BR TEST

„BIOCHEM-ART”; ul. Elfów 75, 80-180 Gdańsk
tel./fax (0-58) 304-80-77
BR TEST brillant
test do wykrywania obecności antybiotyków,
sulfonamidów i dapsonu oraz przeciwbakteryjnych
dodatków do pasz w mleku
Wprowadzenie
Pozostałości leków w mleku wpływają niekorzystnie na zdrowie konsumentów oraz uniemożliwiają przetwórstwo
mleka na artykuły fermentowane i sery. Nawet w przypadku stosowania leków, dla których nie określa się okresu
karencji, stwierdza się ich pozostałości w mleku. Natomiast w przypadku leków, dla których określa się okres karencji
stwierdzono, że często, nawet przy zachowaniu tego okresu, pozostałości tych leków występują jeszcze w mleku. Z tego
względu badanie pozostałości substancji hamujących w mleku jest niezbędne.
BR-Test jest testem stosowanym powszechnie na świecie w przetwórstwie mleka, w zakładach mleczarskich oraz w
weterynaryjnych i sanitarnych laboratoriach kontrolnych.
Materiały i sprzęt niezbędne do wykonania testu - nie ujęte w zestawie




zamykana łaźnia wodna bez mieszania lub termostat dla probówek i testów płytkowych
mikropipeta o oznaczonej pojemności 0.1ml
końcówki mikropipet
standard penicyliny i sulfonamidu
Asortyment BR-Testu


BR-Test płytkowy: płytka z 96 studzienkami, niepodzielna
BR-Test płytkowy: płytka z 96 studzienkami, podzielona na 12 pasków po 8 studzienek każdy
Standardy
Przy wykonywaniu badań niezbędne jest posiadanie negatywnego standardu mleka surowego sprawdzonego
BR-Testem. Standard ten powinien być zamrożony w małych porcjach, np. 3ml, i rozmrażany w dniu wykonywania
testu. Przy wykonywaniu badań mleka odtłuszczonego negatywny standard powinien także być przygotowany z mleka
odtłuszczonego. Zasady badania mleka odtłuszczonego zostaną podane w dalszej części instrukcji.
Liofilizowane pozytywne standardy (antybiotyków i sulfonamidów) mają 1-roczny okres trwałości w warunkach
chłodniczych. Po rozmrożeniu, obydwa standardy powinny być przechowywane w temperaturze 5oC.
Stężenie penicyliny i sulfonamidów w testach pozytywnych dostosowane jest do przepisów określających ich
maksymalną dopuszczalną zawartość w produktach. Standard penicyliny stosowany w tym teście zawiera 0.004 mg
penicyliny G Na/ml mleka, natomiast standard sulfonamidu zawiera 0.500 mg sulfamidyny Na/ml mleka.
Przechowywanie
Płytki BR-Testu i części tych płytek (paski po 8 studzienek)
Testy te mogą być przechowywane przez 10 tygodni w temperaturze 4-6oC. Data produkcji płytek podana jest na folii
pokrywającej je. Test powinien być przechowywany w folii aluminiowej, w którą jest zapakowany w celu uniknięcia
kondensacji pary wodnej na folii przykrywającej; niedopuszczalne jest odwracanie testu do góry nogami.
Wykonanie testu




Odmierzyć 0.1ml mleka do studzienek na płytce z BR-Testem.
Przygotować próbki kontrolne - "negatywną" i "pozytywną".
Inkubować próbki w łaźni wodnej w temp. 64-65oC.
Czas redukcji (inkubacji) wynosi :1,5-2,0 godz.
Strona 1 z 4
„BIOCHEM-ART”; ul. Elfów 75, 80-180 Gdańsk
tel./fax (0-58) 304-80-77
Odczyt wyników
Obecność substancji hamujących określa się wzrokowo przez obserwację zmiany barwy zawartości studzienek.
 W przypadku występowania w badanej próbce substancji hamujących barwa żelu po inkubacji nie zmienia się i
pozostaje granatowo-niebieska.
 W przypadku, gdy substancje hamujące nie występują, barwa żelu w studzience po inkubacji zmienia się z
niebieskiej na żółtą.
Uwagi do wykonywania testu











