Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains Nr kat

Polyclonal Rabbit
Anti-Human
Kappa Light Chains
Nr kat. A 0191
Wydanie z 01.12.2002
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains, nr kat. A 0191, jest przeznaczone do użytku w
badaniach immunocytochemicznych. Nadaje się również do badań technikami immunoprecypitacji żelowej, w
tym immunofiksacji i immunoblottingu (1).
W badaniach immunocytochemicznych przeciwciało służy do znakowania komórek osocza i pokrewnych
komórek limfoidlnych zawierających lekkie łańcuchy kappa, jest także przydatnym narzędziem do klasyfikacji
pacjentów chorych na gammopatie monoklonalne (2) i skrobiawicę (3, 4). Ponadto przeciwciało może być
stosowane do różnicowania monoklonalnej proliferacji nowotworowej od reaktywnej hiperplazji komórek B (5–
7). Identyfikacja różnicowa jest wspomagana przez wyniki panelu przeciwciał.
Interpretację wyników powinien przeprowadzić pracownik uprawniony do wykonywania takich badań na
podstawie historii choroby pacjenta oraz innych testów diagnostycznych.
Wstęp
Ludzkie immunoglobuliny składają się w zasadzie z dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (Mr około 50 000)
oraz dwóch identycznych łańcuchów lekkich (Mr około 20 000). Cztery łańcuchy są ze sobą powiązane
kowalentnie wiązaniami dwusiarczkowymi. Łańcuchy lekkie to łańcuchy kappa lub lambda. Immunoglobuliny
należące do pięciu klas: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, różnią się łańcuchami ciężkimi, ponadto IgA i IgM mogą
występować także jako polimery (8).
Poszczególne komórki B wykazuję ekspresję łańcucha kappa lub lambda, ale nigdy obu równocześnie.
W populacji poliklonalnej stosunek komórek B z łańcuchem kappa do posiadających łańcuch lambda wynosi
2:1, a występowanie mieszaniny komórek z lekkimi łańcuchami kappa i lambda wskazuje na poliklonalność
populacji oraz reaktywną lub nienowotworową proliferację komórek B (9). Schorzenia takie jak szpiczak mnogi
oraz chłoniak typu B charakteryzują się proliferacją monoklonalnych komórek nowotworowych wytwarzających
tylko jeden typ lekkiego łańcucha. Dlatego też możliwość wykazania obecności w populacji wyłącznie komórek
z lekkim łańcuchem kappa lub wyłącznie z lekkim łańcuchem lambda stanowi bardzo przydatne narzędzie do
diagnostyki histopatologicznej tych chorób (4). Pierwotna skrobiawica typu AL (z lekkim łańcuchem amyloidu)
także należy do zaburzeń komórek osocza, w przypadku których wykazanie obecności monotypowych lekkich
łańcuchów kappa lub lambda w złogach amyloidu ma istotne znaczenie diagnostyczne i różnicuje ten rodzaj
choroby od skrobiawicy typu AA, w której przebiegu nie występują złogi lekkich łańcuchów immunoglobuliny (3).
Odczynnik dostarczony
Oczyszczona frakcja immunoglobulin z surowicy odpornościowej królika jest dostarczana w postaci płynnej. W
0,1 mol/L NaCl, 15 mmol/L NaN3.
Stężenie białka w g/L: patrz informacja podana na etykiecie fiolki. Miano przeciwciała (SRI): 600 mg/L (10).
Ponieważ nie istnieją żadne wzorce międzynarodowe kappa, do określenia miana przeciwciała użyto
poliklonalnego preparatu kappa (wyizolowanego z ludzkiej IgG). Wahanie wartości miana w różnych seriach
A 0191 wynosi poniżej 10%. Ten poziom zmienności uzyskuje się przez dopasowanie miana każdej z serii do
miana referencyjnego przeciwciała, utrzymywanego w temperaturze –80°C.
Immunogen
Łańcuchy lekkie immunoglobuliny poliklonalnej typu kappa wyizolowane z puli surowicy ludzkiej.
Swoistość
Przeciwciało reaguje z wolnymi łańcuchami kappa, a także z łańcuchami kappa w cząsteczkach
nieuszkodzonej immunoglobuliny. Ślady przeciwciał powodujących skażenie zostały usunięte przez absorpcję
w fazie stałej z użyciem białek osocza ludzkiego.
Testy swoistości; bawienie barwnikiem Coomassie Brilliant Blue:
Podwójna immunodyfuzja:W testach z użyciem 15 L przeciwciała wobec 15 L lambda IgG nie obserwuje się
żadnych reakcji z łańcuchami lambda i gamma.
Immunoelektroforeza krzyżowa: Łuk precypitacyjny dla łańcuchów kappa pojawia się jedynie w testach z użyciem
12,5 L przeciwciała na cm2 żelu z 2 L osocza ludzkiego lub 2 L puli stężonego moczu pacjentów z
białkomoczem cewkowym.
