c-Kit pharmDx™ Nr kat. K1906 25 testów metodą manualną

c-Kit pharmDx™
Nr kat. K1906
25 testów metodą manualną
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Zestaw c-Kit pharmDx™ jest przeznaczony do jakościowych testów immunohistochemicznych (IHC) w celu
detekcji ekspresji białka c-kit/antygenu CD117 (białka c-kit) w tkankach prawidłowych i nowotworowych,
standardowo utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie do badania histopatologicznego.
Przeciwciała królicze w zestawie c-Kit pharmDx™ pozwalają na swoistą detekcję białka c-kit w komórkach
wykazujących ekspresję antygenu CD117.
Zestaw c-Kit pharmDx™ jest stosowany pomocniczo w diagnostyce róŜnicowej guzów stromalnych przewodu
pokarmowego (GIST). Po zdiagnozowaniu guzów GIST wyniki z zestawu c-Kit pharmDx moŜna pomocniczo
stosować do identyfikacji pacjentów klasyfikujących się do leczenia preparatem Gleevec™/Glivec® (mesylan
imatinibu).
Wyniki z barwień hematoksyliną i eozyną (H+E) oraz panelu przeciwciał moŜna pomocniczo stosować
w diagnostyce róŜnicowej guzów GIST. Interpretacja wyniku musi być dokonana z uwzględnieniem kontekstu
klinicznego, kontroli oraz wyników innych metod diagnostycznych przez wykwalifikowanego patologa.
Uwaga: Diagnoza guzów GIST oraz wybór sposobu leczenia Gleevec/Glivec nie powinny opierać się jedynie
na wynikach tego testu. Nie uzyskano ujemnego odczynu c-kit dla pacjentów, u których
zdiagnozowano guza GIST, leczonych lekiem z zastosowaniem preparatu Gleevec/Glivec. Wynik
ujemny nie koniecznie wyklucza rozpoznania guza GIST, ani leczenia z zastosowaniem preparatu
Gleevec/Glivec1,2,3
Wszystkich pacjentów uczestniczących w próbach klinicznych leku Novartis Gleevec/Glivec wybierano
przy uŜyciu Protokołu Badania Klinicznego Novartis (NCTP, ang. Novartis Clinical Trial Protocol),
będącego przedmiotem badań. Odczynnik będący pierwotnym poliklonalnym przeciwciałem króliczym
przeciwko c-kit zastosowanym w protokole NCTP został zakupiony od Dako. Sposób produkcji,
oczyszczania i kontroli jakości odczynnika będącego pierwotnym poliklonalnym przeciwciałem c-Kit
pharmDx jest taki sam jak w przypadku odczynnika poliklonalnego przeciwko c-kit (NCTP).
Streszczenie
i informacje ogólne
Wprowadzenie
Protoonkogen c-kit, zwany równieŜ antygenem CD117 lub Stem Cell Factor Receptor (receptorem czynnika
komórek pnia), jest przezbłonowym białkiem receptorowym typu III o masie 145 kD o aktywności kinazy
tyrozynowej. Gen c-kit koduje receptor przezbłonowy o aktywności kinazy tyrozynowej, wykazujący
podobieństwo strukturalne do receptorów PDGF (czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego) typu A i B oraz do
receptora CSF (czynnika stymulującego kolonie) typu 1. UwaŜa się, Ŝe gen odgrywa istotną rolę w procesie
hematopoezy, spermatogenezy i melanogenezy. Białko c-kit zawiera domeny pozakomórkowe z pięcioma
pętlami przypominającymi strukturą immunoglobuliny, silnie hydrofobową domenę transbłonową oraz domenę
wewnątrzkomórkową wykazującą aktywność kinazy tyrozynowej. Domena wewnątrzkomórkowa jest
przedzielona wstawką kinazową na region wiąŜący ATP oraz domenę o aktywności fosfotransferazy. Po
aktywacji receptora następuje jego dimeryzacja, fosforylacja substratu i autofosforylacja, a następnie
internalizacja receptora, aktywacja kinaz białkowych i fosfolipaz oraz transkrypcja innych protoonkogenów.4
Wykazano, Ŝe szlak metaboliczny receptora kinazy tyrozynowej c-kit odgrywa duŜą rolę w procesie wzrostu
i progresji wielu rodzajów nowotworów złośliwych.5 Mutacje w obrębie genu c-kit mogą prowadzić do
niezaleŜnej od ligandu fosforylacji (aktywacji) kinazy tyrozynowej c-kit, co, jak się uwaŜa, określa podstawową
rolę w patogenezie m.in. guzów stromalnych przewodu pokarmowego.6
Diagnostyka róŜnicowa i rozpoznanie nowotworów podścieliska przewodu pokarmowego sprawiały dotychczas
spore trudności. W 2001 roku Agencja ds. śywności i Leków USA zaaprobowała stosowanie mesylanu
imatinibu (preparat Gleevec™, produkowany przez firmę Novartis z siedzibą w Bazylei w Szwajcarii) do
leczenia guzów stromalnych przewodu pokarmowego (GIST). Akceptacja została wydana na podstawie
badania klinicznego prowadzonego w grupie dorosłych pacjentów z guzami stromalnymi przewodu
pokarmowego, zakwalifikowanych do badania na podstawie potwierdzonej immunohistochemicznie ekspresji
białka c-kit (Protokół Badania Klinicznego Novartis), leczonych za pomocą mesylanu imatinibu.7
(111765-003)
Opisano trzy postaci morfologiczne GIST: postać wrzecionowatokomórkową, nabłonkowatokomórkową i
mieszaną. NiezaleŜnie od morfologii, w większości komórek nowotworowych GIST stwierdza się ekspresję
białka c-kit.8-11 NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w niewielkim odsetku nowotworów GIST nie stwierdza się ekspresji
białka c-kit. Dodatni wynik badania na obecność białka c-kit moŜe występować w przypadku stosunkowo
niewielkiej ilości innych rodzajów nowotworów – przerzutów czerniaka, mięsaka naczyniowego, mięsaka
Ewinga, mastocytoma, nasieniaka oraz drobnokomórkowego raka płuc. Nowotwory typu GIST zwykle wykazują
takŜe obecność kaldesmonu o duŜej masie cząsteczkowej, często wykazują obecność CD34 (60–80%)
i najczęściej nie wykazują obecności desminy ani białka S100.12
Swoistość
305757PL_001 s. 1/16
Poliklonalne przeciwciała królicze przeciwko c-kit otrzymano podając zwierzętom w iniekcji podskórnej peptyd
o długości 14 aminokwasów (pozycje 963–976 wewnątrzkomórkowego końca C’ białka c-kit) połączony
z tyreoglobuliną. Surowicę odpornościową oczyszczono poprzez swoiste związanie z antygenem przy uŜyciu
chromatografii AvidGel F z aktywowanym tiolem.
Stwierdzono, Ŝe niewielka liczba mięsaków tkanek miękkich daje dodatni odczyn w teście c-kit.6 Niektóre z tych
nowotworów (np. mięśniakomięsak gładkokomórkowy) badano na obecność ekspresji białka c-kit. W jednym
z badań porównywano test c-Kit pharmDx™ oraz Protokół Badania Klinicznego Novartis (NCTP) stosowany
w celu kwalifikacji pacjentów do badań klinicznych preparatu GleevecTM prowadzonych przez firmę Novartis.
W 2 z 28 przypadków uzyskano dodatni odczyn. Ten sam wynik uzyskano przy uŜyciu obu metod
diagnostycznych. Po absorpcji przeciwciał pierwotnych przez syntetyczny peptyd (koniec C białka c-kit
o długości 16 aminokwasów) odczyn dodatni został zniesiony. Tak więc na podstawie badania dwóch
mięsaków tkanek miękkich stwierdzono swoistą dodatnią reakcję przeciwciał pierwotnych stosowanych
w teście c-Kit pharmDx™ z białkiem c-kit.
Wewnętrzne badania z zastosowaniem zestawu c-Kit pharmDx wykazały ekspresję białka c-kit w róŜnych
komórkach prawidłowych. Do komórek tych zalicza się komórki przewodzików oraz mioepitelialne gruczołów
sutkowych, wypustki komórek Purkinjego, komórki blaszki właściwej okręŜnicy, nabłonek cewki nerkowych,
melanocyty warstwy podstawnej naskórka, komórki mioepitelialne gruczołów skóry, komórki jelitowych splotów
nerwowych (Cajala) jelita cienkiego oraz komórki tuczne. Reaktywność cytoplazmatyczna w granulocytach była
spowodowana przez aktywność endogennej peroksydazy i widoczna przy stosowaniu odczynnika do kontroli
ujemnej.
Odczynniki
Odczynnik o nr. katalogowym K1906 jest przeznaczony do odczynów wykonywanych metodą manualną.
Wyszczególnione substancje wystarczają na wykonanie 25 testów (25 preparatów od pacjentów i 10
preparatów kontrolnych inkubowanych z przeciwciałami przeciwko białku c-kit i 25 preparatów inkubowanych
z odpowiadającym odczynnikiem do kontroli ujemnej Negative Control Reagent).
Liczbę testów obliczono na podstawie badania przy uŜyciu protokołu manualnego dla testu c-Kit pharmDx™,
z zastosowaniem odczynników gotowych do uŜycia.
Materiał znajdujący się w zestawie wystarcza na wykonanie co najwyŜej 10 pojedynczych serii oznaczeń.
Dostarczane materiały
Ilość
1x4 mL
Opis
Przeciwciała poliklonalne IgG pochodzenia króliczego c-Kit pharmDx™
Poliklonalne przeciwciała IgG pochodzenia króliczego przeciw ludzkiemu białku c-kit
w buforze Tris-HCl zawierającym białko stabilizujące i roztwór azydku sodu o stęŜeniu
0,015 mol/L.
