pobierz

Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 2, str. 313–319
PRACA POGLĄDOWA – Review Article
OLGA HAUS1,2, EWA DUSZEŃKO2, ANNA JAŚKOWIEC2,
KATARZYNA SKONIECZKA1
Amplifikacja genów w nowotworach układu krwiotwórczego
Gene amplification in hematological malignancies
1
Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. O. Haus
2
Katedra i Klinika Hematologii, Nowotworów Krwi i Transplantacji Szpiku AM we Wrocławiu
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. K. Kuliczkowski
STRESZCZENIE
Zwiększenie liczby kopii genów jest w nowotworach układu krwiotwórczego zjawiskiem rzadkim (1–10%), w porównaniu z jego częstością w nowotworach narządowych (kilkadziesiąt %).
MoŜe być ono zwiększeniem niewielkiego stopnia, ≤4 kopie genu, co wynika najczęściej z polisomii chromosomów, albo zwielokrotnieniem (amplifikacją), ≥5 kopii. Obecność ≥20 kopii genu
to amplifikacja wysokiego stopnia. Amplifikacje genów w białaczkach dotyczą najczęściej onkogenów, genów biorących udział w regulacji cyklu komórkowego, genów oporności na cytostatyki. Cytogenetyczną manifestacją amplifikacji wysokiego stopnia są regiony barwiące się homogennie (HSR) oraz podwójne malutkie chromosomy (DMs), jednak w białaczkach amplifikacje genów najczęściej występują w obrębie zmienionych strukturalnie chromosomów – np. olbrzymich markerów lub chromosomów pierścieniowych. Amplifikacja genów MLL i AML1 w
ostrej białaczce szpikowej, niezaleŜnie od zaangaŜowania róŜnych genów, ma podobny obraz cytogenetyczny (złoŜony kariotyp, utraty ramion długich chromosomów 5 i 7, utrata jednej kopii
TP53) i kliniczny (starszy wiek chorych, często poprzedzająca białaczkę terapia lekami alkilującymi, oporność na leczenie, złe rokowanie).
SŁOWA KLUCZOWE: Amplifikacja genu – MLL – AML1 – C-MYC – Białaczka
SUMMARY
The increase of gene copy number is a rare event in blood malignancies (1-10%) in comparison
with solid tumors (up to 100% cases). An increase may be of low level, 3-4 gene copies, what the
most frequently results from chromosome polysomy. The presence of ≥5 gene copies is called
amplification. This may be of low-medium level (5–20 copies) or high level (≥20). Gene amplifications in leukemia involve the most often oncogenes, cell cycle regulating genes, and cytostatics resistance genes. Cytogenetic manifestation of high level amplification are homogeneously
staining regions (HSR) or double minute chromosomes (DM). However, in leukemias gene amplifications are situated mainly in structurally aberrant chromosomes, e.g. giant marker chromosomes or rings. MLL or AML1 amplification in acute myeloid leukemia (AML), although it involves different genes, has a similar cytogenetic (complex karyotype, losses of long arms of
chromosomes 5 and 7, loss of one copy of TP53), as well as clinical (patients advanced age, frequent therapy with alkylating agents before the onset of AML, resistance to treatment, and poor
prognosis) picture.
KEY WORDS: Gene amplification – MLL – AML1 – C-MYC – Leukemia
314 O. HAUS i wsp.
Badania genetyczne; cytogenetyczne, cytogenetyczno-molekularne (np. FISH)
i molekularne, znalazły w ostatnich latach zasłuŜone miejsce wśród metod diagnostyki
i monitorowania nowotworów układu krwiotwórczego. Świadczy o tym choćby nowy
system klasyfikacji nowotworów hematologicznych WHO, oparty w znacznej mierze
na ocenie genetycznych markerów poszczególnych chorób [1, 2]. Znane markery genetyczne, takie jak translokacja t(9;22) z fuzją genów BCR/ABL, inwersja
inv(16)(p11q22) z rearanŜacją genu CBFB, czy wewnętrzna tandemowa duplikacja
genu FLT3 (FLT3-ITD), i wiele innych, odgrywają rolę nie tylko w diagnostyce i monitorowaniu choroby, lecz równieŜ w ustalaniu rokowania, stanowiąc niezaleŜne czynniki rokownicze [1].
