NOVA Lite HEp-2 ANA Kit with DAPI

NOVA Lite® HEp-2 ANA Kit with DAPI
Do diagnostyki In Vitro
Złożoność CLIA: Wysoka
Kod produktu:
708102
Przeznaczenie
•
NOVA Lite® HEp-2 to pośrednie badanie immunofluorescencyjne do badań przesiewowych i
oznaczania półilościowego przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) w surowicy ludzkiej. Obecność
przeciwciał przeciwjądrowych może być stosowana w połączeniu z objawami klinicznymi i innymi
badaniami serologicznymi, aby wspomóc diagnostykę tocznia rumieniowatego układowego (SLE) lub
innych chorób tkanki łącznej bądź reumatycznych.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Pojęcie „przeciwciała przeciwjądrowe” (ANA) opisuje różnorodne przeciwciała, które wchodzą w
reakcję ze składnikami jąder komórkowych, w tym z DNA, RNA oraz wieloma białkami i
rybonukleoproteinami.1 Te przeciwciała często występują u pacjentów z chorobami tkanki łącznej lub
reumatycznymi, szczególnie toczniem rumieniowatym układowym.
Praktycznie wszyscy pacjenci SLE są ANA-pozytywni. Ta czułość diagnostyczna doprowadziła do
włączenia przez podkomisję Amerykańskiego Kolegium Reumatologii testowania ANA do
poprawionych w 1982 r. kryteriów klasyfikacji toczenia rumieniowatego układowego.2 Pomimo tego,
że badanie ANA jest doskonałym badaniem przesiewowym dla SLE (wynik negatywny praktycznie
wyklucza aktywne SLE3), w żadnym wypadku nie jest to badanie swoiste.
Pacjenci z innymi chorobami tkanki łącznej, jak reumatoidalne zapalenie stawów, twardzina i
zapalenie skórno-mięśniowe mają często wyniki pozytywne i w innych stanach chorobowych oraz u
osób zdrowych można obserwować niskie miana ANA.
Pozytywne wyniki ANA mogą występować po ciężkich oparzeniach lub infekcjach wirusowych i
zgłaszano je u niektórych osób zdrowych, zwłaszcza osób starszych.
Ze względu na brak swoistości zaleca się, aby wszystkie próbki pozytywne pod względem ANA
miareczkować do punktu końcowego i przeprowadzić bardziej swoiste badania pod kątem autoprzeciwciał
skierowanych przeciwko podwójnej nici DNA (dsDNA) i ekstrahowalnemu antygenowi jądrowemu (ENA).
Referencyjną metodą badania ANA jest pośrednia immunofluorescencja. Popularnymi substratami są
cienkie skrawki narządów gryzoni lub różne rodzaje linii komórkowych. Ogólnie jest przyjęte, że
substraty linii komórkowych są preferowane przed skrawkami narządów, ponieważ szybko dzielące
się komórki wykazują wyższe poziomy określonych antygenów istotnych klinicznie, w tym
centromeru, SS-A(Ro), Scl-70 i PCNA/cykliny.
Oprócz rodzaju substratu dla wydajności testu ANA kluczowe są trzy inne czynniki: 1) utrwalacz
zastosowany podczas przygotowywania preparatu, 2) współczynnik fluoresceiny do białka (F/P) oraz
3) swoistość podklasy immunoglobulin koniugatu.
Niektóre utrwalacze lub ich kombinacje niszczą określone antygeny jądrowe i należy unikać ich
stosowania. Czułość i nieswoistość barwienia tła koniugatu jest określana przez współczynnik F/P,
natomiast swoistość chorobowa koniugatu jest określana przez reaktywność podklasy immunoglobulin.
Praktycznie wszystkie istotne klinicznie autoprzeciwciała wykazują swoistość podklasy IgG, nawet w
obecności ANA swoistych wobec IgM i IgA.4 Dla odróżnienia ANA występujące u zdrowych
krwiodawców to ogólnie wyłącznie podklasy IgM oraz IgA.5 Z tego powodu koniugaty swoiste dla IgG
mają wyższą swoistość chorobową.