Może zachodzić reakcja krzyżowa z immunoglobulinami pochodzącymi od innych gatunków. Jak wykazano w
testach immunocytochemicznych, przeciwciało wchodzi w reakcje krzyżowe z immunoglobulinami psów, koni, świń
i szczurów.
Środki ostrożności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stężeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, może
reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie
wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się
azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, należy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. Ten produkt można wykorzystać w różnych technikach badawczych oraz z różnymi rodzajami próbek
i materiałów, dlatego każde laboratorium powinno dokonać walidacji systemu stosowanego do analiz.
(107739-003)
A 0191/PL/PAH/01.12.02 s. 1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie używać po dacie ważności podanej na etykiecie fiolki. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane powyżej, użytkownik musi zweryfikować te
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na utratę stabilności produktu. Dlatego jednocześnie
z badaniem próbek pacjenta należy wykonywać odpowiednie kontrole. W przypadku uzyskania
nieoczekiwanych wyników, których nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, i istnieje
podejrzenie, że przyczyną może być problem z przeciwciałem, należy skontaktować się z Działem Pomocy
Technicznej naszej firmy.
IMMUNOCYTOCHEMIA
Przygotowanie próbek
Skrawki parafinowe: Przeciwciało można stosować do znakowania skrawków tkanek utrwalonych w formalinie
lub B5 i zatopionych w parafinie (2). Wymagane jest wstępne przygotowanie tkanek poprzez nadtrawienie
proteinazą K lub odsłonięcie epitopu w podwyższonej temperaturze. W przypadku odsłaniania epitopu w
podwyższonej temperaturze optymalne wyniki uzyskuje się przy użyciu Dako Target Retrieval Solution, nr kat.
S 1700, Dako Target Retrieval Solution o wysokim pH, nr kat. S 3308, 10 mmol/L buforu cytrynianowego o
pH 6,0 lub 10 mmol/L buforu Tris, 1 mmol/L EDTA o pH 9,0. Ani podczas przygotowania, ani następującej po
nim procedury barwienia immunocytochemicznego nie wolno dopuścić do wyschnięcia skrawków tkanki.
Skrawki zamrożone i przygotowanie komórek: Przeciwciało można stosować do znakowania zamrożonych
skrawków utrwalonych w acetonie (6).
Procedura barwienia
Rozcieńczanie: Przeciwciało Polyclonal Rabbit Anti-Human Kappa Light Chains, nr kat. A 0191, można
rozcieńczać w zakresie 1:1000–1:2000 w przypadku jego stosowania na skrawkach parafinowych ludzkich
migdałków utrwalonych w formalinie przy 20-minutowym cyklu odsłaniania epitopu w podwyższonej
temperaturze w 10 mmol/L buforze Tris i 1 mmol/L EDTA o pH 9,0 oraz 30-minutowej inkubacji w temperaturze
pokojowej z przeciwciałem pierwotnym. Optymalne warunki mogą się różnić w zależności od próbki oraz
metody przygotowania i powinny być określone przez poszczególne laboratoria. Zalecaną kontrolą ujemną jest
odczynnik Dako Rabbit Immunoglobulin Fraction (Solid-Phase Absorbed), nr kat. X 0936, rozcieńczony do takiego
samego stężenia białka jak pierwsze przeciwciało. Jeśli nie wyznaczono trwałości odczynnika w aktualnie
stosowanym systemie testowym, zaleca się rozcieńczenie produktu bezpośrednio przed użyciem lub
zastosowanie do tego celu odczynnika Dako Antibody Diluent, nr kat. S 0809.
Wizualizacja: Zaleca się stosowanie zestawu DAKO LSAB™+/HRP, nr kat. K 0679 oraz zestawów
DAKO EnVision™+/HRP, nr kat. K 4008 oraz K 4010. Należy postępować zgodnie z procedurą załączoną do
wybranego zestawu wizualizacji.
Automatyzacja: Przeciwciało jest odpowiednie do barwienia immunocytochemicznego przy wykorzystaniu
platform automatycznych, takich jak Dako Autostainer.
Charakterystyka działania
Komórki znakowane przeciwciałem wykazują barwienie błony komórkowej i/lub cytoplazmy.
Tkanki normalne: W zdrowych migdałkach przeciwciało znakuje komórki osocza, komórki grudek chłonnych
oraz strefy płaszcza, dając poliklonalny wzór barwienia z wyraźnym rozróżnieniem pomiędzy komórkami
dodatnimi i ujemnymi (4).
