Dako EnVision®+ Dual Link System

Dako
®
EnVision + Dual Link System-HRP (DAB+)
Nr kat. K4065
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
PoniŜsze instrukcje dotyczą Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+).
Opisywany system jest przeznaczony do stosowania z pierwotnymi przeciwciałami mysimi i króliczymi
wybranymi przez UŜytkownika, w celu jakościowej identyfikacji antygenów w preparatach tkanek prawidłowych
i zmienionych chorobowo zatapianych w parafinie, preparatach mroŜakowych lub cytologicznych. Identyfikację
prowadzi się w mikroskopie świetlnym. MoŜna uŜywać tkanek przygotowanych za pomocą róŜnych środków
utrwalających, w tym etanolu, B-5, płynu Bouina, formaliny z cynkiem oraz obojętnego roztworu buforowanej
formaliny.
Streszczenie
i informacje ogólne
Zestaw EnVision+ Dual Link System-HRP słuŜy do dwuetapowego barwienia IHC. W opisywanym systemie
wykorzystano polimer znakowany peroksydazą chrzanową (HRP) skoniugowany z przeciwciałami wtórnymi.
Znakowany polimer nie zawiera awidyny ani biotyny. Dzięki temu uzyskano wyraźne zmniejszenie lub
wyeliminowano nieswoisty odczyn wywołany endogennym wiązaniem awidyny i biotyny w wątrobie, nerkach,
tkance chłonnej i przy stosowaniu skrawków mroŜakowych. Wszystkie odczynniki w zestawie EnVision+ Dual
Link System-HRP z substratem (z wyjątkiem płynnego związku substrat-chromogen DAB+), są gotowe do
uŜycia. System stanowi wyjątkowo czułą metodę i w związku z tym optymalne rozcieńczenia przeciwciała
pierwotnego są do 20 razy większe niŜ uŜywane w tradycyjnych technikach PAP oraz kilka razy większe niŜ
stosowane w metodach ABC lub LSAB. Opisywany protokół pozwala na uzyskanie wzmocnienia sygnału
w celu detekcji antygenów występujących w niskich stęŜeniach lub przeciwciał o niskim mianie. Przeciwciała
uzyskiwane od myszy lub królików dają silną reakcję ze znakowanym polimerem. Interpretacja dodatniego lub
ujemnego odczynu powinna być uzupełniona przez badania morfologiczne i histologiczne oraz wykonywanie
odpowiednich prób kontrolnych.
Zasady procedury
Endogenna aktywność peroksydazy jest wyeliminowana przez 5–10 minutową inkubację próbki z podwójnym
odczynnikiem blokującym (Dual Endogenous Enzyme Block). Następnie inkubuje się próbkę ze stosownymi,
właściwie rozcieńczonymi przeciwciałami pierwotnymi mysimi lub króliczymi, po czym inkubuje ze znakowanym
polimerem, stosując zalecaną 30 minutową inkubację dla kaŜdego. NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe dla przeciwciał
wymagających trawienia enzymatycznego lubodmaskowywania antygenu moŜe się okazać konieczne
zwiększenie czasu inkubacji przeciwciała pierwotnego i znakowanego polimeru o 5–10 minut. Ostatnim
etapem odczynu jest 5–10 minutowa inkubacja z kompleksem substrat-chromogen z 3,3’-diaminobenzydyną
(DAB+), w wyniku której w miejscu występowania antygenu wytrąca się precypitat o brązowym zabarwieniu.
(DAB moŜe wykazywać działanie rakotwórcze; zobacz część Środki ostroŜności.)
Dostarczane
odczynniki
Nr kat. K4065
Opisywany zestaw zawiera następujące materiały wystarczające do przygotowania 150 skrawków tkankowych,
przy uŜyciu 100 µL na skrawek:
Ilość
1x15 mL
Opis
Dual Endogenous Enzyme Block
0,3% nadtlenek wodoru z azydkiem sodu i lewamizolem.