Substrat wybrany dla badania NOVA Lite® HEp-2 ANA to optymalnie utrwalona linia komórkowa
nabłonka ludzkiego (HEp-2) a koniugat to oczyszczona metodą powinowactwa IgG przeciwludzka
posiadająca starannie wybrany współczynnik F/P.
1
•
Te parametry odczynników umożliwiają wykrywanie przez test NOVA Lite® HEp-2 ANA
autoprzeciwciał istotnych klinicznie (w tym SS-A i Scl-70), które mogą pozostawać niewykryte przez
niektóre inne komercyjne testy ANA. Ponadto koniugat IgG swoiście eliminuje wyniki fizjologicznie
fałszywie pozytywne spowodowane normalnie występującymi niskimi mianami autoprzeciwciał IgM,
które często występują u zdrowych osób starszych.
Zasady badania
•
W przypadku pośredniej techniki immunofluorescencji próbki są inkubowane z substratem antygenu, a
przeciwciała, które nie weszły w reakcję, są wypłukiwane. Substrat jest inkubowany ze swoistym koniugatem
znakowanym fluoresceiną, a następnie niezwiązany odczynnik jest wypłukiwany. Próbki zawierające
autoprzeciwciała obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym będą wykazywać jasnozieloną
fluorescencyjną barwę w miejscach komórki lub jądra, gdzie nastąpiło związanie autoprzeciwciał.2
Odczynniki
•
•
•
•
•
•
•
Preparaty substratu HEp-2 (ludzkie komórki nabłonkowe); 12 dołków/preparat wraz z osuszaczem
Koniugat IgG przeciwludzkich (kozich), znakowany fluoresceiną w buforze zawierającym DAPI i ,09%
azydku sodu
Kontrola wzoru punktu końcowego miareczkowania ANA, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09%
azydek sodu oraz przeciwciała surowicy ludzkiej przeciw HEp-2, wstępnie rozcieńczona
System kontroli negatywnej IFA, 1 fiolka buforu zawierającego 0,09% azydek sodu bez przeciwciał
surowicy ludzkiej przeciw HEp-2, wstępnie rozcieńczona
Koncentrat PBS (40x), wystarcza na 2000 ml
Środek do osadzania preparatu, 0,09% azydek sodu
Szkiełka nakrywkowe
Ostrzeżenia
1.
2.
3.
4.
Wszystkie materiały pochodzenia ludzkiego używane w przygotowywaniu kontroli dla tego produktu
zostały przetestowane i na podstawie metod zatwierdzonych przez FDA stwierdzono że nie
zawierają przeciwciał przeciwko HIV, HBsAg i HCV. Jednak żadna metoda testowania nie może
całkowicie zagwarantować braku obecności HIV, HBV, HCV lub innych czynników zakaźnych. W
związku z tym kontrola wzoru punktu końcowego miareczkowania ANA i system kontroli
negatywnej IFA powinny być obsługiwane w taki sam sposób jak materiał potencjalnie zakaźny.6
W niektórych składnikach zestawu jako konserwant stosowany jest azydek sodu. Azydek sodu
jest trucizną i może być toksyczny w przypadku połknięcia lub wchłonięcia przez skórę lub oczy.
Azydek sodu może wchodzić w reakcję z ołowianą lub miedzianą instalacją wodociągową,
tworząc potencjalnie wybuchowe azydki metali. Jeśli do usuwania odczynników używane są
zlewy, należy przepłukiwać je dużą ilością wody, aby nie dopuścić do gromadzenia się azydku.
Podczas pracy z dostarczonymi odczynnikami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
Rozlane odczynniki należy natychmiast usunąć. Należy przestrzegać wszystkich krajowych i
lokalnych przepisów w zakresie utylizacji odpadów.
Środki ostrożności
1.
2.
3.