1x4 mL
Odczynnik do kontroli ujemnej – IgG pochodzenia króliczego
Poliklonalne przeciwciała IgG pochodzenia króliczego o stęŜeniu równym lub większym od
stęŜenia przeciwciał dodatnich przeciwko c-kit w buforze Tris-HCl zawierającym białko
stabilizujące i roztwór azydku sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
2x5
szkiełek
Preparaty kontrolne c-Kit pharmDx™
Na kaŜdym szkiełku znajdują się fragmenty dwóch linii komórek mysich (+) i ludzkich (-),
odwirowanych, utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie, reprezentujące
umiarkowany poziom ekspresji białka c-kit i brak ekspresji białka c-kit. Nasilenie odczynu
wirowanych komórek wynosi 2+ i 0.
(111765-003)
305757PL_001 s. 2/16
Zasady procedury
W składu zestawu IHC c-Kit pharmDx™ wchodzą przeciwciała poliklonalne i szkiełka kontrolne konieczne do
przeprowadzenia całej procedury barwienia IHC dla preparatów utrwalanych w formalinie i zatapianych
w parafinie. W zastosowanym zestawie po zakończeniu inkubacji pierwotnych przeciwciał poliklonalnych
przeciw ludzkiemu białku c-kit optymalne jest stosowanie gotowego systemu wizualizacji wykonanego
z wykorzystaniem dekstranu. W skład odczynnika wchodzą cząsteczki wtórnych przeciwciał kozich
skierowanych przeciw antygenom króliczym oraz cząsteczki peroksydazy chrzanowej połączone ze wspólnym
szkieletem polimerowym dekstranu. W ten sposób wyeliminowano konieczność sekwencyjnego stosowania
przeciwciała wtórnego i koniugatu peroksydazy. Po dodaniu chromogenu następuje reakcja enzymatyczna,
której produktem jest widoczny produkt, zlokalizowany w miejscu występowania antygenu. Następnie moŜna
wykonać barwienie kontrastowe i nakryć preparat szkiełkiem nakrywkowym. Wynik reakcji ocenia się
w mikroskopii świetlnej. Dostarczane są równieŜ dwa preparaty kontrolne zawierające utrwalane i zatapiane
w parafinie komórki mysie i ludzkie o nasileniu odczynu odpowiednio 2+ i 0. Preparaty są przeznaczone do
kontroli jakości i działania zestawu odczynnikowego.
Materiały wymagane,
ale niedostarczane
Test IHC c-Kit pharmDx™ został zweryfikowany przy uŜyciu następujących odczynników barwiących
produkowanych przez firmę Dako:
Wash Buffer (nr kat. S3006)
Dual Endogenous Enzyme Block (nr kat. S2003)
Target Retrieval Solution (nr kat. S1699 lub S1700)
EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (nr kat. K4002 lub K4003)
DAB+ (nr kat. K3467 lub K3468)
Uwaga: Aby zapewnić właściwe wyniki barwienia, z zestawem c-Kit pharmDx™ naleŜy stosować wyłącznie
wymienione odczynniki. Nie prowadzono weryfikacji metod odbiegających od zalecanego protokołu.
Pozostałe materiały wymagane do wykonania oznaczenia c-Kit pharmDx™:
Hematoksylina, roztwór alkoholowy lub wodny, np. Dako Hematoxylin (nr kat. S3301 lub S3302)
Szkiełka nakrywkowe
Prawidłowo skalibrowana łaźnia wodna umoŜliwiająca utrzymanie temperatury 95–99°C lub prawidłowo
skalibrowany szybkowar umoŜliwiający podgrzanie do temperatury 125°C.
Woda destylowana lub dejonizowana (woda do odczynników laboratoryjnych)
Suszarka umoŜliwiająca utrzymanie temperatury 56–60°C
Etanol absolutny i roztwór o stęŜeniu 95%
Mikroskop świetlny (wzmocnienie obiektywu 4x–40x)
Środki do zatapiania, np. Dako Faramount (nr kat. S3025), Dako Glycergel (nr kat. C0563)
lub Dako Ultramount (nr kat. S1964)
Tkanki o dodatnim i ujemnym odczynie, do stosowania w charakterze próby kontrolnej (zobacz część Kontrola
jakości)
Szkiełka podstawowe Fisher SuperFrost Plus, szkiełka pokryte poli-L-lizyną, szkiełka elektrostatyczne,
lub Dako Silanized Slides (nr kat. S3003) (patrz część Przygotowanie materiału)
Naczynia lub kąpiele do barwienia
Minutnik (pomiar w odstępach 2–30 minut)
Butelka z roztworem płuczącym
Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu
Pipeta 1 mL
Komora nawilŜająca
Uwaga: Wszystkie odczynniki dostępne w zestawie lub oddzielnie. np. Dako Wash Buffer (nr kat. S3006) są
specjalnie przeznaczone do stosowania w opisywanym teście. Warunkiem działania testu zgodnie ze
specyfikacją jest niestosowanie zamienników.
Środki ostroŜności
(111765-003)
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. Do stosowania w diagnostyce in vitro.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3
z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do przepłukiwania, aby
uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Tak jak w wypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, podczas pracy z próbkami
i odczynnikami naleŜy stosować odpowiednie procedury.
4. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji, temperatury lub metod moŜe powodować
błędne wyniki badania.
5. Nie naleŜy zastępować przeciwciał pierwotnych ani odczynników kontroli ujemnej przeciwciałami
pierwotnymi lub odczynnikami kontroli ujemnej naleŜącymi do odmiennych partii produkcyjnych (numery
partii podano na etykietach fiolek), bądź pochodzącymi od róŜnych producentów. Mogłoby to spowodować
uzyskanie błędnych wyników.
6. Odczynniki wchodzące w skład zestawu są dostarczane w optymalnych rozcieńczeniach. nie zaleca się
zwiększania rozcieńczenia z uwagi na moŜliwość utraty odczynu antygenów. W razie zmian któregokolwiek
z parametrów konieczna jest weryfikacja przez UŜytkownika.
7. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą
bądź oczami.
8. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i ogólnokrajowymi.
9. Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie.
305757PL_001 s. 3/16
ZagroŜenia i warunki bezpiecznego stosowania
DAB Chromogen*
Zawiera: 1-5% czterochlorek bifenylo-3,3’,4,4’-tetrailotetraamonowy / Symbol zagroŜenia: Szkodliwe
R 40
Ograniczone dowody działania rakotwórczego.
R43
MoŜe powodować uczulenie w kontakcie ze skórą.
R68
Istnieje ryzyko nieodwracalnych skutków.
S35
Niniejszy materiał wraz z opakowaniem musi być usuwany z zachowaniem zasad
bezpieczeństwa.
S 36/37
NaleŜy stosować odpowiednią odzieŜ i rękawice ochronne.
Jako zasadę naleŜy przyjąć zakaz pracy z produktem dla osób w wieku poniŜej 18 lat.
UŜytkowników naleŜy starannie poinstruować co do właściwych procedur pracy,
niebezpiecznych właściwości produktu i środków ostroŜności. (Zgodnie z dyrektywą 94/33/WE
Unii Europejskiej). Dodatkowe informacje zawiera Karta Charakterystyki Substancji
Niebezpiecznej.
(*DAB Chromogen to substancja wymagana, ale niedostarczana z tym zestawem).
Przechowywanie
Zestaw c-Kit pharmDx™ naleŜy przechowywać w temperaturze 2–8°C.
Preparaty kontrolne muszą być równieŜ przechowywane w temperaturze 2–8°C.
Nie naleŜy uŜywać zestawu po upływie daty waŜności wydrukowanej na zewnętrznej części opakowania
zestawu. PoniewaŜ nie istnieją ewidentne objawy wskazujące na utratę trwałości produktu, równocześnie
z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać dodatni i ujemny odczyn kontrolny. JeŜeli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na wkładce informacyjnej do opakowania,
UŜytkownik powinien sprawdzić ich jakość.13
Oświadczenie dot.
jakości
Odczynniki zestawu c-Kit pharmDx zostały poddane kontroli jakości metodami immunohistochemicznym w
następujących warunkach: odmaskowanie antygenu w szybkowarze Pascal (nr kodu S2800) w temperaturze
125°C przez 30 sekund, ochłodzenie do temperatury 9 0°C, a nast ępnie poddanie działaniu systemu detekcji
EnVision+ Rabbit, HRP.
Przygotowanie
próbek
Materiał biopsyjny naleŜy traktować tak, by zachować materiał tkankowy do wykonania odczynów IHC. Dla
wszystkich preparatów naleŜy stosować standardowe metody przeprowadzania tkanek.14
Skrawki zatapiane w parafinie
Do badania moŜna stosować tkanki utrwalane w formalinie i zatapiane w parafinie. Nie przeprowadzono
weryfikacji innych środków utrwalających, a ich stosowanie mogłoby spowodować uzyskanie błędnych
wyników. Preparaty biopsyjne naleŜy pociąć na bloczki o grubości 3 lub 4 mm i utrwalać przez okres właściwy
dla danej substancji utrwalającej. Następnie tkanki poddaje się przepojeniu i oczyszczeniu, stosując serię
kąpieli alkoholowych i ksylenowych, po czym przepaja płynną parafiną. Temperatura parafiny nie powinna
przekraczać 60°C. Wła ściwie utrwalone i zatopione bloczki tkanek wykazujących ekspresję białka c-kit nadają
się do sporządzania preparatów po dowolnym okresie przechowywania, o ile były utrzymywane w chłodnym
miejscu, w temperaturze (15–25°C). 14,15
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach 3–5 µm. Wykonane skrawki tkankowe mogą zostać
umieszczone na szkiełkach mikroskopowych Fisher SuperFrost Plus, Dako Silanized (nr kat. S3003),
szkiełkach z ładunkiem elektrostatycznym lub pokrytych warstwą poli-L-lizyny, a następnie umieszczone w
stojaku suszarki. Stojaki na szkiełka naleŜy osuszyć, uderzając o pochłaniający ręcznik w celu usunięcia wody
znajdującej się pod warstwą parafiny i na szkiełku, a następnie suszyć w temperaturze pokojowej przez jedną
godzinę. Następnie stojak wraz z preparatami naleŜy umieścić na jedną godzinę
w cieplarce, w temperaturze 56–60°C. Ewentualne poz ostałości wody po wyjęciu preparatów z cieplarki naleŜy
usunąć otrzepując o pochłaniający ręcznik, a następnie znów suszyć w cieplarce przez jedną godzinę.
