbki kontrolne, kontrola dodatnia i ujemna
Barwnik kontrastowy, taki jak Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (nr kat. S3301 do aparatów
Dako Autostainer lub S3302 do ręcznego wykonywania odczynów)
Mikroskop świetlny
Środki do zatapiania, np.Glycergel® Mounting Medium (nr kat. C0563), Faramount, Aqueous Mounting
Medium, Ready-to-use (nr kat. S3025) lub bezwodny środek do trwałego zatapiania, np. Permanent Mounting
Media (nr kat. S3026)
Mysie przeciwciała pierwotne i odczynniki do kontroli ujemnej
Bufor płuczący, taki jak TBST (Tris Buffered Saline With Tween), 10x Concentrate (nr kat. S3306)
Automatyczne wykonywanie odczynu
Dako Autostainer (nr kat. S3400) lub Autostainer Plus (nr kat. S3800).
Koniecznie elementy przedstawiono w instrukcji dla uŜytkownika aparatu Dako Autostainer.
Materiały dodatkowe wymagane, ale niedostarczane
Zob. karta specyfikacji przeciwciał pierwotnych.
Roztwór do odmaskowania antygenu, zmodyfikowany bufor cytrynianowy (pH 6,1), taki jak Target Retrieval
Solution, Ready-to-use (nr kat. S1700) lub 10x Concentrate (nr kat. S1699)
Kąpiel wodna (utrzymująca temperaturę 95–99°C), k ąpiel parowa, szybkowar lub autoklaw do odmaskowania
antygenu.
(127882-001)
P04037PL_01/K1497/2015.07 s. 2/10
Środki ostroŜności
Dotyczące opisywanego produktu
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3
z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie
wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynników naleŜy uŜywać duŜych ilości wody do
przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydku w instalacji kanalizacyjnej.8,24
3. Unikać zanieczyszczeń mikrobiologicznych odczynnika. W przeciwnym razie moŜe dojść do nasilenia
nieswoistego barwienia.
4. Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
5. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą
bądź oczami.
6. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi.
7. Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie.
Ogólne
1. Nie naleŜy uŜywać odczynników po upływie terminu waŜności.
2. Nie uŜywać odczynników zamiennych pochodzących od innych producentów.
3. Nie naleŜy przechowywać składników systemu ani wykonywać barwienia w silnym oświetleniu, takim jak
bezpośrednie światło słoneczne.
Uwaga: W etapie inkubacji z odczynnikiem amplifikującym szkiełka naleŜy chronić przed światłem.
Uwaga
Amplification Reagent: 10-30% Glycerol
H320
Wywołuje podraŜnienie oczu.
P280
Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować
odzieŜ ochronną.
P264
Dokładnie umyć ręce po uŜyciu.
P305 + P351 + W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka
P338
minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŜeli są i moŜna je łatwo usunąć. Nadal płukać.
P337 + P313
Przechowywanie
Jeśli podraŜnienie oczu się utrzymuje: Zgłosić się do lekarza po poradę.
Niebezpieczeństwo
DAB Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride
H350
MoŜe powodować raka.
H341
Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne.
P201
Przed uŜyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŜności.
P202
Nie uŜywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków
bezpieczeństwa.
P281
Stosować wymagane środki ochrony indywidualnej.
P308 + P313
W PRZYPADKU naraŜenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską.
P405
Przechowywać pod zamknięciem.
P501
Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i
międzynarodowymi przepisami.
Odczynniki CSA II System naleŜy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamra Ŝać. Nie naleŜy uŜywać
produktów po upływie daty waŜności wydrukowanej na fiolkach odczynników i etykiecie zestawu.
Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności odczynników. Dlatego, równolegle z odczynami
na materiale pochodzącym od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku
nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy
podejrzewa się problem z zestawem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
odczynników
Bufor płuczący
Badania wykazały, Ŝe roztwór Tris-HCl o stęŜeniu 0,05 mol/L i pH 7,6, zawierający NaCl w ilości 0,3 mol/L oraz
0,1% preparatu Tween 20, bez azydku sodu, znacząco pomaga w osłabianiu odczynu tła podczas barwienia
przy uŜyciu tego systemu. Zalecany bufor płuczący to TBST 10x (nr kat. S3306). Bufory płuczące zawierające
azydek sodu unieczynniają peroksydazę chrzanową i powodują odczyn ujemny. NieuŜywany bufor
przechowywać w temperaturze 2
8°C. Nie u Ŝywać buforu, jeśli wystąpiło jego zmętnienie.