Ten produkt jest przeznaczonych do zastosowań diagnostycznych In Vitro .
Zastąpienie składników dostarczonych w tym systemie innymi składnikami może skutkować
osiągnięciem niespójnych wyników.
Niekompletne lub nieskuteczne wypłukanie dołków IFA może spowodować wysoki poziom tła.
2
4.
5.
6.
7.
Dostosowanie tego badania do stosowania ze zautomatyzowanymi analizatorami próbek oraz
innymi urządzeniami do pracy z płynami, w całości lub w części, może skutkować rozbieżnością
wyników w stosunku do badań przeprowadzanych ręcznie. Obowiązkiem każdego laboratorium
jest potwierdzenie, że wyniki testów uzyskanych na podstawie zautomatyzowanych badań
mieszczą się w akceptowalnych limitach.
Na wyniki analizy wpływa wiele różnych czynników. Obejmują one temperaturę początkową
odczynników, moc żarówki używanego mikroskopu, dokładność i powtarzalność techniki
pipetowania, dokładność płukania oraz czasy trwania inkubacji podczas badania. Uzyskanie
dokładnych i powtarzalnych wyników wymaga staranności i precyzji.
Z czasem koniugat IgG przeciwludzkiej może zmienić kolor z powodu ekspozycji na światło.
Jednak zmiana barwy nie ma wpływu na wynik badania.
Zalecane jest ścisłe przestrzeganie procedury testowej.
Warunki przechowywania
1.
2.
Wszystkie odczynniki z zestawu przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie zamrażać.
Odczynniki są trwałe do daty ważności, pod warunkiem, że są przechowywane i używane
zgodnie z instrukcjami.
Rozcieńczony bufor do płukania jest stabilny przez 4 tygodnie w temperaturze 2–8°C.
Pobieranie próbek
•
Ta procedura powinna być wykonana z próbką surowicy. Dodanie azydku lub innych konserwantów
do próbek analitycznych może mieć negatywny wpływ na wyniki. Nie używać próbek zawierających
widoczne zanieczyszczenia, skażonych bakteryjnie lub podgrzanych. Należy unikać całkowicie
zhemolizowanej lub lipemicznej surowicy albo próbek.
•
Po pobraniu surowica powinna być oddzielona od skrzepu. Dokument CLSI (NCCLS) H18-A3 zaleca
następujące warunki przechowywania próbek: 1) Przechowywać próbki w temperaturze pokojowej
nie dłużej niż 8 godzin. 2) Jeśli badanie nie zostanie zakończone w ciągu 8 godzin, schłodzić próbkę
do temperatury 2–8°C. 3) Jeśli badanie nie zostanie ukończone w ciągu 48 godzin lub w przypadku
transportu próbki, należy zamrozić ją w temperaturze -20°C lub niższej. Zamrożone próbki po
rozmrożeniu i przed badaniem muszą zostać dobrze wymieszane.
Badanie
Dostarczone materiały
Dostarczony element
Preparaty substratu HEp-2, 12 dołków
Ilość
20 x 12 dołków
Koniugat FITC przeciwludzkiej IgG z DAPI
1 x 15 ml
Możliwy do miareczkowania wzór kontroli ANA
1 x 0,5 ml
Systemu negatywnej kontroli FA
1 x 0,5 ml
Koncentrat PBS (40x)
2 x 25 ml
Środek do osadzania preparatu
1 x 7 ml
Szkiełka nakrywkowe
1 x 20
3
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
Mikropipety o objętości 15–1000 μl
Woda destylowana lub dejonizowana
Gruszki laboratoryjne lub pipety Pasteura
Komora wilgotna
Pojemnik 1 l (do rozcieńczania PBS)
Barwiacz Coplina
Mikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nm
Sposób przygotowania
Przed rozpoczęciem
1.
2.
3.
Doprowadzić wszystkie odczynniki i próbki do temperatury pokojowej (20–26°C) i dobrze wymieszać.