Po wyjęciu z cieplarki, preparaty naleŜy przechowywać w temperaturze pokojowej aŜ do czasu ich schłodzenia
i stwardnienia parafiny. Aby zachować antygenowość, skrawki tkankowe zatopione na szkiełkach powinny
zostać poddane barwieniu w ciągu 2 miesięcy od sporządzenia skrawków, o ile skrawki były przechowywane
w temperaturze pokojowej (20–25°C). Szczegółowe inf ormacje dotyczące przygotowywania próbek
przedstawiono w podręczniku Dako „Immunochemical Staining Methods”16 oraz 14. i 15. pozycji piśmiennictwa.
Z uwagi na brak odpowiednich badań, nie zaleca się stosowania opisywanego testu w odwapnionych tkankach.
Preparaty słuŜące do oceny c-kit i weryfikacji obecności nowotworu naleŜy przygotowywać w tym samym
czasie. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5 szkiełek – jednego do badania obecności nowotworu, dwóch do
oceny białka c-kit oraz dwóch szkiełek zapasowych.
Przygotowanie
odczynników
Przed przystąpieniem do barwienia naleŜy przygotować następujące odczynniki:
Target Retrieval Solution (nr kat. S1699)
Przygotować wystarczającą ilość roztworu Target Retrieval Solution, rozcieńczając roztwór wodą destylowaną
lub dejonizowaną (wodą do odczynników laboratoryjnych) w stosunku 10 x 1:10, dla kolejnych etapów
oznaczenia. Po uŜyciu naleŜy usunąć roztwór Target Retrieval Solution.
Uwaga: Roztwór Dako Target Retrieval Solution (nr kat. S1700) nie wymaga rozcieńczenia.
(111765-003)
305757PL_001 s. 4/16
Wash Buffer Solution (nr kat. S3006)
Przygotować wystarczającą ilość roztworu bufora płuczącego Wash Buffer, rozcieńczając odczynnik Wash
Buffer wodą destylowaną lub dejonizowaną (wodą do odczynników laboratoryjnych) w stosunku 10 x 1:10, dla
kolejnych etapów oznaczenia. Niewykorzystany roztwór przechowywać w temperaturze 2–8°C nie dłu Ŝej niŜ
przez 7 dni. W przypadku zmętnienia bufor nie nadaje się do uŜycia.
Substrate-Chromogen Solution (DAB+) (nr kat. 3467 lub K3468)
Roztwór naleŜy dokładnie wymieszać przed uŜyciem. Wytrącanie się osadu nie wpływa na jakość odczynu.
Przygotowanie roztworu DAB+ Substrate-Chromogen Solution: dodać 1 kroplę roztworu Liquid DAB+
Chromogen do jednego mL roztworu DAB+ Substrate Buffer i wymieszać. Odrzucić niewykorzystany roztwór.
Tak przygotowany roztwór DAB+ zachowuje trwałość przez ok. 5 dni, o ile jest przechowywany w temperaturze
2–8°C.
WaŜna uwaga: Roztwór Liquid DAB+ Chromogen w butelce moŜe przyjmować odcienie od przejrzystego do
jasnofioletowo-brązowego. Barwa roztworu nie wpływa na wydajność produktu. Stosować rozcieńczenie
zgodnie z opisem przedstawionym powyŜej. Dodanie nadmiernej ilości roztworu Liquid DAB+ Chromogen do
buforu DAB+ Substrate Buffer spowoduje pogorszenie jakości dodatniego odczynu.
Środek do zatapiania
Zalecane są bezwodne środki do zatapiania, np. Dako Ultramount (nr kat. S1964). Dopuszczalne jest równieŜ
stosowanie wodnych środków do zatapiania, jak Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (nr kat.
S3025) lub Dako Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563). Przed uŜyciem naleŜy przeprowadzić preparat
Glycergel w stan płynny, ogrzewając do temperatury ok. 40 (±5)°C.
Wykonanie odczynu
metodą manualną
Uwagi dotyczące procedury
Przed przystąpieniem do wykonania odczynu UŜytkownik powinien uwaŜnie przeczytać podane instrukcje
i zaznajomić się ze wszystkimi elementami zestawu (zobacz część Środki ostroŜności).
Przed przystąpieniem do wykonania odczynu wszystkie odczynniki naleŜy doprowadzić do temperatury
pokojowej (20–25°C). Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze
pokojowej.
Podczas wykonywania barwienia nie moŜna dopuścić do wysychania skrawków tkankowych. Wysuszone
skrawki tkankowe mogą powodować nasilenie nieswoistego odczynu. Aby uniknąć wysuszenia preparatów
tkankowych, naleŜy umieścić szkiełka w komorze nawilŜającej.
Uwaga: Odczynniki i instrukcje dostarczane z systemem opracowano w celu uzyskania optymalnych wyników
z zalecanymi odczynnikami i materiałami. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie
czasu lub temperatury inkubacji moŜe spowodować uzyskanie błędnych lub sprzecznych wyników.
Odparafinowanie i ponowne uwadnianie
Przed przystąpieniem do wykonania odczynu naleŜy odparafinować preparaty w celu usunięcia środka
zatapiającego i ponownego uwodnienia. NaleŜy unikać niecałkowitego usunięcia parafiny poniewaŜ
pozostałości środka zatapiającego powodują nasilenie nieswoistego odczynu.
KROK 1. Umieścić preparaty w kąpieli ksylenowej i inkubować przez 5 (±1) minut. Zmienić kąpiel i jednokrotnie
powtórzyć procedurę.
KROK 2. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w etanolu absolutnym na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel
i jednokrotnie powtórzyć procedurę.
KROK 3. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w roztworze etanolu o stęŜeniu 95% na 3 (±1) minuty.
Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę.
KROK 4. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w wodzie do odczynników laboratoryjnych na 5 (±1)
minut.
KROK 5. Strząsnąć nadmiar buforu i umieścić preparaty w buforze płuczącym Wash Buffer. Rozpocząć
wykonywanie odczynu zgodnie z opisem w części „Wykonanie odczynu”.
Po wykonaniu barwienia 40 preparatów naleŜy zmienić roztwór ksylenu i alkoholu.
MoŜna stosować ksylen lub substytuty ksylenu, np. preparat Histoclear™.
Odmaskowanie antygenu
Zalecana procedura: łaźnia wodna
KROK 1. Napełnić naczynia do barwienia (np. naczynia Coplin) rozcieńczonym roztworem Target Retrieval
Solution (zobacz część Przygotowanie odczynników). Umieścić naczynia do barwienia z roztworem
Target Retrieval Solution w łaźni wodnej. Ponownie doprowadzić roztwór Target Retrieval Solution i
kąpiel wodną do temperatury 95–99°C (nie doprowadzi ć do wrzenia). Przykryć naczynia w celu
osiągnięcia stabilnej temperatury i uniknięcia parowania.
KROK 2. Zanurzyć odparafinowane skrawki o temperaturze pokojowej w podgrzanym roztworze Target
Retrieval Solution znajdującym się w naczyniach do barwienia. Ponownie podgrzać łaźnię wodną
i roztwór Target Retrieval Solution do uzyskania stabilnej temperatury 95–99°C. Inkubowa ć przez 20
(±1) minut w temperaturze 95–99°C.
(111765-003)
305757PL_001 s. 5/16
KROK 3. Wyjąć naczynie zawierające preparaty z łaźni wodnej. Odczekać przez 20 (±1) min w temperaturze
pokojowej, aŜ nastąpi schłodzenie preparatów w roztworze Target Retrieval Solution.
KROK 4. Zlać roztwór Target Retrieval Solution i przepłukać skrawki buforem płuczącym Wash Buffer (zobacz
część Przygotowanie odczynników).
KROK 5. Aby zapewnić optymalną wydajność, po zakończeniu odmaskowania antygenu, a przed
rozpoczęciem barwienia, naleŜy zanurzyć skrawki w buforze płuczącym Wash Buffer na 5 (±1) minut.
Odmaskowanie antygenu
Szybkowar (30 sekund w 125°C)
W celu zapewnienia powtarzalności wyników barwienia bardzo waŜne jest zachowanie spójności
w protokole odmaskowania antygenów. UŜywany szybkowar musi być w stanie osiągnąć i utrzymać
temperaturę 125°C a przy ka Ŝdym barwieniu w szybkowarze powinna znajdować się taka sama
całkowita ilość cieczy (roztwór Target Retrieval Solution i woda na tacy szybkowaru), jak równieŜ taka
sama całkowita liczba preparatów.
Optymalny protokół:
KROK 1. Przed kaŜdym barwieniem dodać odpowiednią ilość wody do odczynników laboratoryjnych na tacę
szybkowaru (500 mL lub zgodnie z wytycznymi producenta).
KROK 2. Napełnić oba plastikowe termoodporne pojemniki do barwienia, w których zostanie umieszczony
magazynek na 24 preparaty, 250 mL przygotowanym roztworem Target Retrieval Solution (zobacz
część Przygotowanie odczynników).