Zautomatyzowane wykonywanie odczynu
Jako uniwersalny bufor płuczący w aparacie Dako Autostainer realizującym protokół zautomatyzowany CSA II
moŜe być uŜywany Automation Buffer, 10x (nr kat. S3006), jednak po zastosowaniu nadtlenku wodoru,
przeciwciał pierwotnych i przeciwciał przeciwko antygenom mysim skoniugowanym z HRP, naleŜy zastosować
przez 5–10 minut płukanie dodatkowe roztworem TBST (nr kat. S3306). Do płukania po zastosowaniu
substratu-chromogenu i barwieniu kontrastowym moŜna uŜyć wody destylowanej lub dejonizowanej.
(127882-001)
P04037PL_01/K1497/2015.07 s. 3/10
Ręczne wykonywanie odczynu
Między poszczególnymi etapami protokołu CSA II skrawki tkankowe naleŜy płukać przez 3–5 minut
w maksymalnie trzech świeŜych partiach TBST (nr kat. S3306).
Roztwór substrat-chromogen DAB
Jeden mL substratu-chromogenu wystarcza na maksymalnie dziesięć skrawków tkankowych.
ETAP 1
ETAP 2
W zaleŜności od liczby barwionych szkiełek przenieść odpowiednią liczbę porcji 1 mL
z butelki z substratem w buforze do probówki.
Na kaŜdy 1 mL substratu w buforze dodać 1 kroplę (20 µL) z butelki Liquid DAB Chromogen.
Natychmiast zmieszać.
Przygotowany substrat-chromogen jest stabilny przez około pięć dni, jeśli przechowywany jest w temperaturze
2–8°C. Odczynnik ten nale Ŝy dokładnie wymieszać przed uŜyciem. Wytrącanie się osadu w odczynniku nie
wpływa na jakość odczynu.
Rozcieńczanie stęŜonych przeciwciał pierwotnych i kontroli ujemnej
Przeciwciała pierwotne naleŜy rozcieńczyć roztworem zawierającym białko stabilizujące. Zdecydowanie
zalecane jest uŜycie odczynnika Antibody Diluent with Background Reducing Components (nr kat. S3022),
który umoŜliwia zminimalizowanie odczynu tła. Odpowiednia kontrola ujemna zawiera immunoglobulinę mysią
naleŜącą do tego samego izotypu, co przeciwciała pierwotne, rozcieńczoną do stęŜenia odpowiadającego
stęŜeniu przeciwciała pierwotnego.
Przygotowanie
próbek
Przed rozpoczęciem odczynu IHC naleŜy wykonać utrwalenie i przeprowadzenie tkanki. Utrwalenie
zabezpiecza przed autolizą i rozkładem wycinków, utrzymuje antygenowość, zwiększa współczynnik
załamania światła przez struktury tkankowe i zwiększa odporność składników komórek na przeprowadzenie.
Przeprowadzenie tkanki polega na odwodnieniu, usunięciu środków odwadniających, przepojeniu substancją
zatapiającą, zatopieniu i wykonaniu wycinków. Utrwalacze najczęściej stosowane podczas przygotowania
tkanek do diagnostyki IHC przedstawiono w dokumencie „General Instructions for Immunohistochemical
Staining” (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych). Podane informacje mają
charakter wyłącznie orientacyjny. Optymalna procedura powinna zostać ustalona i zweryfikowana przez
UŜytkownika.
Przygotowanie
preparatów
zatopionych
w parafinie
Trwałość antygenów w próbkach tkanek uŜywanych do badań immunohistochemicznych moŜe zaleŜeć od typu
i stęŜenia środka utrwalającego, czasu utrwalania oraz od wielkości utrwalanej próbki.10-15 Dla uzyskania
powtarzalnych wyników waŜne jest zachowanie, w miarę moŜliwości, optymalnych, znormalizowanych
warunków utrwalania. Tam, gdzie jest to moŜliwe, naleŜy uŜywać cieńszych próbek i skracać czas utrwalania.
Długi kontakt ze środkami utrwalającymi moŜe spowodować zamaskowanie antygenów i osłabić odczyn.
Po utrwaleniu próbki są odwadniane przy uŜyciu roztworów alkoholu o rosnących stęŜeniach, płukane
ksylenem lub substytutem ksylenu i nasączane woskiem parafinowym. Następnie tkanka jest utrwalana w
wosku parafinowym w foremkach lub kasetach w celu ułatwienia przygotowania skrawków. Aby
zminimalizować denaturację antygenów, podczas obróbki nie naleŜy wystawiać tkanek na działanie temperatur
przekraczających 60°C.
Po zakończeniu utrwalania bloczki tkanek mogą być przechowywane lub pocięte na skrawki. Prawidłowo
utrwalone tkanki moŜna przechowywać w chłodnym miejscu (15–22°C) przez nieograniczony czas.
