Mikrobiologia/Posiew

Mikrobiologia/Posiew
Z Wikibooks, biblioteki wolnych podręczników.
> Mikrobiologia > Posiew »
Spis treści
1 Posiew
1.1 Metoda I
1.2 Metoda II
1.3 Metoda III
1.4 Metoda IV
1.5 Metoda V
1.6 Metoda VI
1.7 Pytania
Posiew
Posiew jest podstawową metodą diagnostyki bakteriologicznej i mikologicznej zarówno w mikrobiologii
klinicznej, jak i "badawczej". Najkrócej rzecz ujmując posiew to metoda uzyskania pojedynczych,
odosobnionych kolonii bakterii, czy grzybów na podłożach mikrobiologicznych. Metod i sposobów
uzyskania tego jest wiele ­ lecz jedynie kilka jest powszechnie używanych. My przedstawimy 6, dość
popularnych metod, którym dla ułatwienia nadamy
nieformalne numery. Metody I­III są metodami "jakościowymi", zaś
Rzut oka
kolejne dwie pozwalają dość precyzyjnie określić ilość drobnoustrojów Eza, najkrócej rzecz ujmując,
w analizowanym materiale. Szósta ­ ostatnia to metoda, powiedzmy,
to igła preparacyjna
pomocnicza. Narzędziem obecnie używanym do posiewu są głównie ezy, zakończona metalową
do niedawna stosowało się także wygięte w kilku miejscach szklane
pętelką.
bagietki. Do posiewów, aby uzyskać wiarygodne wyniki, używamy
(opis w Wikipedii)
sterylnego sprzętu, a ezy nie powinny być gorące.
Metoda I
"Metoda I" nazywana jest czasem metodą uproszczoną. Metody tej można używać tylko przy
wysiewaniu na podłoża stałe.
Główną zaletą tej metody jest jej prostota. Posiew wykonuje się "rysując" ezą wgłębienia w podłożu tak,
jak pokazano na poniższym rysunku. Używa się jej głównie przy hodowlach z materiału zawierającego
niewiele bakterii (np. z moczu).
Schemat posiewu "metodą pierwszą"
Kierunek prowadzenia rozmazu. Przykładowy wygląd hodowli.
Metoda II
Metoda ta jest powszechnie znana, jako posiew redukcyjny.
Jej twórcą jest niemiecki mikrobiolog Robert Koch. Metody
tej można używać tylko podczas wysiewania na podłoża
stałe.
Posiew redukcyjny jest najpopularniejszą metodą posiewu,
na co wpływa jego uniwersalność względem ilości
mikroorganizmów w wyjściowej zawiesinie. Istnieje kilka
możliwości poprawnego wysiania materiału metodą
redukcyjną, nieznacznie różniących się między sobą. My
zaproponujemy chyba najprostszą z nich. Sam proces
posiewania podzielić można na cztery części. Wygodnie
Kolonie laseczek wąglika (Bacillus
byłoby, szczególnie przy dużej liczbie posiewów,
anthracis) z materiału posianego
zaopatrzyć się w cztery kolejno ułożone w stojaku (aby nie
redukcyjnie.
mieszało się, które są "gorące", a które nie) ezy ­ po jednej
do każdego etapu. Po pobraniu materiału wcześniej
wysterylizowaną w płomieniu palnika ezą należy rozprowadzić go po podłożu do około 40% szerokości
szalki Petriego w identyczny sposób, jak w przypadku "metody pierwszej" (etap 1). Następnie
sterylizujemy użytą ezę, dla wygody obracamy płytkę o 90° i kolejną z rzędu pętlą bakteriologiczną
powtarzamy czynność (etap 2). Obracamy znów płytkę Petriego (trzymając się obranego kierunku) i
powtarzamy czynności (etap 3). W etapie 4 kolejną ezą poruszamy w taki sposób, aby zmieścić się w
górnej części etapu trzeciego i wolnej przestrzeni pośrodku. W tym momencie posiew został
zakończony, płytkę możemy włożyć do cieplarki. Sami za to możemy wziąć pierwszą ezę i zacząć
wszystko od początku...
Schemat posiewu redukcyjnego
etap 1
Metoda III
etap 2
etap 3
etap 4
Paragraf ten opisuje metody wysiewania na podłoża stałe wylane do probówek. Jest
dość dużo możliwości w jakich podłoże (np. agar) może zastygnąć (patrz rysunek).
Z racji braku miejsca na wszystkie manewry niezbędne do wykonania posiewu
musimy używać innego, pozbawionego oczka ("pętelki"), typu ezy: tzw. ezy kłutej.
Posiew wykonujemy w sposób zbliżony do "metody I".
Jest to metoda dość prosta i, mimo tego, rzadko używana w celu hodowli bakterii.
Może być wykorzystywana do prób identyfikacji szczepów na podstawie wyników
ich wzrostu na różnego typu podłożach. Niemniej jednak, biochemiczne testy
odbywające nieomal bez udziału laboranta są powszechniejsze. Nasza "trzecia
metoda", choć wiekowa, dostarczyć może wielu informacji (np. o zdolności do
ruchu), których nie można bezpośrednio wywnioskować po automatycznych
testach.
Test na zdolność dekarboksylazy lizyny (reakcja charakterystyczna dla rodzaju
Salmonella ­ właściwie bez gatunku S. typhi /ok. 10% wyników dodatnich/):
pierwsze 3 dodatnie, 4 ujemny.