Uwaga genetyków hematoonkologicznych oraz hematologów skupia się głównie
na aberracjach chromosomowych powodujących fuzje lub inne przegrupowania genowe, a ostatnio równieŜ na wewnątrzgenowych rearanŜacjach, z lub bez towarzyszących
im aberracji. Niektóre z tych zmian są charakterystyczne lub nawet specyficzne dla
określonych nowotworów, choć mogą równieŜ występować w nielicznych komórkach
krwi u zupełnie zdrowych ludzi, u których dalsza obserwacja nie wykazuje Ŝadnych
oznak choroby [3]. Obecność ściśle określonych zmian genetycznych w nowotworach
stała się punktem wyjścia poszukiwania „terapii na miarę” – leczenia skierowanego
przeciw tym zmianom lub ich produktom białkowym [1].
Zwiększenie liczby kopii genów nie jest zjawiskiem tak dobrze poznanym w hematoonkologii, jak ww. rearanŜacje. Wynika to z jego rzadkości w nowotworach hematologicznych, w porównaniu z nowotworami narządowymi (np. amplifikacja N-MYC w
neuroblastoma lub EGFR w glejakach) [4]. Jest to jednak zmiana genetyczna warta
zainteresowania ze względu na jej znaczenie rokownicze i moŜliwość zastosowania
leczenia skierowanego przeciw zwielokrotnionym genom.
Zwiększenie liczby kopii genów moŜe być zwiększeniem niewielkim – do czterech
kopii genu albo jego zwielokrotnieniem (amplifikacją), czyli obecnością co najmniej
5 kopii genu albo segmentu DNA. MoŜna takŜe wyróŜnić „amplifikację wysokiego
stopnia”, czyli obecność od 20 do kilkuset kopii genu [4, 5]. Niewielkie zwiększenie
liczby kopii genów, <5, wynika z reguły z liczbowych aberracji chromosomów – poliploidii (zwiększenie liczby kopii wszystkich chromosomów), lub aneuploidii (np.
zwiększenie liczby kopii poszczególnych chromosomów) albo niezrównowaŜonych
translokacji, połączonych z naddatkiem materiału genetycznego. W kaŜdym z tych
przypadków zmiana dotyczy nienaruszonych chromosomów, całych ich ramion albo
większych niŜ 20 Mb regionów chromosomowych. Jeśli do jej powstania niezbędne
jest przerwanie ciągłości nici DNA (jak w translokacjach), zachodzi tylko pojedyncze
złamanie chromosomu.
Natomiast amplifikacja powstaje w wyniku złamań nici DNA na obu końcach amplifikowanego genu/sekwencji DNA (amplikonu) o długości mniejszej niŜ 20Mb, a
następnie wielokrotnej replikacji zawartego między złamaniami odcinka. W obrębie
amplikonów zlokalizowane są z reguły geny, których zwiększona ekspresja przyczynia
się do nasilenia proliferacji komórek nowotworowych, zahamowania ich dojrzewania,
wzmocnienia oporności na leki cytostatyczne, itd. [4, 6]. Genami najczęściej amplifi-
Amplikacja genów w nowotworach
315
kowanymi w białaczkach są: MLL, C-MYC, rzadziej inne onkogeny, ETS1, AML1, gen
oporności wielolekowej MDR, lub inne geny oporności na cytostatyki, w tym geny
enzymów docelowych dla cytostatyków, np. DHFR, oraz geny cyklu komórkowego
[7]. Amplifikacja tych genów występuje zazwyczaj w zaawansowanych stadiach choroby i pociąga za sobą bardziej agresywny jej przebieg, zmniejszenie odsetka uzyskiwanych remisji oraz skrócenie całkowitego czasu przeŜycia chorych.
