Instrukcja do ćwiczeń - Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii
Wydział Farmaceutyczny z
Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej
Mikrobiologia ogólna
o
Biotechnologia medyczna II rok / I
Instrukcja do ćwiczeń
Temat: Metody hodowli drobnoustrojów. Metabolizm drobnoustrojów.
Źródła węgla i azotu wykorzystywane przez bakterie – cz. 1/cz.2
CZEŚĆ TEORETYCZNA
Pojęcie hodowli i kolonii bakteryjnej.
Hodowla czysta i mieszana. Szczepy referencyjne.
Sposoby wykonywania posiewów: posiew powierzchniowy, posiew redukcyjny, posiew kłuty.
Sporządzanie szeregu 10-krotnych rozcieńczeń.
Zasady hodowli statycznej, napowietrzanej, ciągłej i synchronicznej.
Hodowla beztlenowców – metody zapewnienia warunków beztlenowych.
Rodzaje pożywek i ich zastosowanie. Wymogi stawiane pożywkom bakteriologicznym.
Typy wzrostu na pożywkach jako cecha różnicująca.
Wymagania pokarmowe drobnoustrojów – podział drobnoustrojów ze względu na wykorzystywane
źródła węgla, energii oraz donatory protonów i elektronów.
10. Źródła azotu wykorzystywanego przez drobnoustroje. Czynniki wzrostowe.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA
II. Posiew redukcyjny:
II. Z hodowli na podłożu agar odżywczy wykonać posiewy redukcyjne bakterii:
·
·
·
·
ü E. coli na podłożu Endo i agarze laktozowym TTC
ü Ps. fluorescens na podłożu Kinga B
ü E. faecalis na agarze Slanetza-Bartleya i agarze z żółcią i eskuliną
ü Salmonella spp. na podłożu BGA i XLD
Płytki poddać 24-godzinnej inkubacji w temp. 37oC.
Ocenić wzrost i poprawność wykonanego posiewu redukcyjnego.
Dokonać obserwacji hodowli szczepów bakterii.
Opisać morfologię kolonii poszczególnych szczepów.
1
III. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej
· Pobrać za pomocą ezy materiał z 24-godz. hodowli E. coli na płytkach z agarem krwawym i przenieść
do probówek z solą fizjologiczną (0,85%) i przygotować zawiesinę, której gęstość optyczna, zmierzona
przy użyciu densytometru, wynosić będzie 0,125 (standard 0,5 według skali McFarlanda), co
odpowiada stężeniu komórek bakterii na poziomie 1,5 × 108 /ml.
Standard
(wg skali
McFarlanda)
0,5
1
2
3
4
5
6
7
Gęstość optyczna (OD) zawiesin bakteryjnych
Stężenie komórek bakterii
x 108 / ml
1,5
3
6
9
12
15
18
21
OD (550 nm)
0,125
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
1,75
IV. Sporządzanie szeregu dziesięciokrotnych rozcieńczeń, posiew powierzchniowy i wgłębny:
· Z przygotowanej zawiesiny sporządzić szereg rozcieńczeń w roztworze soli fizjologicznej od 10-1 do
10-7, przenosząc po 1 ml zawiesiny do probówki z 9 ml soli fizjologicznej (zgodnie ze schematem).
· W celu wykonania posiewu powierzchniowego (metoda płytek tartych/mazanych), z trzech ostatnich
rozcieńczeń (10-5 - 10-7) pobrać pipetą po 0,1 ml zawiesiny i przenieść na powierzchnię płytki z
agarem odżywczym. Przy pomocy sterylnej głaszczki rozprowadzić inoculum po całej powierzchni
podłoża. Odczekać do momentu wchłonięcia inoculum, a następnie poddać płytki 24-godzinnej
inkubacji w temp. 37oC.
· W celu wykonania posiewu wgłębnego (metoda płytek lanych), z trzech ostatnich rozcieńczeń (10-5 10-7) pobrać pipetą po 1 ml zawiesiny i przenieść do sterylnych płytek Petriego. Następnie zalać
inoculum ostudzoną pożywką agarową, wymieszać i pozostawić do zestalenia. Płytki poddać 24godzinnej inkubacji w temp. 37oC.
· Po okresie inkubacji policzyć na płytkach liczbę kolonii, sprawdzić poprawność wykonanego szeregu
rozcieńczeń i obliczyć liczbę bakterii w zawiesinie wyjściowej. Wynik podać w przeliczeniu na 1 ml.
Zawiesina wyjściowa
(rozcieńczenie 100)
9 ml
0,1 / 1 ml
ml
0,1 / 1 ml
ml
Posiew wgłębny (metoda płytek lanych)
0,1 / 1 ml
ml
0,1 / 1 ml
ml
0,1 / 1 ml
ml
Posiew powierzchniowy (metoda płytek tartych)
2