Rozcieńczyć koncentrat PBS. WAŻNE: Rozcieńczyć koncentrat PBS w stosunku 1:40, dodając
zawartość butelki koncentratu PBS do 975 ml wody destylowanej lub dejonizowanej i dokładnie
wymieszać. Bufor PBS jest używany do rozcieńczania próbek pacjentów oraz jako bufor do
płukania. Rozcieńczony bufor może być przechowywany maksymalnie przez 4 tygodnie w
temperaturze 2–8°C.
Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta:
a.
Wstępne badanie przesiewowe: Rozcieńczyć próbki pacjentów rozcieńczonym buforem
fosforanowym 1:40 (np. dodać 50 μl surowicy do 1,95 ml buforu fosforanowego).
b.
Miareczkowanie: Z początkowego rozcieńczenia przesiewowego dla wszystkich próbek
pozytywnych wykonać serię 2-krotnych rozcieńczeń za pomocą rozcieńczonego buforu
PBS (tj. 1:80, 1:160... 1:2560).
Procedura badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Przygotować preparat substratu: Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąć
temperaturę pokojową. Oznaczyć ołówkiem i umieścić w odpowiedniej komorze wilgotnej. Dodać 1
kroplę (20–25 μl) nierozcieńczonej kontroli pozytywnej i negatywnej, odpowiednio do dołka 1 i 2.
Dodać 1 kroplę (20–25 μl) rozcieńczonej próbki pacjenta do pozostałych dołków.
Inkubacja preparatu: Inkubować preparat przez 30 ± 5 minut w komorze wilgotnej (zwilżony ręcznik
papierowy włożony na płasko na spodzie zamkniętej torebki lub szklanego pojemnika zapewni
odpowiednie warunki wilgotności). Nie dopuścić do wyschnięcia substratu podczas badania.
Wypłukać preparaty: Po inkubacji użyć plastikowej gruszki laboratoryjnej lub pipety, aby
delikatnie przepłukać surowicę rozcieńczonym buforem PBS. Ustawić preparat oraz strumień
bufora PBS w taki sposób, aby ograniczyć wypłukiwanie próbek między dołkami. Unikać
kierowania strumienia bezpośrednio na dołki, aby nie dopuścić do uszkodzenia substratu.
Jeśli jest to wymagane, można umieścić preparaty na maks. 5 minut w barwiaczu Coplina z
rozcieńczonym buforem PBS.
Dodanie koniugatu fluorescencyjnego: Strząsnąć nadmiar buforu PBS. Umieścić preparat z
powrotem w komorze wilgotnej i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą koniugatu
fluorescencyjnego. Inkubować preparaty przez dodatkowe 30 ± 5 minut.
Wypłukać preparaty: Powtórzyć etap 3.
Szkiełko nakrywkowe: Procedura nakładania szkiełek nakrywkowych różni się w zależności od
laboratorium. Zalecana jest poniższa procedura:
a.
umieścić szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym.
b.
nanieść środek do osadzania preparatu w formie ciągłej linii na dolnej krawędzi szkiełka
nakrywkowego.
4
c.
strząsnąć nadmiar buforu PBS i zetknąć dolną krawędź preparatu z krawędzią szkiełka
nakrywkowego. Delikatnie opuścić preparat na szkiełko nakrywkowe, w taki sposób, aby
środek do osadzania preparatu rozpłynął się do górnej krawędzi preparatu bez
formowania pęcherzyków powietrza.
Kontrola jakości
•
Kontrola wzoru punktu końcowego miareczkowania ANA i system kontroli negatywnej IFA powinny
być oznaczane dla każdego preparatu, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i procedury działają
prawidłowo. Dodatkowe odpowiednie surowice kontrolne można przygotować dzieląc połączone
próbki surowicy ludzkiej i przechowując je w temperaturze poniżej -70°C. Aby wyniki badania mogły
być uznane jako ważne, muszą zostać spełnione wszystkie poniższe kryteria. Jeśli jakiekolwiek
kryterium nie będzie spełnione, wyniki badania powinny być traktowane jako nieważne i badanie
powinno zostać powtórzone.