1x15 mL
Znakowany polimer
Polimer znakowany peroksydazą skoniugowany z immunoglobulinami kozimi przeciwko
antygenom mysim i króliczym w buforze Tris-HCl zawierającym białko stabilizujące
i substancję o działaniu przeciwbakteryjnym.
1x18 mL
Bufor do substratu
Roztwór buforowy substratu, pH 7,5, zawierający nadtlenek wodoru i środek konserwujący.
1x1 mL
Chromogen DAB+
Roztwór chromogenu, 3,3'-diaminobenzydyny
(127987-001)
P04048PL_01/K4065/2015.07 p. 1/7
Materiały wymagane,
ale niedostarczane
Woda dejonizowana lub destylowana
Etanol absolutny i roztwór o stęŜeniu 95%
Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu
Przeciwciała pierwotne i odczynnik do kontroli ujemnej
Szkiełka powlekane poli-L-lizyną lub szkiełka sylanizowane Silanized Slides (nr kat. S3003) (zobacz część
Przyleganie skrawków tkankowych zatapianych w parafinie).
Tkanka kontrolna (kontrola dodatnia i ujemna)
Roztwór wodorotlenku amonu o stęŜeniu 15 mmol/L rozcieńczony do 0,037 mol/L
Barwnik kontrastowy, środek oparty na roztworze wodnym np. Mayer’s Hematoxylin lub Lillie’s Modified
Mayer’s Hematoxylin (Nr kat. S3002 do uŜytku automatycznego; nr kat S3001 do uŜytku ręcznego) (zobacz
część Przygotowanie odczynników).
Do nakrywania zaleca się stosowanie środka wodnego, np. Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-toUse (nr kat. S3025), bezwodnego (Ultramount (nr kat. S1964) lub trwałego środka bezwodnego – Permanent
Mounting Medium (nr kat. S3026)
Szkiełka nakrywkowe
Mikroskop optyczny (20x–800x)
Ściereczki wchłaniające
Naczynia lub kąpiele do barwienia
Minutnik (z zakresem 3–40 minut)
Butelki z roztworem płuczącym
Roztwór buforu płuczącego, np. Automation Buffer (nr kat. S3006), TBS (nr kat. S3001) lub PBS
(nr kat. S3024)
Środki ostroŜności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3
z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie
wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do
przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Nie naleŜy zastępować odczynników produktami pochodzącymi z innych partii lub z zestawów innych
producentów.
4. W przypadku ekspozycji na silne światło jakość odczynników enzymatycznych i substratów-chromogenów
moŜe ulec zmniejszeniu. Nie naleŜy przechowywać składników zestawu ani wykonywać barwienia w silnym
oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne.
5. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji lub temperatur moŜe powodować błędne
wyniki badania; wszystkie zmiany tego rodzaju muszą zostać zweryfikowane przez UŜytkownika.
6. Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
7. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą
bądź oczami.
8. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi.
9. Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie.
Niebezpieczeństwo
Dual Endogenous Enzyme Block: <0.1% 3(2H)-Isothiazolone, 5-chloro-2-methyl-, mixt. with 2-methyl3(2H)-isothiazolone
H314
Powoduje powaŜne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu.
H317
MoŜe powodować reakcję alergiczną skóry.
P280
Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować
odzieŜ ochronną.
P261
Unikać wdychania par.
P264
Dokładnie umyć ręce po uŜyciu.
P272
Zanieczyszczonej odzieŜy ochronnej nie wynosić poza miejsce pracy.
P304 + P340 +
W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO DRÓG ODDECHOWYCH: Wyprowadzić lub
P310
wynieść poszkodowanego na świeŜe powietrze i zapewnić warunki do odpoczynku w
pozycji umoŜliwiającej swobodne oddychanie. Natychmiast skontaktować się z
OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem.
P301 + P310 +
W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM
P330 + P331
KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem. Wypłukać usta. NIE wywoływać wymiotów.
P303 + P361 +
W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ (lub z włosami): Natychmiast zdjąć całą
P353 + P363 +
zanieczyszczoną odzieŜ. Spłukać skórę pod strumieniem wody/prysznicem. Wyprać
P310
zanieczyszczoną odzieŜ przed ponownym uŜyciem. Natychmiast skontaktować się z
OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem.