KROK 3. Zanurzyć odparafinowane skrawki o temperaturze pokojowej w roztworze Target Retrieval Solution
znajdującym się w pojemnikach do barwienia. Uwaga: W celu zapewnienia powtarzalności podczas
kaŜdego barwienia w szybkowarze naleŜy umieścić 48 preparatów; jeŜeli przetwarzanych będzie
mniej niŜ 48 szkiełek z preparatami, magazynki do barwienia naleŜy wypełnić pustymi szkiełkami;
jeŜeli przetwarzane będą 24 preparaty lub mniej, aby zaoszczędzić roztwór Target Retrieval Solution,
drugi pojemnik do barwienia moŜna napełnić 250 mL wody.
STEP 4. Umieścić dwa pojemniki do barwienia w szybkowarze i szczelnie zamknąć pokrywę.
STEP 5. Nastawić temperaturę w szybkowarze na 125°C; preparaty inkubowa ć w temperaturze 125°C przez
30 sekund. Przed otwarciem szybkowar pozostawić do schłodzenia na 30 minut, bez obniŜania
ciśnienia.
STEP 6. Przed otwarciem szybkowaru zredukować ciśnienie. Wyjąć pojemniki do barwienia, zlać roztwór
Target Retrieval Solution i przepłukać skrawki buforem płuczącym Wash Buffer lub wodą do
odczynników laboratoryjnych.
KROK 7. Po zakończeniu odmaskowania antygenu, a przed rozpoczęciem barwienia, naleŜy zanurzyć skrawki
w buforze płuczącym Wash Buffer na 5 (±1) minut.
Uwaga: Roztwór Target Retrieval Solution jest przeznaczony do jednokrotnego stosowania. Nie uŜywać
ponownie.
Przebieg barwienia metodą manualną
KROK 1. Dual Endogenous Enzyme Block (nr kat. S2003)
Strząsnąć nadmiar wody. Posługując się chusteczką niepozostawiającą nitek ostroŜnie otrzeć
szkiełko wokół preparatu tak, by usunąć pozostałości płynu i utrzymywać odczynniki w obszarze
zgodnym z zaleceniami.
Nanieść taką ilość odczynnika Dual Endogenous Enzyme Block, aby przykryć preparat [minimum 3
krople (100µL)].
Inkubować przez 5 (±1) minut.
Delikatnie przepłukać wodą do odczynników laboratoryjnych z butelki. Nie naleŜy kierować strumienia
wody bezpośrednio na preparat, gdyŜ moŜe to spowodować jego zmycie ze szkiełka.
Umieścić w kąpieli ze świeŜym buforem Wash Buffer na 5 (±1) minut.
KROK 2. Przeciwciała pierwotne lub odczynnik do kontroli ujemnej
Aby uniknąć wysuszenia tkanek, na czas inkubacji przeciwciał pierwotnych i odczynnika do kontroli
ujemnej oraz znakowanego polimeru naleŜy umieścić preparaty w komorze nawilŜającej.
Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio.
Nanieść tyle kropli roztworu przeciwciał pierwotnych lub odczynnika kontroli ujemnej, by zakryć
próbkę
(minimum 3 krople [100µL]).
Inkubować przez 30 (±1) minut w komorze nawilŜacza.
Przemyć preparaty tak jak podczas 1. kroku.
KROK 3. EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (nr kat. K4002 lub K4003)
Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio.
Nanieść taką ilość znakowanego polimeru, by preparat został zakryty (minimum 3 krople [100 µL]).
Inkubować przez 30 (±1) minut w komorze nawilŜacza.
Przemyć preparaty tak jak podczas 1. kroku.
(111765-003)
305757PL_001 s. 6/16
KROK 4. DAB+ Substrate-Chromogen Solution (nr kat. K3467 lub K3468)
Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio.
Nanieść roztwór substratu–chromogenu DAB+ w takiej ilości by przykryć preparat.
(minimum 3 krople (100 µL)].
Inkubować przez 10 (±1) minut.
Delikatnie przepłukać wodą do odczynników laboratoryjnych z butelki. Nie naleŜy kierować strumienia
wody bezpośrednio na preparat, gdyŜ moŜe to spowodować jego zmycie ze szkiełka.
Umieścić odpady roztworu DAB+ Substrate-Chromogen w pojemniku na materiały niebezpieczne
w celu właściwego usunięcia.
Umieścić w kąpieli z wody destylowanej na 2–5 minut.
Przejść do etapów Barwienie kontrastowe i zatapianie.
Barwienie
kontrastowe
(instrukcje dla
hematoksyliny)
Barwny produkt końcowy reakcji barwienia jest nierozpuszczalny w alkoholu i wodzie. MoŜna stosować
hematoksylinę, roztwór alkoholowy lub wodny, np. Dako Hematoxylin (nr kat. S3301 — metoda automatyczna
lub S3302 — metoda ręczna). Nie stosować regresyjnego barwienia kontrastowego.
KROK 1. Zanurzyć preparaty w kąpieli z roztworu hematoksyliny. Inkubować przez 2–5 minut, w zaleŜności od
stęŜenia stosowanego roztworu hematoksyliny.
KROK 2. OstroŜnie przepłukać wodą do odczynników laboratoryjnych. NaleŜy zadbać, by pozostałości
hematoksyliny zostały dokładnie wypłukane.
Uwaga: Zdecydowanie zaleca się stosowanie preparatu Dako Hematoxylin (nr kat. S3302). Po trzyminutowym
okresie inkubacji, w wyniku barwienia kontrastowego powstaje końcowy produkt reakcji
o barwie jasnofioletowej lub niebieskiej, niezakłócający swoistego odczynu immunologicznego. Silne barwienie
kontrastowe moŜe maskować słabą ekspresję białka c-kit/CD117.
KROK 3. OstroŜnie przepłukiwać wodą do odczynników laboratoryjnych przez 2–5 minut.
Zatapianie preparatu
Zalecane są bezwodne środki do zatapiania, np. Dako Ultramount (nr kat. S1964). Dopuszczalne jest równieŜ
stosowanie wodnych środków do zatapiania, jak Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (nr kat.
S3025) lub Dako Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563). Przed uŜyciem naleŜy przeprowadzić preparat
Glycergel w stan płynny, ogrzewając do temperatury ok. 40 (±5)°C.
Uwaga: Zaleca się odczytanie wyników barwienia w ciągu sześciu tygodni od wykonania barwienia. Jednak
w zaleŜności między innymi od wymienionych czynników, do których naleŜą materiały i sposoby barwienia
kontrastowego i zatapiania oraz warunki przechowywania preparatów, moŜe nastąpić zblaknięcie. Aby
ograniczyć blaknięcie, naleŜy przechowywać preparaty w zaciemnionym miejscu, w temperaturze pokojowej
(20–25°C).
Kontrola jakości
Stosowanie w laboratorium UŜytkownika innych niŜ zalecane metod utrwalania, przeprowadzania i zatapiania
tkanek moŜe spowodować istotne róŜnice wyników, wymagające regularnego wykonywania dodatkowej
wewnętrznej kontroli jakości, niezaleŜnie od standardowych załączonych preparatów kontroli jakości Dako. W
USA naleŜy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi kontroli jakości, wydanymi przez Kolegium
Patologów Amerykańskich jako Program certyfikacji immunohistochemicznej (College of American Pathologists
[CAP]: Certification Program for Immunohistochemistry). Dodatkowe informacje przedstawiono w dokumencie
Kontrola jakości CLIS dla zatwierdzonych wytycznych dot. immunocytochemii (CLIS Quality Assurance for
Immunocytochemistry Approved Guideline)17 oraz pozycjach piśmiennictwa 18–21.
Kontrolne szkiełka mikroskopowe c-Kit pharmDx™ (w zestawie)
KaŜdy z dostarczanych preparatów kontrolnych zawiera dwa skupienia odwirowanych komórek pochodzących
z mysich (+) i ludzkich (-) linii komórkowych, utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, o nasileniu
odczynu 2+ i 0. Dla kaŜdego odczynu naleŜy wykonać barwienie jednego preparatu kontrolnego. Ocena
preparatów kontrolnych linii komórkowych Dako świadczy o waŜności serii odczynów. Preparatów kontrolnych
nie naleŜy uŜywać do interpretacji wyników pacjenta.
Tkanka do dodatniej próby kontrolnej
Preparaty kontrolne naleŜy sporządzić ze świeŜych materiałów sekcyjnych, biopsyjnych lub chirurgicznych,
moŜliwie szybko utrwalonych i zatopionych w sposób analogiczny do próbki (próbek) pochodzących od
pacjenta. Wynik dodatniej kontroli potwierdza właściwe przygotowanie tkanek i prawidłową technikę barwienia.
Dla wszystkich serii odczynów i dla kaŜdego rodzaju warunków badania naleŜy uwzględnić jedną dodatnią
kontrolę tkankową.
Tkanki stosowane jako dodatnie próby kontrolne powinny dawać słaby odczyn dodatni, pozwalający na
wykrywanie niewielkich zmian czułości przeciwciał pierwotnych. Preparaty kontrolne dostarczane
z opisywanym zestawem lub preparaty przeprowadzane w sposób odmienny od próbek pochodzących od
pacjenta pozwalają wyłącznie na weryfikację działania odczynników; preparaty kontrolne nie nadają się do
weryfikacji prawidłowego przygotowania tkanek.
(111765-003)
305757PL_001 s. 7/16
Znane dodatnie kontrole tkankowe powinny być stosowane wyłącznie w celu monitorowania jakości badanych
tkanek i odczynników testowych, a NIE pomocniczo do formułowania swoistych rozpoznań próbek pochodzących
od pacjentów. JeŜeli nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu w preparatach dodatnich kontroli tkankowych
naleŜy uznać, Ŝe wyniki preparatów testowych są niewaŜne.
Do prawidłowych komórek, które mogą być stosowane do uzyskania słabo dodatniego odczynu c-kit naleŜą
melanocyty warstwy podstawnej naskórka, komórki mioepitelialne gruczołów skóry oraz komórki nabłonkowe
i mioepitelialne gruczołów sutkowych. Komórki jelitowych splotów nerwowych (Cajala) i komórki tuczne w jelitach
stanowią skuteczne kontrole wewnętrzne.
