IV. Streptococcus, Enterococcus – ćwiczenia praktyczne
Transkrypt
IV. Streptococcus, Enterococcus – ćwiczenia praktyczne
IV. Streptococcus, Enterococcus – ćwiczenia praktyczne Ćwiczenie 1. Ocena wzrostu szczepów paciorkowców na: a. agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK) typ hemolizy……………………………………………………… morfologia kolonii…………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………........................................... gatunek drobnoustroju: ……………………………………………………………. typ hemolizy……………………………………………………… morfologia kolonii…………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………........................................... gatunek drobnoustroju:……………………………………………………………….. b. podłożu D- coccosel z eskuliną morfologia kolonii…………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ……………………………….............................................. ............................................................................ c. 1. 2. 3. 4. podłożach płynnych bulion cukrowy podłoże bulionowe z 6,5% NaCl podłoże bulionowe o pH=9,6 podłoże bulionowe z 40% żółcią Streptococcus pneumoniae ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… 1 2 3 4 Streptococcus pyogenes ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… 1 2 3 4 Enterococcus faecalis ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… 1 2 3 4 Wnioski ...................................................................................................................................... ………………………………………………………………………………….……………… …………………………………………………………………………………………………. Ćwiczenie 2. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie V. Budowa komórki bakteryjnej i metody barwienia preparat bawiony metodą Grama Opis preparatu: ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… Ćwiczenie 3. Oznaczanie cech biochemicznych paciorkowców a. wykonanie próby na katalazę Wykonanie ćwiczenia: Opis wykonania ćwiczenia przy temacie VII. Fizjologia bakterii Szczep badany ……………………………….. ……………………………………. obserwowane wyniki Wnioski ...................................................................................................................................... ………………………………………………………………………………….……………… …………………………………………………………………………………………………. b. test wrażliwości na bacytracynę Test różnicuje paciorkowce β-hemolizujące. Szczególną wrażliwość na bacytracynę wykazują paciorkowce grupy A (Streptococcus pyogenes) Wykonanie ćwiczenia: Na podłoże Muellera-Hintona z dodatkiem 5% krwi baraniej, posiać jałową wymazówką zawiesinę hodowli płynnej badanego szczepu (0,5 w skali Mc Farlanda). Następnie na powierzchnię podłoża nałożyć krążek bibułowy nasączony 0,04u bacytracyny. Całość inkubować w temp. pokojowej 30 minut a następnie w 350 przez 18-24 godziny. Jako wynik wrażliwości uznaje się strefę zahamowania wzrostu wokół krążka z bacytracyną ≥15 mm. bacytracyna 0,04u Wnioski ...................................................................................................................................... ………………………………………………………………………………….……………… …………………………………………………………………………………………………. c. test wrażliwości na optochinę Optochina w bardzo małych stężeniach (mniej niż 5µg/ml) w sposób wybiórczy ma zdolność hamowania wzrostu Streptococcus pneumoniae, co różnicuje te dwoinki od innych paciorkowców α-hemolizujących. Wykonanie ćwiczenia: Na podłoże Muellera-Hintona z dodatkiem 5% krwi baraniej, posiać jałową wymazówką zawiesinę hodowli płynnej badanego szczepu (0,5 w skali McFarlanda). Następnie na powierzchnię podłoża nałożyć krążek bibułowy nasączony optochiną o stężeniu 5µg. Całość inkubować w temp. pokojowej 30 minut a następnie w 350 przez 18-24 godziny. Jako wynik dodatni uznaje się pojawienie się strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z optochiną bez względu na wielkość strefy. Przy strefie ≤ 14mm, wynik potwierdzić innymi metodami. optochina 5µg Wnioski ...................................................................................................................................... ………………………………………………………………………………….……………… …………………………………………………………………………………………………. d. wykrywanie zdolności do redukcji TTC Zdolność redukowania chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliowego umożliwia zróżnicowanie szczepów Enterococcus spp. Próbę tę wykonuje się na podłożu stałym lub płynnym z dodatkiem 0,01% TTC. Wykonanie ćwiczenia: Badane bakterie posiać na podłoże z dodatkiem 0,01% TTC i inkubować przez 24-48 godzin. Bakterie mające zdolność do redukcji TTC rosną na podłożu stałym w postaci kolonii ciemnoczerwonych, a na podłożu płynnym tworzą strąt zabarwiony na ten kolor. ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ……………………………….............................................. ............................................................................ Wnioski …………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………… ……………………………….............................................. ............................................................................ e. test CAMP Czynnik CAMP jest białkiem enzymatycznym działającym, jako ko-cytolizyna na częściowo zhemolizowane przez β-hemolizynę gronkowcową krwinki baranie. Wynikiem tego działania jest tzw. synergistyczna hemoliza. Wykonanie ćwiczenia: 1. Na powierzchnię płytki agarowej z 5% krwią baranią posiać liniowo (przez środek szalki) szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923 wytwarzający hemolizę β. 2. Prostopadle do linii posiewu, w bliskiej odległości (ale nie dotykając) posiać badany szczep. 3. Płytkę inkubować przez 18-24 godzin w temperaturze 350C. 4. Wytwarzanie czynnika CAMP objawia się pojawieniem strefy wzmożonej hemolizy w postaci przejaśnienia, często o kształcie jasnego grota strzały, w miejscu gdzie linia posiewu szczepu nachodzi na strefę hemolizy β gronkowca. Staphylococcus aureus ATCC 25923 Szczep badany Wnioski ...................................................................................................................................... ………………………………………………………………………………….……………… …………………………………………………………………………………………………. f. Test PYR Test służy do różnicowania rodzajów Enterococcus i Streptococcus. W teście tym wykrywa się obecność enzymu L-pyrolidonyloaryloamidazy. Enzym ten odszczepia βnaftylamid z substratu, którym jest L-pyrolidonylo-β-naftyloamid. Uwolniony związek z barwnikiem diazowym tworzy kompleks o barwie różowoczerwonej. Wykonanie ćwiczenia: 1. Nasycony substratem krążek bibułowy zwilżyć należy wodą destylowaną i nanieść badaną hodowlę. 2. Po 2 minutach dodać odczynnik diazowy i po ok. 60 sekundach odczytać wynik. 3. Stwierdzenie zmiany zabarwienia na kolor czerwony świadczy o dodatnim wyniku testu. Wnioski ...................................................................................................................................... ………………………………………………………………………………….……… g. Identyfikacja grup serologicznych paciorkowców β-hemolizujących Badanie można wykonać przy użyciu testu Pastorex STREP (BIORAD) Wykonanie ćwiczenia: 1. Przygotowanie enzymu do ekstrakcji Do liofilizatu dodać 10 ml wody destylowanej i wymieszać do rozpuszczenia. Roztwór jest stabilny przez 4 miesiące w temp. + 2 do + 8oC. 2. Wykonanie testu · 0,3 mln enzymu do ekstrakcji umieścić w probówce i zawiesić w nim 5 do 10 kolonii świeżej hodowli paciorkowca β-hemolizującego. · Inkubować 15–45 minut w temp. pokojowej, lub 10 – 30 minut w temp. 37oC · Wymieszać wszystkie surowice lateksowe (A,B,C,D,F,G) i nanieść po 1 kropli każdej z nich na oddzielne pola załączonej do testu płytki. · Używając jałowej pipety dodać po 1 kropli ekstraktu enzymatycznego badanego szczepu do wszystkich rozpipetowanych surowic na karcie. · Wymieszać przy pomocy pałeczek (do każdej kropli oddzielna). · Obracając ruchem kolistym płytkę odczytać wynik: reakcja pozytywna przejawia się widoczną aglutynacją występującą w czasie do 1 min. · Badanie przeprowadzać zawsze wykonując kontrolę dodatnią. Wnioski ...................................................................................................................................... ………………………………………………………………………………….……………… …………………………………………………………………………………………………. Ćwiczenie 4. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości szczepów: szczep ……………………………………. a. Dokonaj pomiaru stref zahamowania wzrostu wokół krążków. Antybiotyk symbol/dawka Strefa na krążku zahamowania wzrostu w mm Interpretacja wyniku b. Uzupełnij tabelkę o informacje dotyczące szczepów: Streptococcus spp. Antybiogram podstawowy Enterococcus spp. Antybiogram rozszerzony Oznaczane mechanizmy oporności Ćwiczenie 5. Uzupełnij tabele o informacje dotyczące paciorkowców Tab.I. Gatunki paciorkowców najczęściej izolowane od człowieka grupa I II III IV V VI VII gatunki Tab. II. Grupy serologiczne paciorkowców o znaczeniu klinicznym (podział wg Lancefield) Grupa serologiczna wg Lancefield A gatunek B C D F G Tab. III. Podział paciorkowców w zależności o typu wywoływanej hemolizy Gatunek S. pyogenes , S. agalactiae, S. equisimilis , S. canis, S. equi, S. bovis, S.equinus S. mitis, S. oralis, S. sanguis, S. pneumoniae S. mutans, S. sobrinus S. salivarius S. anginosus, S. intermedius, S. constelatus Enterococcus faecalis, E. faecium Typ hemolizy