Amplifikacja genów nie zawsze jednak powoduje ich zwiększoną ekspresję. Nie
wiadomo, jaka jest przyczyna i mechanizm tego zjawiska, a jego związek z fenotypem
choroby jest dopiero w trakcie badań [8].
Cytogenetyczną manifestacją amplifikacji genów mogą być struktury wewnątrzchromosomowe – regiony barwiące się homogennie (homogeneously staining regions=HSR), albo zewnątrzchromosomowe – podwójne malutkie chromosomy (double
minute chromosomes=dmin=DM). Pierwsze z nich są rozdzielane symetrycznie do
komórek potomnych wraz z chromosomami, w obrębie których są zlokalizowane, drugie – jako struktury acentryczne – nie przyłączają się do wrzeciona podziałowego i
w potomnych komórkach występują w nierównych ilościach [4, 5]. Obie ww. struktury
są widoczne w rutynowych preparatach chromosomów, natomiast identyfikacja zwielokrotnionej w ich obrębie sekwencji wymaga zastosowania metod cytogenetyki molekularnej; FISH z sondami dla najczęściej amplifikowanych genów w danym typie nowotworów, porównawczej hybrydyzacji genomowej (comparative genome hybridization=CGH) lub CGH do mikromacierzy (aCGH).
Amplifikacje genowe występują w kilkudziesięciu procentach przypadków nowotworów narządowych i tylko w kilku procentach przypadków nowotworów hematologicznych, nie zawsze będąc widoczne w postaci ww. struktur [4]. DMs znajdowane w
białaczkach, najczęściej w ostrej białaczce szpikowej, AML, zazwyczaj zawierają zamplifikowany onkogen C-MYC [9]. Częstość występowania w AML amplifikacji
ujawniającej się cytogenetycznie wynosi ok. 1% [10].
Stwierdzono, Ŝe amplifikacja określonych genów jest specyficzna dla poszczególnych linii komórkowych, co sprawia, Ŝe moŜe ona, obok specyficznych aberracji chromosomowych, stać się takŜe dobrym, diagnostycznym markerem genetycznym [4].
Na przykład, amplifikacja genu ABL1, powodująca dziesięciokrotny wzrost jego
ekspresji, oraz jego fuzja z NUP214 występuje w jednym z podtypów ostrej białaczki
limfoblastycznej T-komórkowej (T-ALL). W tym przypadku amplifikacja wydaje się
wtórnym wydarzeniem w stosunku do fuzji genu, będąc jednak prawdopodobnie istotniejszą od niej zmianą w rozwoju T-ALL, wpływającą na bardziej agresywny przebieg
choroby i związane z nim niekorzystne rokowanie. Znacznie rzadziej stwierdza się, w
chorobach przebiegających z obecnością chromosomu Ph, amplifikację całej fuzji genowej genu ABL1, np. BCR/ABL, jako mechanizm obronny przed działaniem imatinibu
[4, 8, 11].
Specyficzność amplifikacji określonych genów dla określonych typów ostrych białaczek (AL) daje szansę na zastosowanie w przyszłości leczenia skierowanego przeciw
tym zamplifikowanym genom, jako skutecznej broni przeciw poszczególnym typom
AL.
316 O. HAUS i wsp.
PoniŜej przedstawiono dwa przykłady amplifikacji – genów MLL i AML1, jako
jednych z głównych genów regulujących hematopoezę.
Amplifikacja genu MLL w nowotworach linii mieloidalnej
Amplifikacja regionu 11q23-q25 jest specyficzna dla AML. Głównym genem
w tym amplikonie jest MLL. Jego amplifikacja pociąga za sobą takie same skutki biologiczne (m.in. zahamowanie róŜnicowania komórek, oraz akumulację niedojrzałych
prekursorów), jak jego fuzje z innymi genami. Amplikon 11q23 zawiera często nie
tylko gen MLL, ale i geny go flankujące; np. CCND1, ATM, ETS1. Dodatkowym kopiom MLL często towarzyszy, rozpoznawana na poziomie molekularnym, częściowa
duplikacja tandemowa tego genu (partial tandem duplication = MLL-PTD) [6].