P302 + P352
W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ: Umyć duŜą ilością wody/…
P333 + P313
W przypadku wystąpienia podraŜnienia skóry lub wysypki: Zgłosić się do lekarza po
poradę.
(127987-001)
P04048PL_01/K4065/2015.07 p. 2/7
P305 + P351 +
P338 + P310
P405
P501
W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut.
Zdjąć soczewki kontaktowe, jeŜeli są załoŜone i moŜna je łatwo usunąć. Kontynuować
przepłukiwanie. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub
z lekarzem.
Przechowywać pod zamknięciem.
Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i
międzynarodowymi przepisami.
Niebezpieczeństwo
DAB+ Chromogen: 1–5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride
H350
MoŜe powodować raka.
H341
Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne.
P201
Przed uŜyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŜności.
P202
Nie uŜywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa.
P280
Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować
odzieŜ ochronną.
P308 + P313
W PRZYPADKU naraŜenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską.
P405
Przechowywać pod zamknięciem.
P501
Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i
międzynarodowymi przepisami.
Jako zasadę naleŜy przyjąć zakaz pracy z produktem osobom w wieku poniŜej 18 lat.
UŜytkowników naleŜy starannie poinstruować co do właściwych procedur pracy,
niebezpiecznych własności produktu i środków ostroŜności.
Przechowywanie
Odczynniki systemu EnVision+ Dual Link System-HRP naleŜy przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie
zamraŜać. Nie naleŜy uŜywać produktów po upływie daty waŜności wydrukowanej na fiolkach odczynników
i etykiecie zestawu. Jeśli odczynniki przechowywane są w warunkach innych niŜ określone powyŜej, faktyczne
warunki przechowywania powinny zostać zweryfikowane przez uŜytkownika.1
Zmiana w wyglądzie któregokolwiek odczynnika, na przykład wytrącenie się osadu, moŜe oznaczać
niestabilność lub pogorszenie jakości. W takich przypadkach nie naleŜy uŜywać odczynnika (odczynników).
Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności odczynników. Dlatego, równolegle z odczynami
na materiale pochodzącym od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku
nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych,
gdy podejrzewa się problem z zestawem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy
Dako.
Przygotowanie
próbek
Przed wykonaniem odczynu IHC naleŜy utrwalić i przetworzyć tkanki. Utrwalenie zabezpiecza przed autolizą
i rozkładem wycinków, utrzymuje antygenowość, zwiększa współczynnik załamania światła przez struktury
tkankowe i zwiększa odporność składników komórek na przeprowadzenie. Przetworzenie tkanki polega na
odwodnieniu, usunięciu środków odwadniających, przepojeniu substancją zatapiającą, zatopieniu i wykonaniu
wycinków. Podane informacje mają charakter wyłącznie orientacyjny. Optymalna procedura powinna zostać
ustalona i zweryfikowana przez UŜytkownika. Szczegółowe informacje dotyczące utrwalania i obróbki
skrawków tkankowych przedstawiono w dokumencie Dako „Instrukcje wykonywania odczynów
immunohistochemicznych”.
Przygotowanie
odczynników
Roztwory buforów płuczących
Badania wykazały, Ŝe roztwór Tris-HCl o stęŜeniu 0,05 mol/L i pH 7,6, zawierający NaCl w ilości 0,15 mol/L
NaCl oraz 0,05% preparatu Tween 20, bez azydku sodu, znacząco pomaga w osłabianiu odczynu tła podczas
barwienia przy uŜyciu tego systemu. Zalecany bufor płuczący to Automation Buffer (nr kat. S3006). Bufory
płuczące zawierające azydek sodu unieczynniają peroksydazę chrzanową i powodują odczyn ujemny.
NieuŜywany bufor przechowywać w temperaturze 28°C. Nie u Ŝywać buforu, jeśli wystąpiło jego zmętnienie.