1.
Nierozcieńczona kontrola wzoru punktu końcowego miareczkowania ANA musi być >3+.
2.
System kontroli negatywnej IFA musi być negatywny.
Interpretacja wyników
•
•
•
Reakcja negatywna. Próbka jest traktowana jako negatywna, jeśli swoiste zabarwienie jest równe
lub mniejsze niż systemu kontroli negatywnej IFA. Próbki mogą wykazywać różny stopień barwienia
tła ze względu na przeciwciała heterofilne lub niski poziom autoprzeciwciał skierowanych przeciwko
składnikom cytoplazmatycznym, jak białka kurczliwe.
Reakcja pozytywna. Próbka jest uznawana za pozytywną, jeżeli obserwowane swoiste barwienie
jest większe niż systemu kontroli negatywnej IFA.
Ustalić stopień fluorescencji lub intensywności za pomocą tych kryteriów:
4+ Jaskrawo jasnozielona fluorescencja
3+ Jasna jasnozielona fluorescencja
2+ Wyraźnie rozpoznawalna pozytywna fluorescencja
1+ Najniższa swoista fluorescencja, która umożliwia wyraźne odróżnienie barwienia jądrowego
i/lub cytoplazmatycznego od fluorescencji tła.
Interpretacja wzoru.
• Mogą występować różne wzory barwienia jądrowego i/lub cytoplazmatycznego w zależności od
występujących w próbce rodzajów i względnych ilości autoprzeciwciał.
Można obserwować następujące wzory barwienia:
Jednorodne: Jednolite barwienie jądra z lub bez widocznego maskowania jąderka.
Obecność antygenów jądrowych: dsDNA, ssDNA, histony
Powiązanie z chorobą: Wysokie miana sugerują SLE, niższe miana sugerują SLE lub inne
choroby tkanki łącznej.
Obwodowe: Jednolite barwienie, głównie wokół zewnętrznego obszaru jądra ze słabszym barwieniem
w ierunku środka jądra.
Obecność antygenów jądrowych: dsDNA, ssDNA, DNP, histon
Powiązanie z chorobą: Wysokie miana sugerują SLE, niższe miana sugerują SLE lub inne
choroby tkanki łącznej.
5
Plamy: Widoczne delikatne lub ziarniste barwienie jąderka, na ogół bez barwienia fluorescencyjnego jąderek.
Obecność antygenów jądrowych: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B i inne jeszcze nie
scharakteryzowane układy antygen / przeciwciało.
Powiązanie z chorobą: Wysokie miano wskazujące na SLE (przeciwciało Sm), mieszaną
chorobę tkanki łącznej (przeciwciało RNP), twardzinę (przeciwciało Scl-70) lub zespół Sjogrenasuchości (przeciwciało SS-B), niższe miana mogą sugerować inne choroby tkanki łącznej.
Jąderkowy: Duże ziarniste nakrapiane plamy w jądrze, zazwyczaj mniej niż 6 na komórkę, z lub bez
okazjonalnych drobnych plamek.
Obecność antygenów jądrowych: 4-6S RNA i inne nieznane antygeny jądrowe.
Powiązanie z chorobą: Wysokie miana występują w twardzinie i zespole Sjogrena.
Centromer: Wzór barwienia oddzielnego, plamkowego. Plamki jądrowe są bardzo oddzielone i zwykle
są wielokrotnością 46.
Obecność antygenów jądrowych: Centromer chromosomalny (kinetochor).
Powiązanie z chorobą: W dużym stopniu sugeruje zespół CREST, odmianę postępującej
twardziny układowej (PSS). CREST to forma PSS z silnym wapnieniem oraz zjawiskiem
Raynauda, zaburzeniami czynności przełyku, ograniczonymi objawami skórnymi (często
ograniczonymi do palców lub twarzy) i telangiektazją.