RearanŜacje genu MLL w AML i MDS, to w olbrzymiej przewadze jego fuzje z innymi genami. Nieco rzadziej występują rearanŜacje wewnątrzgenowe (np. MLL-PTD),
a najrzadziej zwielokrotnienie liczby kopii MLL, przy czym amplifikacja wysokiego
stopnia, ponad 20 kopii MLL, jest bardzo rzadkim zjawiskiem [7]. Najczęstszą cytogenetyczną manifestacją amplifikacji MLL są powtórzenia fragmentów chromosomu 11,
typowo o układzie palindromicznym, często zawarte w olbrzymich markerach chromosomowych. Rzadziej występują chromosomy pierścieniowe (ring), jeszcze rzadziej
typowe dla amplifikacji struktury - HSR oraz DMs [10, 12, 13]. Zamplifikowany MLL
z reguły pozostaje w obrębie zmienionych fragmentów chromosomu 11, w odróŜnieniu
od zamplifikowanego C-MYC, który umiejscawia się poza swoim locus [12].
Wspólnymi cechami chorych z AML z amplifikacją MLL jest starszy wiek w chwili ujawnienia się choroby (mediana 67–72 lata), przewaga płci Ŝeńskiej, częste poprzedzające leczenie lekami alkilującymi, zła odpowiedź na leczenie i krótki całkowity
czas przeŜycia (średnio 2–6 miesięcy), złoŜony kariotyp komórek szpiku, z aberracjami
strukturalnymi chromosomu 11 występującymi u prawie 100% chorych i aberracjami
5, obecnymi u 60–80% chorych. W około połowie przypadków występują aberracje
18q, delecja krótkiego ramienia chromosomu 17 z locus TP53, rzadziej utraty materiału długiego ramienia chromosomu 7 [12]. Obraz cytogenetyczny AML z amplifikacją
MLL jest więc typowym obrazem wtórnej AML, mimo, Ŝe w części przypadków ta
białaczka jest chorobą de novo. Wśród chorych z AML z amplifikacją MLL przewaŜa
typ M5, nieco rzadziej występuje M4. Wśród chorych z MDS, najczęstszy jest RAEBT. Zwielokrotnienie liczby kopii MLL zostało uznane w AML za nieprzypadkową,
nawracającą aberrację, o niekorzystnym znaczeniu prognostycznym [5, 6, 10, 12].
Amplifikacja genu AML1 (RUNX1, CBFA) w ostrych białaczkach
Głównymi rearanŜacjami AML1 w białaczkach są fuzje genowe – AML1/ETO,
TEL/AML1, i inne. Wydaje się, Ŝe w AML przewaŜają rearanŜacje [np. translokacja
t(8;21)] i mutacje AML1 zmniejszające jego ekspresję, natomiast w ALL, zwłaszcza
dziecięcej, przewaŜa zwiększenie ekspresji AML1, m.in. na skutek amplifikacji [14,
15].
Amplikacja genów w nowotworach
317
Dodatkowe kopie AML1 są obecne w dziecięcej ALL jako pierwotna zmiana genetyczna, dzięki częstej w tej białaczce polisomii chromosomu 21, występującej wraz z
polisomiami innych chromosomów w obrębie hiperdiploidalnego >50 kariotypu, lub
jako cecha izolowana. Niewielkie zwiększenie liczby kopii 21 występuje o wiele częściej niŜ amplifikacja tego genu [16, 17]. UwaŜa się, Ŝe obecność choćby jednej dodatkowej kopii chromosomu 21, występującej jako zmiana wrodzona (trisomia 21 w zespole Downa) lub nabyta, ma działanie leukemogenne [18].
