(W JĘZYKU POLSKIM)

Pseudomonas jest bardzo groźnym patogenem, który może dostosowywać się do różnych środowisk, przez co łatwo prowadzi do
zakażeń systemów wodnych, gleby, tkanek roślinnych i zwierzęcych. Bakteria ta posiada pełną paletę czynników wirulencji, które
prowadzą do niszczenia tkanek i negatywnie wpływają na funkcjonowanie naszego układu odpornościowego. Jej bardzo ważną
cechą jest zdolność do produkcji specyficznej substancji, zwanej egzopolisacharydem (EPS), która ją otacza i stanowi grubą
warstwę ochronną, zwaną biofilmem.
Bakteriofagi są naturalnymi wirusami oraz wrogami bakterii. Przez 3 miliardy lat ulegały one modyfikacjom i dostosowywały się
do zmian zachodzących w bakteriach, których potrzebują do namnażania nowych pokoleń wirusów. Dzięki temu wytworzyły
bardzo efektywne enzymy, zwane depolimerazami EPS, które pozwalają im na zniszczenie ochronnej warstwy bakterii (biofilmu).
W prezentowanym projekcie, przez zastosowanie modyfikacji genetycznej, mamy zamiar podjąć próby ulepszenia fagowych
depolimerazy EPS tak, aby niszczyły możliwie jak największą liczbę różnorodnych biofilmów, formowanych przez bakterie
Pseudomonas aeruginosa i Pseudomonas putida. Na potrzeby tego projektu, zostały zidentyfikowane i wyizolowane 4 różne
domeny depolimeraz EPS o różnej aktywności które stanowią podstawę do realizacji tego projektu.
W przyrodzie struktura i sekwencja poszczególnych białek ulega zmianom poprzez zastosowanie doboru naturalnego. Korzystne
cechy, niezbędne do przeżycia, są kumulowane i przyswajane na wielu etapach ewolucji, natomiast cechy negatywne usunięte lub
stłumione. Te same metody mogą zostać przeniesione do laboratorium w celu modyfikacji naturalnych białek i utworzenia ich
nowych, zoptymalizowanych wariatów.
Naturalnie bakteriofagi posiadają depolimerazy EPS o wąskim spektrum działania, degradując głównie EPS szczepu, w którym
bakteriofag się namnaża. Naszym celem, jest wykorzystanie możliwości ewolucji w skali laboratoryjnej i „rozluźnienie” tej
naturalnej specyficzności. Pozwoli to stworzyć depolimerazy EPS o szerszym spektrum działania w stosunku do formy naturalnej.
Wybrane aktywne enzymatycznie fragmenty depolimeraz EPS, zwane ich domenami, zostaną połączone ze sobą i wprowadzone
do wektora ekspresyjnego z sygnałem sekrecyjnym. Powstały konstrukt zostanie następnie wprowadzony do bakteryjnych
komórek kompetentnych, które posłużą nam za „fabryki do produkcji białek”. Poprzez indukcję całego systemu, uzyskamy
pożądane białko, które zostanie wydzielone na zewnątrz bakterii. Uzyskane enzymy zostaną następnie oczyszczone i zostanie
określona ich zdolność do degradacji biofilmu. Ostatecznie depolimeraza EPS o najszerszym spektrum działania oraz mieszanina
wszystkich uzyskanych aktywnych enzymów zostanie poddana szczegółowym testom degradacji biofilmu przy użyciu
skaningowego laserowego mikroskopu konfokalnego.
Dostępna wiedza na temat depolimeraz EPS jest ograniczona głównie do bakteriofagów atakujących bakterie Escherichia coli.
Charakterystyka tych enzymów może poszerzyć wiedzę na temat ich aktywności, stabilności, modelu działa oraz cyklu
infekcyjnego bakteriofagów litycznych.