Tkanka do ujemnej próby kontrolnej
NaleŜy stosować ujemną kontrolę za pomocą tkanki dającej odczyn ujemny, w której nie występuje białko c-kit.
Dla kaŜdej serii odczynów tkanka powinna zostać utrwalona, przeprowadzona i poddana zatapianiu w sposób
podobny jak próbka (próbki) pochodząca od pacjenta, w celu weryfikacji swoistości przeciwciał pierwotnych i
identyfikacji obecności odczynu tła. W charakterze wewnętrznej kontroli ujemnej moŜna wykorzystywać róŜne
rodzaje komórek pochodzące z większości tkanek. Preparaty do kontroli ujemnej powinny zostać zweryfikowane
przez UŜytkownika.
JeŜeli w badaniu tkanek stanowiących ujemną próbę kontrolną uzyskuje się swoisty odczyn, wyniki uzyskane dla
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy uznać za niewaŜne. Kardiomiocyty zalicza się do tkanek, które mogą
być wykorzystane w charakterze ujemnych kontroli. Komórki zrazików trzustkowych dają równieŜ ujemny odczyn
c-kit, natomiast komórki nabłonka przewodu Ŝółciowego – odczyn dodatni.
Nieswoisty odczynnik do kontroli ujemnej
W celu oceny występowania odczynu nieswoistego i ułatwienia interpretacji swoistego odczynu w miejscach
występowania antygenów, dla kaŜdego wycinka pochodzącego od pacjenta, w miejsce przeciwciał pierwotnych
naleŜy stosować odczynnik Negative Control Reagent. Czas inkubacji odczynnika Negative Control Reagent
powinien odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych.
Jeśli do skrawków seryjnych uŜywane są panele przeciwciał, obszary jednego szkiełka dające odczyn ujemny
mogą słuŜyć jako kontrola ujemna/wiązania nieswoistego dla innych przeciwciał.
Weryfikacja odczynu
Przed pierwszym zastosowaniem przeciwciał lub systemu do wykonywania odczynów UŜytkownik powinien
zweryfikować swoistość przeciwciał. W tym celu naleŜy wykonać testy serii wewnątrzlaboratoryjnych tkanek
kontrolnych o znanej charakterystyce odczynów w zakresie IHC, odpowiadających tkankom o dodatnim i
ujemnym odczynie. NaleŜy zapoznać się z procedurami kontroli jakości omówionymi wcześniej w tej sekcji ulotki
oraz z wymaganiami określonymi w dokumentach CAP Certification Program for Immunohistochemistry oraz
CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline.17 PowyŜsze procedury kontroli jakości
naleŜy powtarzać z kaŜdą nową partią przeciwciał i za kaŜdym razem, gdy wystąpi zmiana w parametrach
odczynu. Do weryfikacji odczynu moŜna stosować preparaty guzów stromalnych przewodu pokarmowego (GIST)
o znanych odczynach c-kit oraz tkanki dające ujemny odczyn.
Tabela 1: Cel codziennej kontroli jakości
Rodzaj tkanki:
utrwalona i przeprowadzona
identycznie jak próbki pochodzące
od pacjenta
Swoiste przeciwciała i system
detekcji
Tło:
nieswoiste przeciwciała królicze –
odczynnik do kontroli ujemnej
Preparat kontrolny dostarczany
przez firmę Dako.
Wyłącznie odczyn z preparatami
kontrolnymi. Ocena preparatów
kontrolnych linii komórkowych Dako
świadczy o waŜności serii odczynów.
Kontrola dodatnia: tkanki lub
komórki zawierające antygen
docelowy (mogą występować w
tkankach pacjenta). Idealna próba
kontrolna jest tkanką wykazującą
słabo dodatni odczyn i moŜliwie
największą czułość na utratę
własności przez przeciwciała lub
antygeny.
Kontrola wszystkich etapów badania. Detekcja nieswoistego odczynu tła.
Weryfikacja odczynników i procedur
stosowanych do odczynu kit.
Kontrola ujemna: tkanki lub komórki Detekcja niepoŜądanej reakcji
Detekcja nieswoistego odczynu tła.
z oczekiwanym ujemnym wynikiem krzyŜowej przeciwciał z komórkami
odczynu (mogą występować w
lub strukturami komórkowymi.
tkankach pacjenta lub dodatniej
kontroli tkankowej).
Interpretacja
(111765-003)
Tkanka pochodząca od pacjenta.
Detekcja odczynu swoistego.
Detekcja nieswoistego odczynu tła.
Ocena preparatów powinna być prowadzona przez patologa przy uŜyciu mikroskopu świetlnego. Wszystkie
305757PL_001 s. 8/16
odczynu
analizy naleŜy prowadzić na podstawie oceny części preparatu zawierającej utkanie nowotworu. W celu oceny
obecności i nasilenia odczynu immunocytochemicznego naleŜy stosować obiektyw o powiększeniu 10x lub 20x.
Do interpretacji naleŜy wybierać jedynie komórki prawidłowe, gdyŜ w komórkach z martwicą lub uszkodzonych
często występują odczyny nieswoiste.14,17
W celu weryfikacji działania testu do kaŜdego z zestawów c-Kit pharmDx™ załączono linie komórkowe dające
odczyn dodatni i ujemny. Odpowiedni odczyn preparatów kontrolnych stanowi dowód na prawidłowe
funkcjonowanie odczynników c-Kit pharmDx™ i postępowanie ściśle według protokołu. Brak odczynu kontrolnej
linii komórkowej HT-29 (0) i umiarkowanie silne (2+) zabarwienie cytoplazmatyczne lub okołojądrowe kontrolnej
linii komórkowej P815 na kolor brązowy wskazuje, Ŝe wynik serii odczynów jest waŜny. JeŜeli intensywność
barwienia linii komórkowej kontroli dodatniej nie jest optymalna (zbyt słaba lub zbyt silna), naleŜy powtórzyć test z
uwagi na ryzyko otrzymania wyniku fałszywie dodatniego lub fałszywie ujemnego.
NaleŜy dokonać oceny dodatniej kontroli tkankowej. Słabe barwienie komórek mioepitelialnych skóry wskazuje
prawidłowe działanie odczynników. JeŜeli nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu w preparatach
tkankowych kontroli dodatnich, naleŜy uznać, Ŝe wyniki preparatów testowych są niewaŜne.
Tkankę do kontroli ujemnej naleŜy zbadać po tkance do kontroli dodatniej, aby zweryfikować swoistość
znakowania antygenu przez przeciwciało pierwotne. Brak odczynu swoistego w tkance do kontroli ujemnej
potwierdza brak reaktywności krzyŜowej przeciwciała z komórkami/składnikami komórek. JeŜeli w badaniu tkanek
stanowiących ujemną próbę kontrolną uzyskuje się swoisty odczyn, wyniki uzyskane dla próbki pochodzącej od
pacjenta naleŜy uznać za niewaŜne. Jeśli odczyn nieswoisty występuje, zazwyczaj ma on charakter rozproszony.
W preparatach tkanek poddawanych nadmiernemu utrwalaniu w formalinie moŜe niekiedy występować odczyn w
obrębie tkanki łącznej. Interpretację odczynu naleŜy prowadzić w oparciu
o komórki nieuszkodzone. Komórki zmienione martwiczo lub uszkodzone często wykazują nieswoisty odczyn.18
Na końcu naleŜy zbadać próbki pochodzące od pacjenta. Intensywność odczynu dodatniego naleŜy oceniać w
kontekście nieswoistego odczynu tła występującego w próbce z odczynnikiem kontroli ujemnej. Interpretacja
ekspresji białka c-kit/CD117 musi uwzględniać ogólny obraz morfologiczny i kontekst kliniczny nowotworu.
Nowotwory GIST dzieli się na trzy kategorie morfologiczne: postać wrzecionowatokomórkową (70%), nabłonkowatą
(20%) i mieszaną.22 NiezaleŜnie od morfologii, w większości komórek nowotworowych typu GIST stwierdza się
ekspresję białka c-kit. W trakcie homogenicznego odczynu immunologicznego przy uŜyciu testu c-Kit pharmDx™
uzyskuje się najczęściej odczyn cytoplazmatyczny, któremu moŜe towarzyszyć barwienie aparatów Golgiego i strefy
okołojądrowej (punktowe) oraz odczyn błonowy, obejmujący całość lub część obwodu komórek. Niektóre przypadki
wykazują heterogeniczny rodzaj odczynu (silny lub słaby odczyn cytoplazmatyczny i/lub błonowy). Występowanie
odczynu obserwowano równieŜ w przestrzeni pozakomórkowej.
Wyniki testu c-Kit pharmDx™ naleŜy oceniać jako dodatnie lub ujemne na podstawie oceny obserwowanego
barwienia ocenianej struktury – cytoplazmy i błony komórkowej (Tabela 2). Dodatni wynik ekspresji białka
c-kit jest definiowany jako swoisty odczyn cytoplazmatyczny i/lub błonowy komórek nowotworu.
W przypadku uzyskania ogniskowego wyniku dodatniego lub odczynu w mniej niŜ 10% komórek nowotworu ich
interpretację naleŜy przeprowadzać z rozwagą.23 Podobnie jak w kaŜdym badaniu IHC, wynik ujemny oznacza, Ŝe
nie antygen nie został wykryty, a nie Ŝe nie występował w badanych komórkach/tkankach.NaleŜy równieŜ zwrócić
uwagę, Ŝe w niewielkim odsetku nowotworów GIST nie występuje ekspresja białka c-kit.
Tak więc nieobecność odczynu białka c-kit nie wyklucza rozpoznania GIST.