Wysokiego stopnia amplifikacja AML1, występująca u pacjentów bez polisomii 21,
jest rozpoznawana w 1.5% przypadków dziecięcej ALL, o określonym profilu. Dodatkowe kopie AML1 stwierdza się u ok. 25% dzieci z ALL, częściej z odpowiadającymi
im zmianami cytogenetycznymi, rzadziej bez manifestacji cytogenetycznej [19]. Dodatkowe kopie lub zwielokrotnienie AML1 są rzadziej obserwowane w ALL dorosłych,
zaś występowanie tych zmian w AML jest rzadkie. WiąŜe się ono z reguły z obecnością chromosomów markerowych o róŜnej wielkości. Ich powstanie jest zmianą wtórną
w stosunku do częstych w AML translokacji genu AML1; tworzą się przewaŜnie z
jednego z chromosomów powstałych w wyniku translokacji. Innym mechanizmem są
w AML insercyjne translokacje genu lub zawierającej go sekwencji DNA, w róŜne
miejsca genomu [15].
Dodatkowe kopie AML1 rozregulowują, zaleŜną od działania kompleksu białek
CBF (CBFA+CBFB), ekspresję wielu genów wpływających na prawidłową hematopoezę, organizację cytoszkieletu, ruchliwość komórek mieloidalnych oraz proliferację
komórek hematopoetycznych [1, 14, 16]. Zwielokrotnienie AML1 moŜe być widoczne
na poziomie cytogenetycznym w postaci dodatkowych prawidłowych kopii chromosomu 21, lub w obrębie izochromosomów długich ramion 21, markerów, der(21), zawierających tandemowe powtórzenia AML1, albo chromosomów pierścieniowych.
Opisywane są równieŜ wrodzone aberracje strukturalne chromosmomu 21 [np. r(21)],
stanowiące podstawę do wtórnego zwielokrotnienia genu [15, 20]. Często jednak
zmiana ta jest niewidoczna w rutynowym badaniu cytogenetycznym [19].
Obecność dodatkowych kopii AML1 jest w ALL niekorzystnym czynnikiem rokowniczym. W AML amplifikacja AML1 obserwowana jest u przewaŜnie u starszych
osób, po terapii lekami alkilującymi, lub po MDS. W kariotypie, przewaŜnie złoŜonym, oprócz zmian związanych z amplifikacją, stwierdza się często aberracje strukturalne chromosomów 5 i 7 (najczęściej delecje długich ramion), którym towarzyszą
mutacje genu TP53. Rokowanie jest niekorzystne. Nawet jeśli AML z amplifikacją
AML1 nie jest białaczką wtórną, towarzyszące jej zmiany genetyczne są typowe dla tAML [21].
Jak widać, mimo zaangaŜowania róŜnych genów, obecność dodatkowych kopii
MLL i AML1 kojarzy się w ostrej białaczce szpikowej z podobnym obrazem cytogenetycznym i klinicznym, i zdecydowanie złym rokowaniem, które moŜe być związane
zarówno z samą amplifikacją, jak i towarzyszącymi jej niekorzystnymi zmianami cytogenetycznymi .
318 O. HAUS i wsp.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Haferlach T: Molecular genetic pathways as therapeutic targets in acute myeloid leukemia. ASH
2008. Educational Book, 400-411.
WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissue. WHO 2008.
Basecke J, Podleschny M, Clemens R, i wsp.: Lifelong persistence of AML associated MLL partial
tandem duplications (MLL-PTD) in healthy adults. Leukemia Res 2006; 30: 1091-1096.
Myllykangas S, Bohling T, Knuutila S: Specifity, selection and significance of gene amplifications in
cancer. Semin Oncol 2007; 17: 42-55.
Dolan M, McGlennen RC, Hirsch B: MLL amplification in myeloid malignancies: clinical, molecular,
and cytogenetic findings. Cancer Genet Cytogenet 2002; 134: 93-101.