RĘCZNE WYKONANIE ODCZYNU
Skrawki tkankowe naleŜy wypłukać do trzech razy w świeŜych kąpielach z Automation Buffer (nr kat. S3006),
TBS (nr kat S3001) lub PBS (nr kat. S3024) przez 3—5 minut między kaŜdym krokiem procedury odczynu
EnVision+ Dual Link System.
Przeciwciała pierwotne
Firma Dako oferuje gotowe do uŜytku przeciwciała do systemu EnVision+ Dual Link System. Dako oferuje
takŜe stęŜone przeciwciała, jednak optymalne rozcieńczenia muszą zostać wyznaczone doświadczalnie przez
uŜytkownika. W związku z wysoką czułością EnVision+ Dual Link System, rozcieńczenia przeciwciał
pierwotnych mogą być 5 do 20 razy większe niŜ stosowane w tradycyjnych metodach IHC. Jeśli korzysta się ze
stęŜonych przeciwciał, naleŜy je rozcieńczać przy pomocy Antibody Diluent (nr kat. S0809). W przypadku
większości przeciwciał pierwotnych stosowanych z opisywanym zestawem, wystarczający czas inkubacji
wynosi 30 minut.
(127987-001)
P04048PL_01/K4065/2015.07 p. 3/7
Odczynnik do kontroli ujemnej
W idealnych warunkach odczynnik kontroli ujemnej zawiera przeciwciała, które nie wykazują swoistej
reaktywności z tkankami ludzkimi lub prawidłową bądź nieimmunizowaną surowicę w takim samym medium
(roztworze), co rozcieńczone przeciwciała pierwotne. Odczynnik do kontroli ujemnej powinien zawierać
przeciwciała pochodzące od tego samego gatunku zwierzęcia i naleŜące do tej samej podklasy, co
przeciwciała pierwotne i rozcieńczone do takiego samego stęŜenia immunoglobulin lub białek, jak przeciwciała
pierwotne, przy uŜyciu tego samego rozcieńczalnika. Czas inkubacji odczynnika do kontroli ujemnej powinien
odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych. Dla wygody uŜytkowania odczynniki
uniwersalnej kontroli ujemnej dla pierwotnych przeciwciał mysich i uniwersalnej kontroli ujemnej dla
pierwotnych przeciwciał króliczych, dostępne są w Dako w formie gotowej do uŜycia. Szczegółowe informacje
dotyczące przygotowywania odczynników do kontroli ujemnej przedstawiono w dokumencie Dako „Instrukcje
wykonywania odczynów immunohistochemicznych”.
Roztwór substrat-chromogen
PoniŜej przedstawiono procedurę przygotowania 1 mL roztworu substratu–chromogenu DAB+,
wystarczającego do barwienia 10 skrawków tkankowych lub do 5 rozmazów cytologicznych.
ETAP 1
ETAP 2
W zaleŜności od liczby barwionych szkiełek przenieść odpowiednią liczbę porcji 1 mL buforu do
substratu do odpowiedniej wielkości pojemnika.
Na kaŜdą 1 mL porcję buforu dodać 1 kroplę (20 µL) Liquid DAB+ Chromogen. Natychmiast
zmieszać.
Przygotowany roztwór substratu-chromogenu DAB+ jest stabilny przez około pięć dni, jeśli przechowywany jest
w temperaturze 2–8°C. Odczynnik ten nale Ŝy dokładnie wymieszać przed uŜyciem. Wytrącanie się osadu nie
wpływa na jakość odczynu. Wykorzystane w całości 18 mL dostarczonego buforu do substratu wystarczy do
przeprowadzenia 15 pomiarów. MoŜe zostać nadmiarowa objętość buforu.
Środki do zatapiania preparatu
Do zatapiania wodnego zaleca się Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (nr kat. S3025). Do
trwałego nakrywania moŜna stosować preparaty Ultramount (nr kat. S1964) lub Permanent Mounting Medium
(nr kat. S3026).