Tabela 2: Test c-Kit pharmDx™ – wyniki odczynu
Wynik przekazywany
lekarzowi prowadzącemu
leczenie
białko c-kit — odczyn ujemny
Definicja
Brak odczynu w komórkach nowotworowych.
Odczyn dodatni definiowany jest jako dowolny odczyn IHC cytoplazmy
i/lub błon komórkowych komórek nowotworowych powyŜej poziomu tła.
białko c-kit — odczyn dodatni
Nasilenie odczynu: 1+, 2+, lub 3+
W razie potrzeby naleŜy uŜyć panelu przeciwciał w celu zidentyfikowania reakcji fałszywie ujemnych. Jeśli
uzyskano odczyn ogniskowy dodatni, naleŜy rozwaŜyć przeprowadzenie dodatkowego testu potwierdzającego
diagnozę GIST. Badanie genetyczne, jak równieŜ rodzaje odczynów wymienione w Tabeli 3 są pomocne
w róŜnicowaniu guzów GIST i innych mięsaków pochodzenia mezenchymalnego. Konkretne informacje na temat
immunoreaktywności moŜna znaleźć w sekcji „Streszczenie i wyjaśnienia” oraz „Ograniczenia i charakterystyka
wydajnościowa”.
(111765-003)
305757PL_001 s. 9/16
Tabela 3. Schemat immunohistochemiczny do diagnostyki róŜnicowej guzów przewodu pokarmowego
mających postać wrzecionowatokomórkową.5
ckit
CD34
SMA
(aktyna
gładkomięśniowa)
S-100
Desmin
Guz stromalny
przewodu
≥ 95%
60-70%
30-40%
≤ 2%
≤ 5%
pokarmowego
(GIST)
Nowotwór z
10-15%
+
Sporadycznie
+
komórek mięśni
gładkich
Nerwiak
Typowo
+
Włókniakowatość
Dyskusyjne* Sporadycznie
+
Sporadycznie
* Według doniesień większości autorów włókniakowatość wykazuje ujemny odczyn z białkiem c-kit.
W zaleŜności od czasu inkubacji i stęŜenia roztworu hematoksyliny, barwienie kontrastowe powoduje
wybarwienie jąder komórkowych na kolor blady do ciemnoniebieskiego. Nadmierne barwienie kontrastowe
moŜe utrudniać interpretację wyników.
Ograniczenia metody
Ograniczenia ogólne
IHC jest wieloetapową metodą diagnostyczną wymagającą specjalistycznego przeszkolenia w doborze
odpowiednich odczynników, wyborze tkanek, utrwalaniu i przeprowadzaniu, przygotowaniu preparatów do IHC
i interpretacji wyników barwienia.
Wybarwienie tkanek jest uzaleŜnione od obróbki i przetworzenia tkanki przed wykonaniem odczynu.
Nieprawidłowe utrwalanie, zamraŜanie, rozmraŜanie, przemywanie, suszenie, ogrzewanie lub
zanieczyszczenie skrawków domieszką innych tkanek lub płynów moŜe powodować artefakty, ukrycie
przeciwciał lub wyniki fałszywie ujemne. Przyczyną sprzecznych wyników moŜe być stosowanie zmiennych
metod utrwalania i zatapiania lub właściwości zaleŜne od tkanek.
Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być prowadzona w kontekście objawów
klinicznych, morfologicznych i innych kryteriów histopatologicznych. Interpretacja kliniczna dodatniego lub
ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez badania morfologiczne, wykonywanie odpowiednich prób
kontrolnych i innych badań diagnostycznych. Odpowiedzialność związana z interpretacją wybarwionego
preparatu spoczywa na wykwalifikowanym histopatologu, dysponującym doświadczeniem obejmującym
stosowane przeciwciała, odczynniki i metody. Barwienie naleŜy wykonać w akredytowanej pracowni
histopatologicznej, pod nadzorem histopatologa odpowiedzialnego za przeglądanie i ocenę wybarwionych
preparatów i właściwe wykonanie dodatnich i ujemnych prób kontrolnych.
Opisywany produkt nie nadaje się do stosowania w cytometrii przepływowej. Nie ustalono charakterystyki
wydajnościowej dla cytometrii przepływowej.
Tkanki pochodzące od osób z zakaŜeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające antygen
powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste barwienie w reakcji
z peroksydazą chrzanową.24
W tkankach które nie zostały uprzednio przetestowane, odczynniki mogą wykazywać nieoczekiwane reakcje.
Nie moŜna wykluczyć wystąpienia nieoczekiwanych reakcji równieŜ w przetestowanych grupach tkanek z uwagi
na zmienność biologiczną ekspresji antygenów w tkankach nowotworów i innych tkankach zmienionych
chorobowo.20 W przypadku uzyskania nieoczekiwanych reakcji naleŜy przesłać odpowiednią dokumentację do
działu wsparcia technicznego firmy Dako.
Ograniczenia swoiste dla opisywanego produktu
W niewielkim odsetku nowotworów GIST nie występuje ekspresja białka c-kit. Tak więc nieobecność odczynu
na c-kit nie wyklucza rozpoznania GIST. Wiązanie białek lub produktów reakcji na drodze mechanizmów innych
niŜ immunologiczne moŜe być przyczyną wyników fałszywie dodatnich. Wyniki fałszywie dodatnie mogą
równieŜ wystąpić na skutek aktywności podobnej do peroksydazy (erytrocyty) i endogennej aktywności
peroksydazy (cytochromu C).19
W celu uzyskania optymalnych, powtarzalnych wyników, barwienie w kierunku białka c-kit wymaga stosowania
odmaskowaniu antygenu w preparatach utrwalanych standardowo (buforowany roztwór formaliny) i
zatapianych w parafinie.
Dako zaleca stosowanie c-Kit pharmDx w aparatach Dako Autostainer lub Autostainer Plus. Nie
przeprowadzono weryfikacji zastosowania zestawu c-Kit pharmDx w opcjonalnych systemach
zautomatyzowanych, a ich stosowanie mogłoby spowodować uzyskanie błędnych wyników.
Barwione kontrolne linie komórkowe naleŜy stosować wyłącznie w celu weryfikacji wyników serii odczynów,
a nie w celu oceny odczynu w skrawkach tkankowych.
(111765-003)
305757PL_001 s. 10/16
Do testowania za pomocą zestawu c-Kit pharmDx™ nadają się preparaty przygotowane przy uŜyciu rutynowej
techniki, z zastosowaniem roztworu buforowanej formaliny. Nie prowadzono weryfikacji innych metod
utrwalania tkanek.
Charakterystyka
wydajnościowa
Swoistość
Badano reaktywność przeciwciał przeciwko antygenom c-kit w liniach komórkowych wykazujących ekspresję
białka c-kit. W teście Western blot lizatu linii komórkowej raka drobnokomórkowego płuc SY, wykazującej
nadmierną ekspresję mRNA c-kit, stwierdzono znakowanie przeciwciałami prąŜka o masie cząsteczkowej 145 kD,
odpowiadającego białku c-kit. Znakowany prąŜek ma dość znaczną szerokość, wynoszącą 120–155 kD.
Znakowany został równieŜ dodatkowy prąŜek odpowiadający 100 kD.25 Dalsze wyznakowanie białka o masie
100 kD uzyskano w dodatkowych badaniach z zastosowaniem drugiego zestawu przeciwciał skierowanych
przeciwko antygenom c-kit. Znakowanie zostało zniesione po inkubacji przeciwciał z syntetycznym antygenem
białka c-kit, stosowanym do immunizacji.26 W dodatkowych badania przeciwciała przeciwko c-kit testowano
metodą Western blot pod kątem reaktywności krzyŜowej z białkami homologicznymi strukturalnie, takimi jak
receptor płytkowego czynnika wzrostu (PDGFRa), receptor czynnika stymulującego wzrost kolonii makrofagów
(c-FMS) oraz kinazę tyrozynową 3 typu FMS (FLT-3). Nie stwierdzono reaktywności krzyŜowej z tymi białkami
homologicznymi. Ponadto, przeciwciała Dako stosowane w teście Western blot nie reagowały
z lizatem linii komórkowej raka gruczołowego HS, niewykazującego ekspresji genu c-kit.25
Badania porównawcze
Przy uŜyciu zestawu c-Kit pharmDx™ wykonywano odczyny immunohistochemiczne na skrawkach utrwalanych
w formalinie i zatopionych w parafinie oraz na macierzach tkankowych MTA zawierających preparaty
z mięsaków o dodatniej i ujemnej ekspresji białka c-kit. Tkanki badano przy uŜyciu zestawu c-Kit pharmDx™ po
wcześniejszym zastosowaniu dwóch zalecanych metod odmaskowania epitopu (HIER). Preparaty ogrzewano
w łaźni wodnej o temperaturze 95–99°C przez 20 min., sch ładzano przez 20 min., ogrzewano w szybkowarze
w temperaturze 121°C przez 5 min. i ponownie chłodz ono przez 20 min. Pozostałe etapy odczynu były
identyczne do opisanych. Wyniki były porównywane z równolegle przeprowadzaną symulacją Protokołu
Badania Klinicznego Novartis (NCTP) uŜywanego wcześniej do kwalifikacji pacjentów do badania klinicznego,
na podstawie którego agencja FDA wyraziła zgodę na podawanie leku Gleevec/Glivec pacjentom ze
zdiagnozowanym GIST. W oritijike NCTP uŜywane było 2x wyŜsze stęŜenie przeciwciał pierwotnych
poliklonalnych Dako przeciwko c-kit (A4502) (tego samego odczynnika, co w zestawie c-Kit pharmDx), bez
odmaskowania epitopu. Wyniki porównania równoległych badań NCTP i c-Kit pharmDx™ przy uŜyciu
szybkowaru jako źródła ciepła podano w Tabeli 4, a podobne wyniki (ogólna zgodność=98,7%) uzyskano w
przypadku uŜycia łaźni wodnej. W obu porównaniach zgodność wyników dodatnich i ujemnych była podobna.