Zatapianie skrawków tkankowych
Skrawki tkankowe odcięte z bloczków parafinowych są umieszczane na czystych szkiełkach. NaleŜy strząsnąć
ze szkiełek jak najwięcej wody. Kropelki wody pozostałe na tkance w trakcie schnięcia mogą negatywnie
wpłynąć na proces barwienia. Suszyć w piecu przez jedną-dwie godziny w temperaturze nie wyŜszej niŜ 60°C
lub pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 15–24 godzin. Aby uzyskać lepsze przyleganie
skrawków tkankowych podczas wykonywania odczynów IHC, zalecamy stosowanie szkiełek powlekanych
poli-L-lizyną, szkiełek z ładunkiem elektrostatycznym lub silanizowanych szkiełek Silanized Slides
(nr kat. S3003). W przypadku badań wymagających odmaskowania antygenu zdecydowanie zalecane
jest uŜycie szkiełek silanizowanych.
Zautomatyzowane i
ręczne wykonywanie
odczynu
Uwagi dotyczące procedury
Przed przystąpieniem do wykonania odczynu UŜytkownik powinien uwaŜnie przeczytać podane instrukcje
i zapoznać się z zawartością zestawu.
Przed wykonaniem odczynu immunohistochemicznego wszystkie odczynniki naleŜy doprowadzić do
temperatury pokojowej (20–25°C); równie Ŝ parametry wszystkich inkubacji zoptymalizowano pod kątem
temperatury pokojowej.
Odczynniki i instrukcje dostarczane w zestawie opracowano w celu uzyskania optymalnych wyników.
Rozcieńczanie odczynników gotowych do uŜytku moŜe doprowadzić do uzyskania błędnych wyników.
(127882-001)
P04037PL_01/K1497/2015.07 s. 4/10
Uwaga: W przypadku zautomatyzowanego wykonywania odczynu pokrywa aparatu Dako Autostainer powinna
być zamknięta podczas stosowania odczynnika amplifikującego, co pozwoli na uzyskanie optymalnych
wyników. W przypadku ręcznego wykonywania odczynu szkiełka naleŜy chronić przed światłem podczas
inkubacji z odczynnikiem amplifikującym.
Podczas wykonywania barwienia nie moŜna dopuścić do wysychania skrawków tkankowych. Wysuszone
skrawki tkankowe mogą powodować występowanie nieswoistego odczynu. NaleŜy osłonić szkiełka
nakrywkowe znajdujące się w miejscach naraŜonych na przeciągi. JeŜeli stosuje się długie czasy inkubacji,
preparaty powinny się znajdować w środowisku o odpowiedniej wilgotności.
W celu ograniczenia nieswoistego odczynu tła zaleca się opłukanie skrawków tkankowych roztworem TBST
zgodnie z zaleceniami dotyczącymi buforu płuczącego w sekcji Przygotowanie odczynników.
Odparafinowanie skrawków tkankowych
Przed przystąpieniem do wykonania odczynu naleŜy odparafinować preparaty w celu usunięcia środka
zatapiającego i ponownego uwodnienia. NaleŜy unikać niecałkowitego usunięcia parafiny poniewaŜ
pozostałości środka zatapiającego powodują nasilenie nieswoistego odczynu.
Trawienie proteolityczne i odmaskowanie antygenu
Wiadomo, Ŝe formaldehyd wywołuje zmiany struktury konformacyjnej molekuł przeciwciał, tworząc wiązania
międzymolekularne. Długotrwałe utrwalenie w formalinie moŜe zamaskować miejsca występowania
antygenów i osłabić odczyn swoisty. W standardowych procedurach immunohistochemicznych miejsca
te moŜna odmaskować poprzez trawienie proteolityczne poprzedzające właściwy odczyn.
Uwaga: Trawienie proteolityczne moŜe w CSA II System wywołać silny odczyn tła i dlatego nie jest zalecane.
Preferowaną alternatywą dla trawienia proteolitycznego jest odmaskowanie antygenu metodą termiczną, które
spowoduje nieznaczne wzmocnienie odczynu tła przy jednoczesnym silnym wzmocnieniu odczynu swoistego
z wieloma przeciwciałami pierwotnymi. Aby sprawdzić, czy konieczna jest wstępna obróbka tkanek w celu
odmaskowania antygenu, naleŜy zapoznać się z kartą specyfikacji dołączoną do przeciwciała pierwotnego;
w przypadku niektórych przeciwciał pierwotnych obróbka taka jest konieczna.
Zalecana procedura odmaskowania antygenu polega na zanurzeniu zatopionych na szkiełkach skrawków
tkankowych w zmodyfikowanym buforze cytrynianowym (pH 6,1), takim jak Target Retrieval Solution,
Ready-to-use (nr kat. S1700) lub 10x Concentrate (nr kat. S1699); kompletne instrukcje ogrzewania przed
wykonaniem odczynu IHC moŜna znaleźć na ulotce dołączonej do opakowania. Dokładnie opłukać roztworem
buforu płuczącego i kontynuować procedurę wykonania odczynu.