Wykonanie odczynu
Uwagi dotyczące procedury
Przed przystąpieniem do wykonania odczynu UŜytkownik powinien uwaŜnie przeczytać podane instrukcje
i zapoznać się z zawartością zestawu. Zobacz część Środki ostroŜności.
Przed wykonaniem odczynu immunochemicznego roztwór Dual Endogenous Enzyme Blocking Solution oraz
polimer EnVision+ Dual Link System naleŜy doprowadzić do temperatury pokojowej. Wszystkie procedury
inkubacji zostały zoptymalizowane do wykonywania w temperaturze pokojowej. Odczynniki i instrukcje
dostarczane w zestawie opracowano w celu uzyskania optymalnych wyników. Dodatkowe rozcieńczenie
odczynników wchodzących w skład zestawu bądź nieprzestrzeganie czasu lub temperatury inkubacji moŜe
spowodować uzyskanie błędnych wyników.
Podczas wykonywania barwienia nie moŜna dopuścić do wysychania skrawków tkankowych. Wysuszone
skrawki tkankowe mogą powodować nasilenie nieswoistego odczynu. NaleŜy osłonić szkiełka nakrywkowe
znajdujące się w miejscach naraŜonych na przeciągi. JeŜeli stosuje się długie czasy inkubacji, preparaty
powinny się znajdować w środowisku o odpowiedniej wilgotności. Czułość EnVision+ Dual Link System-HRP
moŜna dodatkowo zwiększyć przez wydłuŜenie czasów inkubacji w etapach 2 i 3 o 5—10 minut.
PRZEBIEG BARWIENIA METODĄ MANUALNĄ
ETAP 1 BLOKOWANIE ENDOGENNEJ PEROKSYDAZY
Strząsnąć nadmiar buforu. Posługując się chusteczką niepozostawiającą nitek (np. Kimwipe lub gazikiem)
ostroŜnie otrzeć szkiełko wokół preparatu tak, by usunąć pozostałości płynu i utrzymywać odczynniki
w obszarze zgodnym z zaleceniami.
Dodać tyle odczynnika blokującego enzymy (Dual Endogenous Enzyme Block) by zakryć próbkę.
Inkubować przez 510 (±1) minut.
OstroŜnie przepłukać wodą destylowaną lub roztworem buforowym z butelki na płyn płuczący (nie naleŜy
kierować strumienia płynu bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat w świeŜej kąpieli
z buforem TBS.
ETAP 2 PRZECIWCIAŁA PIERWOTNE LUB ODCZYNNIK DO KONTROLI UJEMNEJ
Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio.
Nanieść optymalnie rozcieńczony roztwór przeciwciał pierwotnych lub odczynnika do kontroli ujemnej,
aŜ próbka zostanie zakryta.
Inkubować przez 30 (±1) minut.
OstroŜnie przepłukać roztworem buforowym z butelki na płyn płuczący (nie naleŜy kierować strumienia płynu
bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat w świeŜej kąpieli z buforem.
W razie konieczności przerwania wykonywania odczynu, preparaty moŜna przechowywać w roztworze buforu
po inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi (etap 2) i utrzymuje przez okres do jednej godziny w temperaturze
pokojowej bez wpływu na wyniki odczynu.
(127987-001)
P04048PL_01/K4065/2015.07 p. 4/7
ETAP 3 ZNAKOWANY POLIMER-HRP
Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio.
Dodać tyle znakowanego polimeru, aby zakryć próbkę.
Inkubować przez 30 (±1) minut.
Przemyć preparaty jak podczas etapu 2, a następnie umieścić w kąpieli z buforem na 5 (±1) minut.
ETAP 4 SUBSTRAT-CHROMOGEN
Wytrzeć preparaty jak poprzednio.
Nanieść dość roztworu substratu-chromogenu by pokryć próbkę (zobacz część Przygotowanie odczynnika).
Inkubować przez 510 (±1) minut.
OstroŜnie przepłukać wodą destylowaną z butelki (nie kierować strumienia wody bezpośrednio na tkankę).
Umieścić odpady roztworu substrat-chromogen w pojemniku na materiały niebezpieczne w celu właściwego
usunięcia.