Próbki mleka powinny być odmierzane przy pomocy pipet automatycznych z wymienną końcówką. Końcówka ta
musi być nowa dla każdej nowej próbki mleka.
Jako standard dodatni (pozytywny) winny być używane standardy penicyliny i/lub sulfonamidów. Jako standard
ujemny (negatywny) użyć próbek mleka wolnych od pozostałości substancji hamujących.
Płytki lub paski testu płytkowego muszą być uszczelnione samoprzylepną folią, którą należy docisnąć do
studzienek.
Inkubację należy prowadzić w zamkniętej łaźni wodnej, bez mieszania, w temperaturze 64-65oC. W czasie
inkubacji płytki testu powinny pływać na powierzchni wody częścią oklejoną do góry. Nie zaleca się inkubować
testu w cieplarkach-inkubatorach mikrobiologicznych!!!
Wahania temperatury inkubacji w stosunku do optymalnej (64-65oC) prowadzić będą do przedłużenia czasu
redukcji (inkubacji). Z tego względu uznaje się inkubację za zakończoną w tym przypadku, gdy w kontrolnej
próbce negatywnej nastąpiła już zmiana barwy z niebieskiej na żółtą. Wylanie mleka z studzienek ułatwia odczyt
zmiany barwy.
Należy zwrócić uwagę, że testy BR-Test "AS" reagują tylko z mlekiem. Oznacza to, że w testach do których nie
dodano próbek mleka nie będzie miała miejsca zmiana barwy.
Test można także wykonywać na próbkach mleka konserwowanego substancjami konserwującymi. W tym
przypadku próbki kontrolne pozytywną i negatywną trzeba takżę przygotowywać z mlekiem konserwowanym.
Czas redukcji barwy w mleku konserwowanym będzie istotnie dłuższy.
Należy zwrócić uwagę na fakt, że pH próbki poniżej 6.00 może prowadzić do wystąpienia pozytywnego wyniku
BR-Testu. Z tego względu należy badać pH mleka w przypadku każdej próbki pozytywnej. Próbki mleka o pH
~6.0 powinny być zneutralizowane roztworem wodorotlenku sodowego i zbadane ponownie.
Intensywność barwy w próbkach pozytywnych nie jest wskaźnikiem ilościowym substancji hamującej. Dla
przykładu, intensywność barwy próbki zawierającej 800 nanogramów neomycyny może być taka sama jak barwa
próbki zawierającej 4 nanogramy penicyliny.
Należy podkreślić, że negatywne wyniki testów nie są gwarancją idealnej produkcji artykułów mleczarskich.
Kłopoty związane z kwasowością lub inne problemy w procesie produkcji mogą spowodować trudności w
przetwórstwie absolutnie nie związane z pozostałością substancji hamujących.
BR-Test "AS" może być także używany do badania mleka kobiecego, mleka owiec, kóz i klaczy, a także do
badania pozostałości substancji hamujących w artykułach mleczarskich jak : mleko odtłuszczone, mleko w proszku
oraz fermentowane produkty mleczarskie.
Wykonywanie prób na mleku odtłuszczonym
Organizm testowy Bacillus stearothermophilus jest mikroorganizmem lipo- i termofilnym. Z próbki mleka dyfundują do
żelu agarowego nie tylko substancje hamujące, ale także składniki odżywcze. Ze względu na brak tłuszczu czas redukcji
testu może przedłużyć się - w przypadku testu "AS" o około 45 minut.
Z powyższych względów mleko odtłuszczone o sprawdzonej nieobecności substancji hamujących powinno być użyte
jako standard negatywny.
Mleko w proszku
Mleko w proszku należy rozpuszczać w wodzie destylowanej w proporcji 1:10. Dla zwiększenia czułości próbki mogą
być rozpuszczone w proporcji 1:5. Objętość próbki mleka poddanej analizie w obu przypadkach wynosi 0.1ml.
Mleko klaczy
Peroksydaza obecna w mleku klaczy hamuje rozwój organizmu testowego BR-Testu. Z tego względu mleko to należy
rozcieńczać wodą destylowaną w proporcji 1:1 i dopiero 0.1ml tego roztworu powinno być badane BR-Testem "AS".