Uwaga: Nie zaleca się uŜywania z CSA II System roztworów do odmaskowywania antygenu o wysokim
pH (pH 10), gdyŜ mogą one wywoływać silny odczyn tła.
Zautomatyzowane wykonanie odczynu
ETAP 1
Wybrać funkcję Protocol Template Auto Program (automatyczne programowanie wzoru
protokołu).
ETAP 2
Umieścić odczynniki i bufor w statywie na odczynniki aparatu Dako Autostainer.
ETAP 3
Umieścić szkiełka w aparacie Dako Autostainer.
ETAP 4
Rozpocząć serię odczynów.
ETAP 5
Wyjąć szkiełka z aparatu Dako Autostainer.
ETAP 6
Przejść do zatapiania.
Uwaga: Zalecana tabela programowania obejmuje barwienie kontrastowe. Alternatywnym rozwiązaniem jest
ręczne przeprowadzenie barwienia kontrastowego na stole laboratoryjnym.
Ręczne wykonanie odczynu
ETAP 1
ODCZYNNIK BLOKUJĄCY PEROKSYDAZĘ
Strząsnąć nadmiar cieczy. Posługując się chusteczką niepozostawiającą nitek ostroŜnie otrzeć
szkiełko wokół preparatu tak, by usunąć pozostałości płynu i utrzymywać odczynniki w obszarze
zgodnym z zaleceniami.
Dodać tyle nadtlenku wodoru, aby zakryć próbkę.
Inkubować przez 5 (±1) minut.
OstroŜnie przepłukać wodą destylowaną lub roztworem buforowym z butelki na płyn płuczący
(nie naleŜy kierować strumienia płynu bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat
w świeŜej kąpieli z buforem płuczącym.
ETAP 2
(127882-001)
ODCZYNNIK BLOKUJĄCY BIAŁKA
Strząsnąć nadmiar cieczy i przetrzeć preparat jak poprzednio.
Dodać tyle odczynnika blokującego białka, aby zakryć próbkę.
Inkubować przez 5 (±1) minut.
Nie spłukiwać odczynnika blokującego białka.
P04037PL_01/K1497/2015.07 s. 5/10
ETAP 3
PRZECIWCIAŁA PIERWOTNE LUB ODCZYNNIK DO KONTROLI UJEMNEJ
Strząsnąć nadmiar cieczy i przetrzeć preparat jak poprzednio.
Nanieść przygotowany we własnym zakresie roztwór przeciwciał pierwotnych lub odczynnika do
kontroli ujemnej, aŜ próbka zostanie zakryta.
Inkubować przez 15 (±1) minut, o ile na karcie specyfikacji przeciwciał pierwotnych nie wskazano
inaczej.
Delikatnie przemyć roztworem buforu z butelki na płyn płuczący i umieścić w maksymalnie trzech
kąpielach ze świeŜego buforu TBST, po 3–5 minut kaŜda.
ETAP 4
PRZECIWCIAŁO PRZECIWKO MYSIEJ IMMUNOGLOBULINIE SKONIUGOWANE Z HRP
Wytrzeć preparat jak poprzednio.
Dodać tyle przeciwciał przeciwko mysiej immunoglobulinie skoniugowanych z peroksydazą
chrzanową, aby zakryć próbkę.
Inkubować przez 15 (±1) minut.
Przemyć szkiełko jak w Etapie 3. Umieścić w maksymalnie trzech kąpielach ze świeŜego buforu,
po 3–5 minut kaŜda.
ETAP 5
ODCZYNNIK AMPLIFIKUJĄCY
Uwaga: W celu uzyskania optymalnego odczynu naleŜy w trakcie tego etapu chronić szkiełka
przed światłem.
Wytrzeć preparat jak poprzednio.
Dodać tyle odczynnika amplifikującego, aby zakryć próbkę.
Inkubować przez 15 (±1) minut, chroniąc przed światłem.
Przemyć preparat jak poprzednio. Umieścić w maksymalnie trzech świeŜych kąpielach z buforu
płuczącego, po 3–5 minut kaŜda.
ETAP 6
PRZECIWCIAŁA SKIEROWANE PRZECIWKO FLUORESCEINIE SKONIUGOWANE Z HRP
Wytrzeć preparat jak poprzednio.
Dodać tyle odczynnika Anti-Fluorescein-HRP, aby zakryć próbkę.
Inkubować przez 15 (±1) minut.
Przemyć preparaty jak poprzednio. Umieścić w maksymalnie trzech świeŜych kąpielach z buforu
płuczącego, po 3–5 minut kaŜda.
ETAP 7
PŁYNNY SUBSTRAT-CHROMOGEN DAB
Wytrzeć preparat jak poprzednio.
Dodać tyle płynnego substratu–chromogenu DAB, by przykryć próbkę.
Inkubować przez 5 (±1) minut.
Przemyć wodą destylowaną lub dejonizowaną.