ETAP 5 BARWIENIE KONTRASTOWE HEMATOKSYLINĄ (opcjonalnie)
Zanurzyć preparaty w kąpieli z wodnego roztworu hematoksyliny. Długość okresu inkubacji zaleŜy od stęŜenia
stosowanego roztworu hematoksyliny.
OstroŜnie przepłukać w łaźni z wodą destylowaną.
Dziesięciokrotnie zanurzyć preparaty w kąpieli wodnego roztworu amoniaku o stęŜeniu 0,037 mol/L
lub podobnego środka róŜnicującego.
Przepłukiwać w kąpieli z wody destylowanej lub dejonizowanej przez 2–5 minut.
Przejść do zatapiania.
Zatapianie preparatu
MoŜna stosować wodne preparaty do nakrywania, np. Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use
(nr kat. S3025). Do trwałego nakrywania moŜna stosować preparaty Ultramount (nr kat. S1964) lub Permanent
Mounting Medium (nr kat. S3026).
Uwaga: Odczyt odczynu moŜna przeprowadzić w dogodnym momencie. Niemniej jednak, jeŜeli szkiełka
mikroskopowe są naraŜone na silne światło przez okres jednego tygodnia, moŜe nastąpić pewne zblaknięcie.
Aby ograniczyć utratę zabarwienia naleŜy przechowywać preparaty w zaciemnionym miejscu, w temperaturze
pokojowej (20–25°C).
Kontrola jakości
RóŜnice w metodach obróbki tkanek i procedurach technicznych stosowanych w laboratorium UŜytkownika
mogą powodować istotne róŜnice wyników, wymagające regularnego wykonywania wewnętrznej kontroli
jakości. NaleŜy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi kontroli jakości College of American
Pathologists – Certification Program for Immunohistochemistry (Program certyfikacji immunohistochemicznej
Kolegium Patologów Amerykańskich) oraz publikacjami 3–5, wyszczególnionymi w Piśmiennictwie. Informacje
dotyczące czułości i immunoreaktywności przedstawiono w kartach specyfikacji poszczególnych przeciwciał.
Dalsze informacje na temat kontroli dodatnich i ujemnych przedstawiono w dokumencie Dako „Ogólne
instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych”.
Interpretacja odczynu
Wskazówki dotyczące interpretacji przedstawiono w dokumencie Dako „General Instructions for
Immunohistochemical Staining” (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych).
Ograniczenia ogólne
Uwagi dotyczące ograniczeń przedstawiono w dokumencie Dako „General Instructions for
Immunohistochemical Staining” (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych).
Ograniczenia swoiste
dla opisywanego
produktu
W przypadku stosowania starych lub niebuforowanych utrwalaczy lub ekspozycji na temperaturę
przekraczającą 60ºC podczas przygotowania preparatów moŜe nastąpić zmniejszenie czułości odczynu.
Endogenna aktywność peroksydazy lub o podobnym charakterze moŜe występować w hemoproteinach – np.
hemoglobinie, mioglobinie, cytochromach i katalazie oraz w eozynofilach.2,3 Tego rodzaju aktywność moŜna
zahamować inkubując próbki przez 5 minut z odczynnikiem Dual Endogenous Enzyme Block z zestawu
EnVision+ Dual Link System-HRP. Opisywany odczynnik moŜna stosować do rozmazów krwi i szpiku kostnego
oraz preparatów mroŜakowych. MoŜna równieŜ stosować roztwór alkoholowy nadtlenku wodoru. Ta procedura
powoduje jednak denaturację niektórych antygenów.
Tkanki pochodzące od osób z zakaŜeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające antygen
powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste barwienie w reakcji
z peroksydazą chrzanową.4
Prawidłowe i nieimmunizowane surowice uzyskiwane od tego samego gatunku zwierzęcia, od którego
pochodzą przeciwciała wtórne stosowane do blokowania nieswoistego enzymu, mogą powodować wyniki
fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie z uwagi na obecność autoprzeciwciał lub przeciwciał naturalnych.