Na pożywkach wylanych skośnie bardzo wygodnie hoduje się grzyby ­ organizmy
rosnące zarówno nad, jak i pod powierzchnią pożywki. Nierzadko nie wysiewa się
grzybów przyrządami mikrobiologicznymi, lecz po prostu wrzuca do probówki
materiał (np. fragmenty paznokcia).
Typy podłoży
bakteriologicznych
w probówkach;
1, 2 ­ pożywka
skośna
Wzrost grzyba
Histoplasma
capsulatum
(będącego
przyczyną
zakażeń ukł.
oddechowego)
na dwóch
podłożach:
Sabouraud (L) i
Sabhi (P).
Metoda IV
Metoda czwarta, zwana techniką seryjnych (wielokrotnych) rozcieńczeń, została opracowana w 1878
roku przez angielskiego chirurga, twórcę antyseptyki barona Józefa Listera.
Pozwala ona bardzo dokładnie określić ilość bakterii w wyjściowej zawiesinie. Podstawą metod
ilościowych jest prawo mówiące, że z jednej bakterii w roztworze wyjścowym powstaje na drodze
podziałów jedna kolonia. Jest metodą wymagającą kilku probówek i przynajmniej 2 płytek z
odpowiednim podłożem. Przygotowując materiał do wysiania rozcieńczamy go kilkukrotnie w stosunku
1:10 tak, jak pokazano na rysunku. Zazwyczaj dokonuje się sześciu, siedmiu rozcieńczeń. Następnie
pipetą mikrobiologiczną do jałowych końcówek pobiera się materiał z kilku (dwóch, trzech) ostatnich
probówek. Następnie pobrany materiał, o określonej objętości rozsiewa się redukcyjnie ­ "metodą
drugą" (oczywiście materiał z każdej końcówki na innej szalce Petriego).
Metoda wielokrotnych rozcieńczeń Listera:
wszystkie wykładniki potęgowe są ujemne, x wynosi zazwyczaj od 5 do 10.
Równie prosto można policzyć ilość mikroorganizmów (z wyhodowanej grupy) w danej jednostce
objętości (identycznej z wysianą objętością) wewedług wzoru:
, gdzie
a ­ liczba kolonii
b ­ objętość posiania
10­x ­ współczynnik rozcieńczenia
W przypadku potrzeby porównania wyników z hodowli, w których pod uwagę brano różne objętości
materiału warto skorzystać z (jakże popularnych wśród chemików) proporcji.
Metoda V
Powyższa metoda, choć uniwersalna, jest jednak w stanie (delikatnie mówiąc) dać się we znaki. Nie jest
na pewno najszybsza, wymaga wielu operacji, wielu płytek... Czasem, gdy do policzenia mamy
niewielką ilości bakterii nie ma sensu korzystać z tego mikrobiologicznego arsenału możliwości. W
takiej sytuacji wygodna jest metoda Hoepricha. Do przeprowadzenia hodowli wykorzystując tę metodę
będzie potrzebne po 1 płytce Petriego z każdym interesującym nas podłożem, a także eza, o ściśle
określonej średnicy oczka ­ tzw. eza kalibrowana. Metody tej używać można jedynie do wysiewania
materiału płynnego. Sterylną ezą kalibrowaną należy pobrać materiał (tak, aby oczko było "pełne"), a
następnie rozsiać go metodą pierwszą lub drugą. Przy posiewie redukcyjnym ezy kalibrowanej należy
użyć podczas umownego "etapu 1.". W dalszych "etapach", dla wygody, używać możemy zwykłych ez.
Interpretacja wyników jest zależna od średnicy oczka ezy kalibrowanej ­ zazwyczaj wystarczy
pomnożyć ilość kolonii przez 100 lub 1000, aby uzyskać ilość bakterii w 1 mm3 materiału.
Metoda VI
Jako metodę VI (ostatnią) proponujemy technikę wysiewania na podłoża płynne. Metoda ta ma
znaczenie pomocnicze ­ głównie, gdy chcemy uzyskać zawiesinę bakterii z materiału stałego. Możemy
to ciało stałe zalać pożywką płynną, a także do pożywki wprowadzić materiał z ezy, czy wacika do
wymazów kilkukrotne wkładając i wyjmując narzędzie (najlepiej dotykając przy tym ścianek naczynia).
Nastęnie możemy:
zawiesinę inkubować (wygodne, gdy nie prowadzimy badań ilościowych lub gdy dane ilościowe
służą wyłącznie do porównań) po czym wysiać jedną z powyższych metod na płytki Petriego;
bezpośrednio po zabiegu wysiać jedną z powyższych metod na płytki Petriego.
Pytania
1.Na ilustracji obok przedstawione są kolonie po posiewie
redukcyjnym. W którym miejscu rozpoczęto posiew, a w którym
zakończono?
2. Badając fizjologiczną mikroflorę układu moczowego i jelit
człowieka poprzez analizę odpowiednio moczu i kału do
określenia liczebności mikrobów wykorzystano metodę
Hoepricha. Gdzie naukowcy popełnili błąd (o ile popełnili)?
Odpowiedzi
Źródło: „https://pl.wikibooks.org/w/index.php?
title=Mikrobiologia/Posiew&oldid=163186”
Kolonie Corynebacterium
pseudotuberculosis
Tę stronę ostatnio zmodyfikowano o 14:32, 3 maj 2011.
Tekst udostępniany na licencji Creative Commons: uznanie autorstwa, na tych samych
warunkach, z możliwością obowiązywania dodatkowych ograniczeń. Zobacz szczegółowe
informacje o warunkach korzystania.