ETAP 8
WYKONAĆ BARWIENIE KONTRASTOWE I ZATAPIANIE
Tabela programowania aparatu Dako Autostainer na potrzeby systemu CSA II
PowyŜsza tabela programowania to szablon protokołu Dako zawierający elementy niezbędne do wykonania
procedury CSA II. W przykładzie tym uwzględniono zalecane odczynniki i czasy inkubacji pozwalające na
optymalne wykonanie serii odczynów CSA II w aparatach Autostainer (nr kat. S3004) i Autostainer Plus (nr kat.
S3800).
NaleŜy przygotować szablon protokołu i konfigurację programowania obejmującą te zalecane etapy i czasy
inkubacji. W przykładzie uwzględniono przeciwciało pierwotne i obróbkę wstępną. Zastosowanie środka do
odmaskowania antygenu jest konieczne tylko w przypadku niektórych przeciwciał.
(127882-001)
P04037PL_01/K1497/2015.07 s. 6/10
Kontrola jakości
RóŜnice w metodach obróbki tkanek i procedurach technicznych stosowanych w laboratorium UŜytkownika
mogą powodować istotne róŜnice wyników, wymagające regularnego wykonywania wewnętrznej kontroli
jakości. Dodatkowe informacje na temat kontroli jakości zawierają pozycje literaturowe nr 16–18.
Tkanka do dodatniej próby kontrolnej
Do monitorowania wyników badanych tkanek oraz działania odczynników naleŜy w charakterze kontroli
dodatniej stosować tkanki dające potwierdzony odczyn dodatni. JeŜeli nie udaje się potwierdzić dodatniego
odczynu w preparatach dodatnich kontroli tkankowych naleŜy uznać, Ŝe wyniki preparatów testowych są
niewaŜne.
Odczynnik do kontroli ujemnej
W celu oceny występowania odczynu nieswoistego i ułatwienia interpretacji swoistego odczynu w miejscach
występowania antygenów w miejsce przeciwciał pierwotnych naleŜy stosować odczynnik do kontroli ujemnej.
Jeśli do skrawków seryjnych uŜywane są panele przeciwciał, obszary jednego szkiełka dające odczyn ujemny
mogą słuŜyć jako kontrola ujemna/wiązania nieswoistego dla innych przeciwciał.
Dalsze informacje na temat kontroli dodatnich i ujemnych przedstawiono w dokumencie „General Instructions
for Immunohistochemical Staining” (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych).
Interpretacja odczynu
W pierwszej kolejności naleŜy zbadać próbki kontroli dodatniej, aby upewnić się, Ŝe wszystkie odczynniki
działają prawidłowo. Obecność produktu końcowego o zabarwieniu brązowym w miejscu występowania
antygenu docelowego wskazuje na reaktywność dodatnią. JeŜeli nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu
w preparatach kontroli dodatnich naleŜy uznać, Ŝe wyniki preparatów testowych są niewaŜne.
NaleŜy zbadać próbki kontroli ujemnej w celu zweryfikowania swoistego znakowania antygenu docelowego
przez przeciwciało pierwotne. Brak swoistego odczynu w próbkach kontroli ujemnej potwierdzi swoistość
przeciwciała pierwotnego uŜywanego w badaniu. Ewentualny odczyn nieswoisty będzie miał postać kropek lub
rozlanego zabarwienia. Wysoka czułość tego systemu wynika z jego wysokiego poziomu amplifikacji;
amplifikacji ulegną jednak równieŜ wszelkie nieswoiste odczyny tła. Dlatego zaleca się uŜycie odczynników do
kontroli ujemnej z kontrolnymi i badanymi próbkami, co pomoŜe w interpretacji właściwego odczynu (bardziej
szczegółowe omówienie odczynów nieswoistych zamieszczono w punkcie Ograniczenia).
W preparatach tkanek poddawanych nadmiernemu utrwalaniu w formalinie moŜe niekiedy występować odczyn
w obrębie tkanki łącznej. Interpretację odczynu naleŜy prowadzić w oparciu o komórki nieuszkodzone Komórki
zmienione martwiczo lub uszkodzone często wykazują nieswoisty odczyn. Wiązanie odczynników w skrawkach
tkankowych na drodze mechanizmów innych niŜ immunologiczne moŜe być przyczyną wyników fałszywie
dodatnich.
Ograniczenia metody
Aby uzyskać optymalne nasilenie odczynu, naleŜy chronić szkiełka przed światłem podczas inkubacji
z odczynnikiem amplifikującym (Etap 5).
Trawienie proteolityczne moŜe w CSA II System wywołać silny odczyn tła i dlatego nie jest zalecane.
W celu ograniczenia nieswoistego odczynu tła zaleca się, by przed kaŜdym etapem protokołu CSA II System
płukać próbki roztworem płuczącym (zob. Przygotowanie odczynników) i inkubować przez pięć minut
w temperaturze pokojowej w maksymalnie trzech świeŜych kąpielach buforu płuczącego.