Tkanki patologiczne: W odczynowych węzłach chłonnych przy użyciu Dako Anti-Kappa uzyskano
charakterystyczny wzór barwienia, a przy użyciu Dako Anti-Lambda uzyskano wzór trudny do odróżnienia, co
wyraźnie wskazuje na poliklonalny charakter komórek B w przebiegu tego zaburzenia (6). W przypadku
plazmocytomy nieprawidłowe komórki osocza były monotypowe, kappa- lub lambda-dodatnie (5). W testach z
zamrożonymi skrawkami wszystkie 15 przypadków chłoniaków guzkowych znakowanych Dako Anti-Kappa lub
Dako Anti-Lambda wykazało wyraźną przewagę jednego typu łańcuchów lekkich. Na 31 przypadków
chłoniaków rozlanych, w 23 stwierdzono przewagę monotypowych komórek z łańcuchem lekkim, w większości
przypadków podobnych do występujących w przebiegu chłoniaka guzkowego. Wszystkie 16 przypadków
rozlanych chłoniaków wielkokomórkowych także wykazywało monotypowe znakowanie łańcucha lekkiego (6).
W 113 przypadkach utrwalonego w formalinie chłoniaka nieziarniczego typu B, obejmujących kilka bardzo
małych próbek otrzymanych drogą biopsji gruboigłowej, przy użyciu Dako Anti-Kappa i Anti-Lambda
monotypową ekspresję lekkiego łańcucha stwierdzono w 91 przypadkach (81%), zachowując 100% swoistość
(7). W przypadku aspiratów szpiku kostnego pobranych od 66 pacjentów z monoklonalnymi gammapatiami
surowicy, przy użyciu przeciwciała stwierdzono nieprawidłowy stosunek łańcuchów lekkich w 24 przypadkach
gammapatii o nieustalonej znamienności, 23 przypadkach szpiczaka mnogiego, 5 przypadkach skrobiawicy,
9 przypadkach makroglobulinemii, 1 przypadku plazmocytomy pozaszpikowej, 3 przypadkach choroby nerek
oraz 1 przypadku chłoniaka. Występujący w przeważającej ilości lekki łańcuch znakowany przeciwciałem
w materiale biopsyjnym korelował z monoklonalnym łańcuchem lekkim wykrywanym w surowicy (2). Na 23
zbadane przypadki chorób z tworzeniem złogów łańcuchów lekkich (light chain deposition disease – LCDD) w
17 przeciwciało znakowało próbki z nerek w sposób monotypowy, natomiast 5 przypadków dawało wynik
dodatni wyłącznie dla łańcuchów lambda (3).
IMMUNOFIKSACJA
Wskazówki dotyczące
sporządzania roztworu
Przeciwciało: Nierozcieńczone, zwykle wystarcza 80 L. Próbka: Ludzka surowica 1+3 lub mocz (stężenie białek
około 1 g/L). Objętość próbki: 5 L. Nie należy stosować próbek osocza, ponieważ prążek fibrynogenu może
zakłócać interpretację wyników.
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
(107739-003)
Withold W, Reinauer H. An immunoblotting procedure following agarose gel electrophoresis for detection
of Bence Jones proteinuria compared with immunofixation and quantitative light chain determination. Eur
J Clin Chem Clin Biochem 1995; 33:135–8.
Peterson LC, Brown BA, Crosson JT, Mladenovic J. Application of the immunoperoxidase technic to bone
marrow trephine biopsies in the classification of patients with monoclonal gammopathies. Am J Clin
Pathol 1986; 85:688–93.
Strom EH, Fogazzi GB, Banfi G, Pozzi C, Mihatsch MJ. Light chain deposition disease of the kidney.
Morphological aspects in 24 patients. Virchows Arch 1994; 425:271–80.
A 0191/PL/PAH/01.12.02 s. 2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Jessup E. Antigen retrieval techniques for the demonstration of immunoglobulin light chains in formalin-fixed,
paraffin-wax embedded sections. UK NEQAS immunocytochemistry news. Winter 1994/95; Issue 4:12–6.
Taylor CR, Burns J. The demonstration of plasma cells and other immunoglobulin-containing cells in
formalin-fixed, paraffin-embedded tissues using peroxidase-labelled antibody. J Clin Pathol 1974; 27:14–
20.
Harris NL, Poppema S, Data RE. Demonstration of immunoglobulin in malignant lymphomas. Use of an
immunoperoxidase technic on frozen sections. Am J Clin Pathol 1982; 78:14–21.
Marshall-Taylor CE, Cartun RW, Mandich D, DiGuiseppe JA. Immunohistochemical detection of
immunoglobulin light chain expression in B-cell non-Hodgkin lymphomas using formalin-fixed, paraffinembedded tissues and a heat-induced epitope retrieval technique. Appl Immunohistochem Mol Morphol
2002; 10:258–62.
Klein J, Hořejši V. Immunology. 2nd ed. Abingdon (UK): Blackwell Science Ltd; 1999. p. 226–7.
Leong ASY, Cooper K, Leong FJWM. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. London:
Oxford University Press; 1999. p. 218.
Becker W. Determination of antisera titres using the single radial immunodiffusion method. Immunochem
1969; 6:539–46.
Objaśnienia symboli
(107739-003)
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Numer serii
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Zużyć przed
Producent
A 0191/PL/PAH/01.12.02 s. 3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17