Tabela 4. Podwójne porównanie protokołu c-Kit pharmDx™ z zastosowaniem szybkowaru z wynikiem
testu „NCTP”
Wynik równoległego
testu wg NCTP
Wynik dla c-Kit
pharmDx™ z
szybkowarem
Dodatni
Ujemny
Razem
Dodatni
n (%)
Ujemny
n (%)
188 (60,8)
1 (0,3)
189
3 (0,9)
117 (37,9)
120
Razem
191
118
309
Procentowa zgodność wyników ujemnych = 188/(188 +1); = 0,995 x 100 = 99,5%
(dokładny przedział ufności dla 95%: 97,1% - 100%)
Procentowa zgodność wyników ujemnych = 117/(117+3); = 0,975 x 100 = 97,5%
(dokładny przedział ufności dla 95%: 92,9% - 99,5%)
Ogólna zgodność = (188+117)/309 = 0,987 x 100 = 98,7% (dokładny przedział ufności dla 95%: 96,7% - 99,7%)
Część preparatów (35) pobrano od pacjentów uczestniczących w badaniu klinicznym Gleevec firmy Novartis.
21 (58,3%) pacjentów z tej grupy otrzymywało preparat Gleevec™. Po ponownym przebadaniu tych samych
preparatów przy uŜyciu testu NCTP i c-Kit pharmDx™ stwierdzono 20 wyników dodatnich i 1 – ujemny,
z zastosowaniem wszystkich trzech procedur. U 54% ze 147 pacjentów otrzymujących preparat Gleevec™
stwierdzono częściową odpowiedź, a u 28% – stabilną postać choroby.7
Dla podzbioru 259 próbek wymienionych w Tabeli 4 wyniki testu na c-kit określono w chwili umieszczania
próbek w macierzy MTA. Trzydzieści pięć przypadków włączono do badań klinicznych Gleevec (n=35),
a pozostałe testowano w tych samych laboratoriach, które uczestniczyły w badaniu Gleevec. Wyniki dla 179
próbek (suma mniejsza niŜ 259 z uwagi na utratę próbki lub brak komórek nowotworowych w macierzach MTA)
przedstawiono w Tabeli 5 poniŜej. W wynikach tych uzyskano zgodność z pierwotnym statusem ekspresji c-kit
na poziomie 94,9% (dokładny przedział ufności dla 95%: 90,7% - 97,7%).
(111765-003)
305757PL_001 s. 11/16
Tabela 5: macierz 2x2 porównania wyników z szybkowaru z wynikami pierwotnego badania
Pierwotny status ekspresji c-kit w tkance
Wyniki testu z
Dodatni
Ujemny
Razem
zastosowaniem
n
n
n (%)
szybkowaru
Dodatni
136
3
139 (78%)
Ujemny
6
34
40 (22%)
Razem
142
37
179
Procentowa zgodność wyników ujemnych = 136/(136+3); = 0,957 x 100 = 95,7%
(dokładny przedział ufności dla 95%: 91,0% - 98,4%)
Procentowa zgodność wyników ujemnych = 34/(34+3); = 0,919 x 100 = 91,9%
(dokładny przedział ufności dla 95%: 78,1% - 98,3%)
Ogólna zgodność = (136+34)/179 = 0,949 x 100 = 94,9% (dokładny przedział ufności dla 95%: 90,7% - 97,7%)
Powtarzalność
Powtarzalność między seriami odczynów (ręczne wykonanie odczynu)
Powtarzalność między seriami odczynów testowano w ciągu 3 dni przy uŜyciu ręcznej metody badania w trzech
pracowniach. W kaŜdej pracowni dwóch patologów badało 5 róŜnych preparatów – po 4 dodatnie i 1 ujemny.
W 30 przebadanych tkankach nasilenie odczynu róŜniło się o nie więcej niŜ +/- jeden punkt nasilenia,
z poniŜszymi wyjątkami: w ośrodkach 1 i 3 wyniki dla jednego preparatu (tj. po jednym w kaŜdym ośrodku)
róŜniły się o więcej niŜ dwa punkty. Było to skutkiem rozerwania tkanki w ośrodku 1. W sumie uzyskano
znakomitą powtarzalność (100%), dla wyników dodatnich i ujemnych.
Powtarzalność międzylaboratoryjna (ręczne i automatyczne wykonanie odczynów przy uŜyciu aparatu Dako
Autostainer)
W trzech laboratoriach znajdujących się w róŜnych lokalizacjach geograficznych wykonano odczyn
immunohistochemiczny na 30 zrandomizowanych i zamaskowanych próbkach wykazujących róŜny poziom
ekspresji c-kit (10 ujemnych i 20 dodatnich). Przygotowane preparaty przesłano do kaŜdej z pracowni w celu
wykonania odczynów ręcznych i automatycznych oraz oceny przez histopatologa. W dwóch ośrodkach
powtarzalność wyników rozpoznania dodatniego/ujemnego statusu ekspresji białka c-kit była idealna (100%),
tak w ramach jednego laboratorium, jak i między laboratoriami, zarówno w metodzie manualnej, jak i
automatycznej. W ośrodku 2 zduplikowane szkiełka z dwiema tkankami, które przed badaniem określono jako
ujemne, uznane zostały za faktycznie dodatnie. Późniejsza analiza wykazała, Ŝe mały obszar (około 20%
komórek nowotworu) wykazał odczyn dodatni. Ta część nowotworu nie była widoczna w próbkach badanych
w innych laboratoriach.
Powtarzalność w jednej serii odczynów (ręczne wykonanie odczynu)
W kaŜdym ośrodku 5 preparatów z tej samej próbki dodatniej włączono do zbioru 30 próbek barwionych
ręcznie. Oceniano nasilenie odczynu i procent wybarwienia nowotworu. Wyniki dla tkanek były dodatnie we
wszystkich ośrodkach, a nasilenie odczynu róŜniło się o nie więcej niŜ +/- 1 punkt.
Immunoreaktywność
W Tabeli 6 przedstawiono podsumowanie immunoreaktywności testu c-Kit pharmDx™ w zalecanym panelu
prawidłowych tkanek. Wszystkie tkanki były utrwalane w formalinie i zatopione w parafinie. Wykonano 30
standardowych testów tkankowych w automacie DAKO Autostainer zgodnie z dołączonymi instrukcjami
i zastosowaniem odczynników zalecanych w ulotce dołączonej do opakowania.
Tabela 6: Podsumowanie odczynów uzyskanych w prawidłowych tkankach przy uŜyciu testu c-Kit
pharmDx™*
(111765-003)
Rodzaj tkanki (liczba
testowanych przypadków)
Rodzaj odczynu
Nadnercza (3)
Brak
Szpik kostny (3)
Nieliczne komórki tuczne (2+): odczyn cytoplazmatyczny
Gruczoły sutkowe (3)
Komórki nabłonkowe (3+): odczyn błonowy i cytoplazmatyczny
Komórki mioepitelialne: (1+): odczyn cytoplazmatyczny
Mózg/móŜdŜek (3)
Wypustki komórek Purkinjego (1+): odczyn cytoplazmatyczny
Mózg/mózgowie (3)
Brak
Szyjka macicy (3)
Brak
Jelito grube (3)
Komórki tuczne błony podśluzowej (2+): i blaszka właściwa (2+): odczyn
cytoplazmatyczny
Przełyk (3)
Komórki tuczne błony podśluzowej (2+): odczyn cytoplazmatyczny
Serce (3)
Brak
Nerki (3)
Nabłonek cewek nerkowych (2+): odczyn cytoplazmatyczny
305757PL_001 s. 12/16
Wątroba (3)
Brak
Płuca (3)
Komórki tuczne i makrofagi (2+): odczyn cytoplazmatyczny
Komórki międzybłonka (3)
Brak
Jajniki (3)
Brak
Trzustka (3)
Rzadko występujące, duŜe komórki nabłonka kanalików (3+): Komórki tuczne
(2+): odczyn cytoplazmatyczny
Przytarczyce (3)
Brak
Nerwy obwodowe (3)
Komórki tuczne w tkankach miękkich (2+): odczyn cytoplazmatyczny
Przysadka mózgowa (3)
Brak
Gruczoł krokowy (3)
Brak
Ślinianki (3)
Brak
Mięśnie szkieletowe (3)
Komórki tuczne (2+): odczyn cytoplazmatyczny
Skóra (3)
Melanocyty warstwy podstawnej (1+): odczyn cytoplazmatyczny
Komórki mioepitelialne nabłonka gruczołowego (1+): odczyn cytoplazmatyczny
Jelito cienkie (3)
Komórki nerwowe (1+): odczyn cytoplazmatyczny
Komórki tuczne (2+): odczyn cytoplazmatyczny
Śledziona (3)
Komórki tuczne (2+): odczyn cytoplazmatyczny
śołądek (3)
Komórki tuczne blaszki podstawnej (2+): odczyn cytoplazmatyczny
Jądra (3)
Brak
Grasica (3)
Brak
Tarczyca (3)
Brak
Migdałki (3)
Brak
Macica (3)
Brak
* W przypadku większości testowanych tkanek stwierdzono dodatni odczyn fibroblastów w tkance podścieliska
(1+), komórek tucznych i makrofagów. Niekiedy obserwowano odczyn w obrębie eozynofilów wywoływany
przez obecność endogennej peroksydazy.