Endogenna immunoglobulina obecna w ludzkich próbkach tkankowych moŜe wykazywać róŜne poziomy
reaktywności krzyŜowej z wtórnymi przeciwciałami przeciwko immunoglobulinie. Stosowane w tym systemie
wtórne przeciwciała skierowane przeciwko immunoglobulinie mysiej skoniugowane z HRP zostały poddane
absorpcji w surowicy ludzkiej w celu ograniczenia reaktywności krzyŜowej. Jednak z uwagi na duŜą czułość
tego systemu w niektórych próbkach nadal moŜe być wykrywana reaktywność krzyŜowa z immunoglobuliną
endogenną. Odczyn tła pochodzący od immunoglobuliny endogennej jest najlepiej rozpoznawalny jako
barwienie kontroli ujemnej wokół naczyń krwionośnych i limfatycznych, w tkance łącznej i w pozanaczyniowych
przestrzeniach tkankowych. Niektóre typy nabłonka, zwłaszcza w układzie trawiennym, równieŜ mogą zawierać
immunoglobulinę endogenną. Odczyn pochodzący od immunoglobuliny endogennej moŜe być wzmacniany
przez niektóre metody odmaskowywania antygenów. Dlatego w sytuacjach, w których podejrzewa się
występowanie immunoglobuliny endogennej, do prawidłowej interpretacji wyników dodatnich niezbędne jest
zastosowanie odpowiednich odczynników i tkanek kontroli ujemnej.
Endogenna aktywność peroksydazy lub o podobnym charakterze moŜe występować w hemoproteinach – np.
hemoglobinie, mioglobinie, cytochromach i katalazie – oraz w niektórych leukocytach.19,20 Tego rodzaju
aktywność moŜna wyeliminować, przed zastosowaniem przeciwciał pierwotnych przez 5 minut inkubując próbki
z odczynnikiem blokującym aktywność peroksydazy (Etap 1 protokołu CSA II) System.
Tkanki zawierające antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HbsAg) mogą dawać odczyn
nieswoisty z peroksydazą chrzanową.21
(127882-001)
P04037PL_01/K1497/2015.07 s. 7/10
Rozwiązywanie
problemów —
procedura
zautomatyzowana
Problem
1. Brak barwienia
preparatów.
2. Słabe barwienie
preparatów.
3. Nadmierne
barwienie tła
w preparatach.
Prawdopodobna przyczyna
1a. Błąd programowania.
Odczynniki nie są uŜywane we
właściwej kolejności.
1b. Fiolki z odczynnikami nie zostały
wprowadzone we właściwe
połoŜenia w statywach
odczynników.
1c. Niedostateczna ilość
odczynników w fiolce.
1d. Azydek sodu obecny w kąpieli z
buforem.
2a. Preparaty nie są inkubowane
wystarczająco długo z
przeciwciałami lub substratem.
2b. Badany antygen wymaga
odmaskowania.
2c. Próbki były wystawione na
działanie światła podczas
inkubacji z odczynnikiem
amplifikującym.
2d. Za niskie stęŜenie przeciwciał.
3a. Próbki o duŜym stęŜeniu
endogennej immunoglobuliny.
3b. W próbkach występuje duŜa
aktywność endogennej
peroksydazy.
3c. Niecałkowicie usunięta parafina.
3d. Preparaty nie są odpowiednio
przemywane.
3e. Wysychanie skrawków podczas
wykonywania odczynu.
3f. Dochodzi do wysuszenia
szkiełek podczas wkładania do
aparatu Dako Autostainer.
3g. Nieswoiste wiązanie odczynników
do skrawka tkanki.
3h. Nieswoiste wiązanie przeciwciał
pierwotnych z próbką.
4. Tkanka oddziela
się od szkiełka.
(127882-001)
3i. Do termicznego odmaskowania
antygenu przed barwieniem
uŜyto roztworu o wysokim pH.
3j. Przed wykonaniem odczynu
przeprowadzono trawienie
proteolityczne.
4a. Zastosowano niewłaściwe
szkiełka mikroskopowe.
Zalecane postępowanie
1a. Sprawdzić sposób uŜycia odczynników.
1b. Sprawdzić mapę odczynników –
zweryfikować odpowiednie połoŜenie
fiolek z odczynnikami.
1c. Przed rozpoczęciem serii, naleŜy
dopilnować, by w fiolce znajdowała się
odpowiednia ilość odczynników.
Wymagane objętości przedstawiono
w Mapie odczynników.
1d. UŜyć świeŜego buforu niezawierającego
azydku.
2a. Sprawdzić zalecany czas inkubacji.
2b. Przeprowadzić odmaskowanie antygenów.
2c. Chronić próbki przed światłem podczas
inkubacji z odczynnikiem amplifikującym.