Odczynniki dostarczane w zastawie mają optymalne rozcieńczenia. Zwiększanie rozcieńczenia moŜe
powodować utratę detekcji antygenów.
(127987-001)
P04048PL_01/K4065/2015.07 p. 5/7
Rozwiązywanie
problemów
RĘCZNE
Problem
1. Brak
barwienia we
wszystkich
preparatach
2. Słabe
barwienie we
wszystkich
preparatach
3. Nadmierne
barwienie tła
we wszystkich
preparatach.
Prawdopodobna przyczyna
1a. Odczynniki nie są uŜywane
we właściwej kolejności.
Zalecane postępowanie
1a. Sprawdzić sposób uŜycia odczynników.
1b. Azydek sodu obecny
w kąpieli z buforem.
2a. Skrawki zawierają zbyt
duŜo roztworu po kąpieli
płuczącej.
1b. UŜyć świeŜego buforu niezawierającego
azydku.
2a. OstroŜnie usunąć nadmiar roztworu przed
wytarciem preparatu wokół skrawka.
2b. Preparaty nie są
inkubowane wystarczająco
długo z przeciwciałami lub
substratem.
3a. W próbkach występuje
duŜa aktywność
peroksydazy.
2b. Sprawdzić zalecany czas inkubacji.
3b. Niecałkowicie usunięta
parafina.
3b. Zastosować świeŜą kąpiel z ksylenu lub
toluenu. W przypadku jednoczesnego
wykonywania odczynu kilku preparatów, druga
kąpiel z ksylenu powinna zawierać świeŜy
ksylen.
3c. Zastosować świeŜe roztwory w kąpielach
z buforem i butelkach z roztworem płuczącym.
Jako buforu płuczącego uŜyć Automation Buffer
(zobacz część Przygotowanie odczynników).
3d. Stosować krótszy czas inkubacji w roztworze
barwiącym chromogen-substrat.
3c. Preparaty nie są
odpowiednio przemywane.
3d. Szybsza niŜ zwykle reakcja
substratu ze względu na
nadmierną temperaturę w
pomieszczeniu.
3e. Wysychanie skrawków
podczas wykonywania
odczynu.
3f. Nieswoiste wiązanie
odczynników do skrawka
tkanki.
3g. Przeciwciało zbyt stęŜone.
3a. Stosować dłuŜszą inkubację z odczynnikiem
blokującym Dual Endogenous Enzyme Block.
3e. Stosować komorę nawilŜającą. Wycierać tylko
trzy do czterech szkiełek w czasie pomiędzy
nanoszeniem odczynnika.
3f. Zastosować roztwór blokujący z nieistotnym
białkiem (zobacz część Interpretacja odczynu).
3g. Zastosować większe rozcieńczenie
przeciwciała pierwotnego.
UWAGA: Jeśli problemu nie daje się przypisać Ŝadnej z powyŜszych przyczyn, bądź jeśli zalecane
postępowanie jest nieskuteczne, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako w
celu uzyskania dalszej pomocy.
Dodatkowe informacje na temat technik wykonywania odczynów oraz przygotowywania próbek przedstawiono
w publikacjach Handbook - Immunochemical Staining Methods5 (dostępna w firmie Dako), Atlas of
Immunohistology6 oraz Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis.7
Piśmiennictwo
(127987-001)
1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and
definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order Code C24-A:4
2. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells.
J Histochem Cytochem 1987; 35:213
3. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol
Press 1990; 46
4. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen:
A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626
5. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook-immunochemical staining methods. Carpinteria 3rd Edition.
Dako 2001
6. Tubbs RR, et al. Atlas of Immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986
7. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago:
Amer Soc Clin Pathol Press 1986
P04048PL_01/K4065/2015.07 p. 6/7
Dodatkowe materiały
referencyjne
Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195
Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol.
Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8
Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a
traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad
Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25
Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl
Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25
Bisgaard K. EnVision Plus-Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl
Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25
Edition 07/15
(127987-001)
P04048PL_01/K4065/2015.07 p. 7/7