Pajuelo-Gamez JC, Cervera J, Garcia-Casado Z, i wsp.: MLL amplification in acute myeloid leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2007; 174: 127-131.
Chowdhury T, Brady HJM: Insights from clinical studies into the role of MLL gene in infant and
childhood leukemia. Blood Cell Molec Dis 2008; 40: 192-199.
Shannon KM: Resistance in the land of molecular cancer therapeutics. Cancer Cell 2002; 2: 99-102.
Rodon N, Sole F, Espinet B, i wsp.: A new case of acute nonlymphocytic leukemia (FrenchAmerican-British subtype M1) with double minutes and c-MYC amplification. Cancer Genet Cytogenet 2002; 132: 161-164.
Reddy KS, Parsons L, Mak L, i wsp.: Segmental amplification of 11q23 region identified by fluorescence in situ hybridization in four patients with myeloid disorders: a review. Cancer Genet Cytogenet
2001; 126: 139-146.
Kancha RK, von Bubnoff N, Miething C, Peschel C, Gotze KS, Duyster J: Imatinib and leptomycin B
are effective in overcoming imatinib resistance due to Bcr-Abl amplification and clonal evolution, but
not due to Bcr-Abl kinase domain mutation. Haematologica 2008; 93: 1718-1722.
Papenhausen PR, Griffin S, Tepperberg J: Oncogene amplification in transforming myelodysplasia.
Experiment Molec Pathol 2005; 79: 168-175.
Smith A, Heaps LS, Sharma P, Jarvis A, Forsyth C: Abnormal dicentric chromosome with coamplification of sequences from chromosomes 11 and 19: a novel rearrangement in a patient with
myelodysplastic syndrome transforming to acute myeloid leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2001;
130: 29-32.
Michaud J, Simpson KM, Escher R, i wsp.: Integrative analysis of RUNX1 downstream pathways and
target genes. BMC Genomics 2008; 9: 1-17.
Moosavi SA, Sanchez J, Adeyinka A: Marker chromosomes are a significant mechanism of highlevel RUNX1 gene amplification in hematologic malignancies. Cancer Genet Cytogenet 2009; 189:
24-28.
Garcia-Casado Z, Cervera J, Verdeguer A, i wsp.: High-level amplification of the RUNX1 gene in two
cases of childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Genet Cytogenet 2006; 170: 171-174.
Shin M-G, Choi H-W, Kim H-R, i wsp.: Tetrasomy 21 as a sole acquired abnormality without
GATA1 gene mutation in pediatric acute megakaryoblastic leukemia: A case report and review of the
literature. Leukemia Res 2008; 32: 1615-1619.
Israeli S, Rainis L, Hertzberg L, Smooha G, Birger Y: Trisomy of chromosome 21 in leukemogenesis.
Blood Cell Molec Dis 2007; 39: 156-159.
Mikhail FM, Serry KA, Hatern N, i wsp.: AML1 gene over-expression in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2002; 16: 658-668.
Amplikacja genów w nowotworach
319
20. Streubel B, Valent P, Lechner K, Fonatsch C: Amplification of the AML1 (CBFA2) gene on ring
chromosomes in a patient with acute myeloid leukemia and a constitutional ring chromosome. Cancer
Genet Cytogenet 2001; 124: 42-46.
21. Podgornik H, Debeljak M, śontar D, Cernelc P, Velensek Prestor V, Jazbec J: RUNX1 amplification
in lineage conversion of childhood B-cell acute lymphoblastic leukemia to acute myelogenous leukemia. Canncer Genet Cytogenet 2007; 178: 77-81.
Praca wpłynęła do Redakcji 20.04.2009 r. i została zakwalifikowana do druku 30.04.2009 r.
Adres do korespondencji:
O. Haus
Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej CM UMK
85-094 Bydgoszcz
ul. Curie-Skłodowskiej 9
e-mail: [email protected]