2d. Powtórzyć miareczkowanie roztworu
przeciwciał.
3a. Porównać badaną tkankę z tkanką do
kontroli ujemnej w celu określenia róŜnic.
3b. WydłuŜyć czas inkubacji z nadtlenkiem
wodoru (Etap 1).
3c. Zastosować świeŜą kąpiel z ksylenu lub
toluenu. W przypadku jednoczesnego
wykonywania odczynu kilku preparatów,
druga kąpiel z ksylenu powinna zawierać
świeŜy ksylen.
3d. Dopilnować, by aparat Dako Autostainer
został odpowiednio przygotowany do serii.
Dopilnować, aby dostępna była
wystarczająca ilość buforu, wystarczająca na
przeprowadzenie całej serii. Uwzględnić
pomocnicze płukania roztworem TBST
(nr kat. S3306) zgodnie z instrukcją.
3e. Dopilnować, by na szkiełka były nanoszone
odpowiednie objętości odczynnika. NaleŜy
dopilnować, by podczas pracy aparatu
Dako Autostainer, pokrywa była zamknięta,
a aparat nie był naraŜony na działanie
nadmiernie wysokich temperatur lub
przeciągów.
3f. NaleŜy dopilnować, by szkiełka pozostały
zwilŜone buforem podczas wkładania do
aparatu i przed rozpoczęciem badania serii.
3g. WydłuŜyć czas inkubacji z odczynnikiem
blokującym peroksydazę (Etap 2).
3h. Rozcieńczyć przeciwciała pierwotne
w roztworze zawierającym białko
nośnikowe. Zalecany jest roztwór
Antibody Diluent with Background
Reducing Components (nr kat. S3022).
3i. Do odmaskowania uŜyć
zmodyfikowanego buforu cytrynianowego
(pH 6,1).
3j. Unikać trawienia proteolitycznego próbek
badanych tym systemem.
4a. Stosować szkiełka elektrostatyczne
(SuperFrost Plus) lub silanilizowane,
Dako Silanized Slides
(nr kat. S3003).
P04037PL_01/K1497/2015.07 s. 8/10
Rozwiązywanie
problemów —
procedura ręczna
Problem
1. Brak barwienia
preparatów.
2. Słabe barwienie
preparatów.
3. Nadmierne
barwienie tła
w preparatach.
Prawdopodobna przyczyna
1a. Odczynniki nie są uŜywane we
właściwej kolejności.
1b. Azydek sodu obecny w kąpieli z
buforem.
2a. Skrawki zawierają zbyt duŜo
roztworu po kąpieli płuczącej.
2b. Preparaty nie są inkubowane
wystarczająco długo z
przeciwciałami lub substratem.
2c. Badany antygen wymaga
odmaskowania.
2d. Próbki były wystawione na
działanie światła podczas
inkubacji z odczynnikiem
amplifikującym.
2e. Za niskie stęŜenie przeciwciał.
3a. Próbki o duŜym stęŜeniu
endogennej immunoglobuliny.
3b. W próbkach występuje duŜa
aktywność endogennej
peroksydazy.
3c. Niecałkowicie usunięta parafina.
3d. Preparaty nie są odpowiednio
przemywane.
3e. Szybsza niŜ zwykle reakcja
substratu-chromogenu ze
względu na nadmierną
temperaturę w pomieszczeniu.
3f. Wysychanie skrawków podczas
wykonywania odczynu.
3g. Nieswoiste wiązanie
odczynników do skrawka tkanki.
3h. Nieswoiste wiązanie przeciwciał
pierwotnych z próbką.
4. Tkanka oddziela
się od szkiełka.
5. Nasilenie odczynu
zmienne
pomiędzy seriami.
3i. Do termicznego odmaskowania
antygenu przed barwieniem
uŜyto roztworu o wysokim pH.
3j. Przed wykonaniem odczynu
przeprowadzono trawienie
proteolityczne.
4a. Zastosowano niewłaściwe
szkiełka mikroskopowe.
5a. Zmiany temperatury
w pomieszczeniu.
Zalecane postępowanie
1a. Sprawdzić sposób uŜycia odczynników.
1b. UŜyć świeŜego buforu niezawierającego
azydku.
2a. OstroŜnie usunąć nadmiar roztworu przed
wytarciem szkiełka.
2b. Sprawdzić zalecany czas inkubacji.
2c. Przeprowadzić odmaskowanie antygenów.
2d. Chronić próbki przed światłem podczas
inkubacji z odczynnikiem amplifikującym.
2e. Powtórzyć miareczkowanie roztworu
przeciwciał.
3a. Porównać badaną tkankę z tkanką do
kontroli ujemnej w celu określenia róŜnic.
3b. WydłuŜyć czas inkubacji z nadtlenkiem
wodoru (Etap 1).