Wewnętrzne badania z zastosowaniem zestawu c-Kit pharmDx wykazały ekspresję białka c-kit w róŜnych
komórkach prawidłowych. Do komórek tych zalicza się komórki przewodzików oraz mioepitelialne gruczołów
sutkowych, wypustki komórek Purkinjego, komórki blaszki właściwej okręŜnicy, nabłonek cewek nerkowych,
melanocyty warstwy podstawnej naskórka, komórki mioepitelialne gruczołów skóry, komórki jelitowych splotów
nerwowych (Cajala) jelita cienkiego oraz komórki tuczne. Reaktywność cytoplazmatyczna w granulocytach była
spowodowana przez aktywność ednogennej peroksydazy i widoczna przy stosowaniu odczynnika do kontroli
ujemnej.
Rozwiązywanie
problemów
Tabela 7: Rozwiązywanie problemów
Problem
Prawdopodobna przyczyna
1. Brak barwienia
1a. Odczynniki nie są uŜywane
preparatów
we właściwej kolejności.
1b. Azydek sodu obecny w kąpieli
z buforem płuczącym.
2. Słabe barwienie
2a. Niedostateczny czas
preparatów.
inkubacji.
2b. UŜyto niewłaściwej metody
utrwalania.
2c. Niedostateczne
odmaskowanie antygenu po
uŜyciu roztworu Target
Retrieval Solution.
(111765-003)
Zalecane postępowanie
1a. Sprawdzić sposób uŜycia odczynników.
1b. UŜyć świeŜego buforu płuczącego
niezawierającego azydku.
2a. Przejrzeć instrukcje podane w części
Wykonanie odczynu.
2b. Dopilnować, by tkanki pacjenta nie były
poddawane nadmiernemu utrwalaniu i Ŝe
jest stosowana odpowiednia substancja
utrwalająca
2c. Upewnić się, Ŝe łaźnia wodna lub
szybkowar działa prawidłowo, i Ŝe
prawidłowo przeprowadzono
odmaskowanie epitopu. (Niska
temperatura i nieprzestrzeganie
przepisanego czasu spowodują, Ŝe
odczyn będzie słabszy.)
305757PL_001 s. 13/16
3. Nadmierne barwienie tła 3a. Niecałkowicie usunięta
w preparatach
parafina.
3a. Stosować świeŜe roztwory do
odparafinowywania; postępować zgodnie
z opisem procedury w części Usuwanie
parafiny i ponowne uwadnianie.
3b. Podczas zatapiania skrawków 3b. Unikać stosowania jakichkolwiek
zastosowano pochodne
dodatków zwiększających przyczepność
skrobi.
skrawków do szkiełek mikroskopowych.
Wiele takich preparatów wykazuje
reaktywność immunologiczną.
3c. Preparaty nie są odpowiednio 3c. Zastosować świeŜe roztwory w kąpielach
przemywane.
z buforem i butelkach z roztworem
płuczącym.
3d. Wysychanie skrawków
3d. Stosować inkubację w komorze
podczas wykonywania
nawilŜającej przez 30 min.
odczynu.
3e. Nieswoiste wiązanie
3e. Dopilnować właściwego utrwalania
odczynników do skrawka.
preparatów i (lub) upewnić się, Ŝe w
preparat nie zawiera obszarów martwicy.
4. Tkanka oddziela się od 4a. Zastosowano niewłaściwe
4a. Stosować szkiełka elektrostatyczne
szkiełka.
szkiełka mikroskopowe.
(Fisher SuperFrost Plus) lub
sylanilizowane (Dako Silanized Slides, nr
kat. S3003).
5. Nadmiernie silny odczyn 5a. UŜyto niewłaściwej metody
5a. Dopilnować, by były stosowane jedynie
swoisty.
utrwalania.
zatwierdzone substancje utrwalające
i metody utrwalania
5b. Zbyt długie czasy inkubacji
5b. Zapoznać się z instrukcjami podanymi
odczynników.
w części Wykonanie odczynu.
5c. UŜyto niewłaściwego buforu
płuczącego.
5c. Stosować wyłącznie rozcieńczony bufor
płuczący, zalecany do stosowania
z zestawem.
5d. Niewłaściwe stosowanie
komory nawilŜającej.
6a. Niedostateczne
odmaskowanie antygenów.
5d. Stosować inkubację w komorze
nawilŜającej przez 30 min.
6. Słaby odczyn 2+
6a. Zweryfikować, Ŝe procedura
kontrolnej linii
odmaskowaniu antygenu została
komórkowej.
właściwie wykonana.
6b. Niedostateczny czas
6b. Zapoznać się z instrukcjami podanymi
inkubacji.
w części Wykonanie odczynu.
6c. Rozkład preparatu
6c. Sprawdzić datę waŜności i warunki
kontrolnego.
przechowywania zestawu podane na
etykiecie opakowania.
Uwaga: Dodatkowe informacje przedstawiono w części Troubleshooting w publikacji Dako Handbook:
16
Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition, Atlas of Immunohistology,21 lub Immunoperoxidase
Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis.18 W razie wystąpienia niezwykłego odczynu naleŜy się
skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
(111765-003)
305757PL_001 s. 14/16
Piśmiennictwo
(111765-003)
1. Heinrich, M., Corless, C., Duensing, A., McGreevey, L., Chen, C.J., Joseph, N., Singer, S., Griffith, D.,
Haley, A., Town, A., Demetri, G., Fletcher, C. and Fletcher, J. PDGFRA Activating Mutations in
Gastrointestinal Stromal Tumors, Science 229: 708-710, 2003
2. Taniguchi, M., Nishida, T., Hirota, S.. Isozaki, K., Ito, T., Nomura, T., Matsuda, and Kitamura, Y. Effect of cKIT mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 59: 4297-300, 1999
3. Medeiros, F., Codess. C.L., Duensing, A., Homick, J.L., Oliveira, AM., Heinrich, MC., Fletcher, J.A.,
Fletcher, C.D. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: Proof of concept and therapeutic implications.
Am J Surg Pathol. Jul 28(7): 889-894 2004
4. Bühring H-J, Ashman LK, Gattei V, Kniep B, Larregina A, Pinto A, et al. CR2.7 Stem-cell factor receptor
(p145(c-kit)) summary report (CD117). Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T,
Morimoto C, et al., editors. Leukocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5th
International Workshop and Conference; 1993 Nov 3–7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford
University Press 1995; 1882
5. Smithey BE, Pappo AS, Hill DA. C-kit expression in pediatric tumors: a comparative immunohistochemical
study. Am J Surg Pathol 2002; 26:486
6. Hornick JL and Fletcher CDM. Immunohistochemical staining for KIT (CD117) in soft tissue sarcomas is
very limited in distribution. Am J Pathol 2002; 117:188.
7. Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD, Van den Abbeele AD, Eisenberg B, Roberts PJ, Heinrich MC,
Tuveson DA, Singer S, Janicek M, Fletcher JA, Silverman SG, Silberman SL, Capdeville R, Kiese B, Peng
B, Dimitrijevic S, Druker BJ, Corless C, Fletcher CD, Joensuu H. Efficacy and safety of imatinib mesylate in
advanced gastrointestinal stromal tumors. NEJM 2002; 347, 7:472.
8. Fletcher CDM, Berman J, Corless C, Gorstein F, Lasota J, Longley JB, Miettinen M, O’Leary TJ, Remotti H,
Rubin BP, Shmookler B, Sobin LH, and Weiss SW. Diagnosis of Gastrointestinal Stromal Tumors: A
Consensus Approach. Human Pathology May 2002; 33:5 459
9. Dematteo RP, Heinrich MC, El-Rifai WM, Demetri G: Clinical management of gastrointestinal stromal
tumors: before and after STI-571. Human Pathol 2002; 33:466.
10. Hasegawa T, Matsuno Y, Shimoda T, Hirohashi S: Gastrointestinal stromal tumor: Consistent CD117
immunostaining for diagnostic and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade. Human
Pathol 2002; 33:669.
11. Graadt van Roggen JF, Van Velthuysen MLF, Hogendoorn PCW. The histopathological differential
diagnosis of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Pathol 2001; 54:96.
12. Kindblom LG, Remotti HE, Aldenborg F, Meis-Kindblom JM. Gastrointestinal pacemaker cell tumor
(GIPACT): gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal.
Am J of Pathol 1998; 152, 5:1259.
13. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, 1992
14. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co. 1980
15. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press
1981
16. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako 2001.
17. CLIS (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS). Quality Assurance for
Immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA 1999. Order code MM4-A
18. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago:
Amer Soc Clin Pathol Press 1986
19. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special
Report: quality control in Immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836
20. Herman GE, Effont EA. The taming of Immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech
Histochem 1991; 66:194
21. Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of
Immunohistotechnology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; 16
22. Demtri GD, Benjamin R, Blanke CD, Choi H, Corless C, DeMatteo RP, Eisenberg BL, Fletcher CDM, Maki
RG, Rubin BP, Van den Abbeele AD, and Margaret von Mehren. NCCN Task Force Report: Optimal
Management of Patients with Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST) – Expansion and Update of NCCN
Clinical Practice Guideline. Journal of the National Comprehensive Cancer Network 2004, Volume 1:
Supplement 1.
23. Berman J, O’Leary TJ. Gastrointestinal Stromal Tumor Workshop. Human Pathology 2001; 32(6):578
24. Omata M, Liew CT, Ascavali M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis
B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemsitry. Amer J Clin Pathol 1980; 73:626
25. Tsura Y, Hiraki H, Watanabe K, Igarashi S, Shimamura K, Fukuda T, et al. Preferential localization of c-kit
product in tissue mast cells, basal cells of skin, epithelial cells of breast, small cell lung carcinoma and
seminoma/dysgerminoma in human: immunohistochemical study on formalin-fixed, paraffin-embedded
tissues. Virchows Arch 1994; 424:135
26. Yardern Y, Kuang W-J, Yang-Feng T, Coussens L, Munemitsu S, Dull TJ, et al. Human proto-oncogene
c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand. EMBO J 1987; 6:3341
305757PL_001 s. 15/16
Edition 07/08
(111765-003)
305757PL_001 s. 16/16