Czas redukcji wynosi16-17 godzin w temperaturze 64-65oC. W tym przypadku należy także przygotować próbkę
kontrolną dodatnią. Przygotowuje się ją poprzez dodanie do ampułki z testem BR-Test "AS" rocieńczonego mleka
klaczy (jak wyżej) oraz penicyliny w ilości 0.01 j.m.
Strona 2 z 4
„BIOCHEM-ART”; ul. Elfów 75, 80-180 Gdańsk
tel./fax (0-58) 304-80-77
Fermentowane produkty mleczarskie
Produkty te są neutralizowane w moździerzu lub parownicy za pomocą 1 N wodorotlkenku sodu i wirowane z
prędkością 5000-6000 obr./min. Testem BR-Test "AS" bada się 0.1ml ciekłej fazy produktu.
Literatura
1. American Veterinary Madical Ass./National Milk
Producers Federation Dairy Producer. 10 Point
Quality Assurance Pharmaceutical (Drug) Control
Check List and Proper Drug Use Guidelines (1990)
2. Amtliche Sammlung von Untersuchungs-verfahren
nach §35 LMBG, L01.00-11, Routineverfahren mit
dem Briliiantschwarz-Reduktionstest (1989)
3. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,
Volume 2, p.1135 (1986)
4. Brunn, H.J.Inaugural-Dissertation, Justus-Liebig
Universität Gießen (1971)
5. Ebrecht, A., Deutsche Milchwirtschaft 14, p.416
(1986)
6. Ellinghaus,
A.,
EoroResidue
Conference
Noordwijkerhout, Netherland, Proceedings 166-170
(1990)
7. Ellinghaus, U., persönliche Mitteilung (1990)
8. Guay, R., Cardinal, P., Bourassa, C., Brassard, N.,
Int. Journal of Food Micro-biology 4, 187-196
(1987)
11. Kraak, J., Tolle, A., Milchwissenschaft 22,
669-673 (1967)
12. Mergl, M., Kratochvil, L., Benesova, M.,
Vetrinasstvi 37, 9, 399-401 (1987)
13. Müller, F.J., Deutsche Milchwirtschaft, Beilage
"Das Lebensmittellabor", 4 (1973)
14. Müller, F.J. et al., Deutsche Molkerei-zeitung, 42
(1988)
15. Müller, F.J. et al., Deutsche Molkerei-zeitung, 15
(1990)
16. Obiger, G., Archiv für Lebensmittel-hygiene, 21,
209-217 (1970)
17. Routineverfahren
zur
Untersuchung
der
Anlieferungsmilch (§2(5) der Milch-Güte-VO v. 21.
Juli (1988)
18. Schraudy, E., Rauscher, W., Archiv
Lebensmittelhygiene, 23, 118-121 (1972)
19. Suhren,
G.,
Heeschen,
W.,
Milchwirtschaft, 48, 1632-1636 (1989).
9. Heilmeyer, L., Walter, A.M., Antibiotika Fibel,
Georg Thieme Verlag Stuttgart (1975)
10. Klima, H., Archiv für Lebensmittel-hygiene,
Mai/Juni, p.111 (1980)
Strona 3 z 4
für
Deutsche
„BIOCHEM-ART”; ul. Elfów 75, 80-180 Gdańsk
tel./fax (0-58) 304-80-77
Granice wykrywalności testu BR-Test dla poszczególnych substancji hamujących
Substancja hamująca
Minimalne wykrywane stężenie
(mg/ml)
Penicylina G Na (j.m.)
Ampicylina
Amoksycylina
Cloksacylina
Tetracyklina HCL
Oksytetracyklina
Chlorotetracyklina
Rolitetracyklina
Neomycyna
Gentamycyna
Apramycyna
Erytromycyna
Tylozyna
Oleandomycyna
Spiramycyna
Monensyna
Flavomycyna
Virginiamycyna
Salinomycyna
Linkomycyna
Avoparcyna
Bacytracyna
Novoblocyna
Nitrovina
Furazolidon
Tiamulin
Carbadox
Entrofloksacyna
Sulfadimidyna Na (Sulfametazyna)
Sulfatiazol
Sulfadiazyna
Sulfametiazol
Sulfafenazol
Sulfacetamidyna
Sulfadoksyna
Sulfaguanidyna
Sulfon (Dapson)
Polimycyna B
Sulfapyrydyna
Succinylsulfatiazol
Ftalylsulfatiazol
Sulfametoksypyrydazyna
Sulfadimetoksyna
Sulfamerazyna
Sulfachloropyrydazyna
Sulfametoksazol
Sulfaquinoksalina
0.003
0.0015
0.0015
0.035
0.200-0.250
0.200-0.300
0.200
0.250
0.250
0.400
4.500
0.030-0.040
0.020
3.000
2.500
0.200
0.100-0.200
0.120-0.150
0.075
0.200
2.500
0.150
0.300
0.100
1.500-2.500
0.500
4.000
2.250
0.100-0.500
0.005-0.009
0.010-0.015
0.080
0.010
0.175
0.030
0.200
0.002-0.003
16.000
0.050
1.500
0.3000
0.015
0.007
0.010
0.007
< 0.008
0.015
Strona 4 z 4