Mitochondrialny: Oddzielne plamki cytoplazmy względnie oddalone od obszaru jądra.
Obecność antygenu: Różne rodzaje antygenów mitochondrialnych.
Powiązanie z chorobą: Wysokie miana wskazują na pierwotną marskość żółciową.
•
Istotne jest ostrzeżenie użytkownika, aby zachować ostrożność podczas określenia swoistości
autoprzeciwciał na podstawie wzorów, z wyjątkiem wzorów jąderkowych i centromerowych, w
których każdy antygen jest bardzo dobrze określony i ich wzory są charakterystyczne. Ponieważ
wiele autoprzeciwciał lub ich kombinacji może indukować wzór jednorodny lub plamisty, zaleca
się przeprowadzania na wszystkich próbkach plamistych lub jednorodnych kontrolnych badań
autoprzeciwciał swoistych (takich jak dsDNA i ENA).
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Wysokie miana ANA sugerują chorobę tkanki łącznej, ale nie powinny być uznawane za
diagnostyczne. Wynik badania ANA powinien być analizowany w połączeniu z innymi wynikami
serologicznymi oraz ogólnym wywiadem klinicznym pacjenta.
Wzory ANA często zmieniają się, gdy próbka jest miareczkowana do punktu końcowego.
Zjawisko to jest spowodowane faktem, że podczas badania bardziej rozcieńczonych próbek
niższe miana przeciwciał spadają poniżej czułości systemu.
Wiele różnych czynników zewnętrznych ma wpływ na wrażliwość testu, np. typ używanego mikroskopu
fluorescencyjnego, moc i wiek lampy, stosowane powiększenie, system filtrów oraz badacz.
Jeśli zamiast filtra barierowego 515 używany jest filtr środkowoprzepustowy, może wystąpić
zwiększone zabarwienie artefaktowe.
Do opisywania preparatów należy stosować wyłącznie ołówek. Stosowanie innego przyrządu do
pisania może spowodować zabarwienie artefaktowe.
Wszystkie barwiacze Coplina stosowane do płukania preparatów nie powinny zawierać żadnych
pozostałości barwników. Używanie barwiaczy Coplina zawierających pozostałości barwników
może spowodować zabarwienie artefaktowe.
Wyniki tego badania powinny być użyte w powiązaniu z wynikami klinicznymi i innymi badaniami
serologicznymi.
Charakterystyka wyników badania nie została ustanowiona dla podłoża innego niż surowica.
6
Preparaty sprzedawane oddzielnie są sklasyfikowane jako „odczynniki swoiste wobec analitu”.
Z yjątkiem elementu zestawu NOVA Lite® HEp-2 ANA, charakterystyka analityczna i wydajnościowa
nie est ustalona.
Spodziewane wartości
•
Za pomocą zestawu NOVA Lite® HEp-2 ANA przebadano pacjentów z różnymi chorobami tkanki
łącznej oraz 200 losowo wybranych krwiodawców. Wyniki znajdują się poniżej:
Grupa pacjentów
Liczba zbadanych
SLE
Toczeń polekowy
Reumatoidalne
zapalenie stawów
Twardzina
Zapalenie
skórno-mięśniowe
Zespół Sjogrena
Prawidłowe
105
24
40
Liczba
pozytywnych
101
24
28
24
14
18
10
14
200
12
5
7
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in
Immunology 33: 167-239, 1982.
Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis
and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982.
Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus.
Arthritis and Rheumatism 7: 379-390, 1964.
Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus
erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: 1333-1338, 1966.
Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: 215-220,
1976.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of
Health, 2007, Fifth Edition
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone
Pomoc techniczna (tylko na terenie Stanów Zjednoczonych i Kanady): 877-829-4745
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
628102POL
Marzec 2012
Wersja 0
NOVA Lite i INOVA Diagnostics, Inc. są zastrzeżonymi znakami handlowymi.
Copyright 2012© Wszelkie prawa zastrzeżone
8