3c. Zastosować świeŜą kąpiel z ksylenu lub
toluenu. W przypadku jednoczesnego
wykonywania odczynu kilku preparatów,
druga kąpiel z ksylenu powinna zawierać
świeŜy ksylen.
3d. Zastosować świeŜe roztwory w kąpielach
z buforem i butelkach z roztworem
płuczącym. Zalecany jest roztwór TBST.
Przed kaŜdym etapem protokołu inkubować
skrawki przez 3–5 minut w maksymalnie
trzech kąpielach ze świeŜego TBST.
3e. Stosować krótszy czas inkubacji
w roztworze barwiącym chromogensubstrat.
3f. Stosować komorę nawilŜającą. Wycierać
tylko trzy do czterech szkiełek w czasie
pomiędzy nanoszeniem odczynnika.
3g. WydłuŜyć czas inkubacji z odczynnikiem
blokującym peroksydazę (Etap 2).
3h. Rozcieńczyć przeciwciała pierwotne
w roztworze zawierającym białko
stabilizujące. Zalecany jest roztwór
Antibody Diluent with Background
Reducing Components (nr kat. S3022).
3i. Do odmaskowania uŜyć zmodyfikowanego
buforu cytrynianowego (pH 6,1).
3j. Unikać trawienia proteolitycznego próbek
badanych tym systemem.
4a. Stosować szkiełka elektrostatyczne
(SuperFrost Plus) lub silanilizowane, Dako
Silanized Slides
(nr kat. S3003).
5a. Ograniczyć zakres zmian temperatury
w pomieszczeniu.
5b. Nieznaczne róŜnice w czasie
5b. Stosować zawsze takie same czasy
inkubacji z odczynnikami.
inkubacji.
5c. RóŜne liczby i czasy inkubacji
5c. W kaŜdej serii postępować dokładnie
kąpieli w buforze płuczącym.
w takiego samego protokołu.
UWAGA: NaleŜy zapoznać się z rozdziałem dot. rozwiązywania problemów w podręczniku Handbook
Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition,14 Atlas of Immunohistology21 lub Immunoperoxidase
Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis.23 W razie stwierdzenia niezwykłego odczynu naleŜy
skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
(127882-001)
P04037PL_01/K1497/2015.07 s. 9/10
Piśmiennictwo
1. Bobrow MN, Harris TD, Shaughnessy KJ, Litt GJ. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal
amplification. Application to immunoassays. J Immunol Methods 1989; 125:279
2. Bobrow MN, Shaughnessy KJ, Litt GJ. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal
amplification. II. Application to membrane immunoassays. J Immunol Methods 1991; 137:103
3. Van Gijlswijk RPM, Zijlmans HJMAA, Wiegant J, Bobrow MN, Erickson TJ, Adler KE, Tanke HJ, Raap AK.
Fluorochrome-labeled tyramides: use in immunocytochemistry and fluorescence in situ hybridization.
J Histochem Cytochem 1997; 45(3):375
4. Von Wasielewski R, Mengel M, Gignac S, Wilkens L, Werner M, Georgii A. Tyramine amplification
technique in routine immunohistochemistry. J Histochem Cytochem 1997; 45(11):1455
5. Bobrow MN, Litt GJ, Shaughnessy KJ, Mayer PC, Conlon J. The use of catalyzed reporter deposition as a
means of signal amplification in a variety of formats. J Immunol Methods 1992; 150:145
6. Wood GS and Warnke R. Suppression of endogenous avidin-biotin activity in tissues and its relevance to
biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981; 29(10):1196
7. Banerjee D and Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984;
37:223
8. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health,
Rockville, MD. “Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead
azides”. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976
9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of laboratory workers from instrument
biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids and tissue; approved guideline.
Villanova, PA. 1997; Order Code M29-A
10. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press
1981; 81
11. Boenisch T. In: Naish SJ, ed. Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989
12. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase: I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983; 14:767
13. Banks PM. Diagnostic applications of an immunoperoxidase method in hematopathology. J Histochem
Cytochem 1979; 27:1192
14. Culling CFA, Reid PE, Sinnott NM. The effect of various fixatives and trypsin digestion upon the staining of
routine paraffin-embedded sections by the peroxidase-antiperoxidase and immunofluorescent technique.
J Histotech 1980; 3:10
15. Carson FL (ed). Histotechnology: A self-instructional text. Chicago: ASCP Press 1990:22
16. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special
report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836
17. National Committee for Clinical Laboratory Standard. Internal quality control testing: principles and
definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4
18. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech
& Histochem 1991; 66:194
19. Escribano LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and
adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213
20. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press
1990; 46
21. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to
hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980;
73:626
22. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press
1986
23. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis.
Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986
24. Centers for Disease Control Manual Guide – Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA.
“Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts”. April 30, 1976
Edition 07/15
(127882-001)
P04037PL_01/K1497/2015.07 s. 10/10