Spektrofotometryczne badanie procesu agregacji

Spektrofotometryczne badanie procesu
agregacji karotenoidów
VI
Wprowadzenie (praca doktorska Moniki Hereć)
Efekt rozszczepienia ekscytonowego
Proces
agregacji
cząsteczek
prowadzi
do
rezonansowego
rozszczepienia
wzbudzonych poziomów energetycznych pojedynczych molekuł wchodzących w skład
agregatu, które to poziomy w monomerycznych cząsteczkach nie są zdegenerowane.
Efektem rozszczepienia ekscytonowego poziomów energetycznych jest przesunięcie
i zmiana kształtu widma elektronowego cząsteczek (Kasha, 1963; Kasha i wsp., 1965).
Obliczenia energii stanów ekscytonowych przeprowadzone zostały przy użyciu
przybliżenia „dipola punktowego” oraz przy następujących założeniach (Somsen i wsp.,
1996):
I.
rozważamy tylko oddziaływania pomiędzy najbliżej sąsiadującymi cząsteczkami,
II.
energia przejścia elektronowego oraz dipolowy moment przejścia cząsteczki w formie
monomeru (brana do obliczeń przesunięć spektralnych) są niezaburzone przez oddziaływania
międzycząsteczkowe w agregacie.
Każda pojedyncza molekuła charakteryzuje się dipolowym momentem przejścia μmon
oraz energią przejścia νmon. W cząsteczkach tworzących formy zagregowane poziom
wzbudzony ulega rozszczepieniu na m stanów ekscytonowych. (m zależy od liczby
cząsteczek wchodzących w skład agregatu). Energia przejścia m-tego stanu ekscytonowego
wyraża się następującym równaniem (Parkash i wsp., 1998):
⎛ mπ ⎞
⎟
⎝ N +1⎠
ν~m = ν~mon + 2 β cos⎜
(1)
gdzie: νm-energia przejścia stanu wzbudzonego w widmie agregatu, N -liczba cząsteczek
wchodzących w skład agregatu (liczba wzbudzonych stanów ekscytonowych), β -energia
oddziaływania dipol-dipol w agregacie wyrażająca się wzorem:
ρ ρ
ρ ρ ρ ρ
μ i ⋅ μ j − 3(μ i ⋅ rij )(μ j ⋅ rij )
β ij =
4πε oη 2 Rij3
ρ
ρ Rij
oraz rij = ρ
Rij
(2)
μi -dipolowy moment przejścia cząsteczki (i) w agregacie, εo- przenikalność dielektryczna
próżni, η- współczynnik załamania ośrodka, Rij –odległość między środkami dipolowych
momentów przejść sąsiadujących molekuł w agregacie.
α
μi
μj
φj
φi
Rij
Rysunek 1 Orientacja dipolowych momentów przejść μi i μj cząsteczek w agregacie, φi i φj kąty
pomiędzy dipolowymi momentami przejść a osią łączącą ich środki, α -kąt pomiędzy dipolowymi
momentami przejść, Ri j- odległość między środkami chromoforów.
Równanie 2 w przypadku jednakowych cząsteczek można przekształcić do postaci:
β ij =
gdzie :
μ2
κ
4πε oη 2 Rij3
mon
κ = (cos α − 3 cos ϕ i cos ϕ j )
(3)
(4)
α-kąt między wektorami dipolowych momentów przejść sąsiadujących cząsteczek, φkąt między dipolowym momentem przejścia cząsteczki a osią łączącą środki dipolowych
momentów przejść najbliższych molekuł.
Szczególną, najczęściej rozważaną strukturą zagregowaną jest taka, w której
sąsiadujące cząsteczki są równoległe (α=0). W zależności od wartości kąta φ możemy
wyróżnić dwa rodzaje agregatów:
•
φ = 0 wektory momentów dipolowych przejść cząsteczek wchodzących w skład
agregatu, leżą na jednej linii, w takim przypadku współczynnik β przyjmuje wartość ujemną,
co prowadzi do przesunięcia widma w stronę niższych energii (dłuższych fal) względem
widma cząsteczki monomerycznej (przesunięcie batochromowe).
•
φ = π/2 dipolowe momenty przejść cząsteczek ułożone są względem siebie równolegle,
współczynnik β przyjmuje wartość dodatnią, co powoduje przesunięcie widma cząsteczek w
stronę krótkofalową względem widma monomeru (przesunięcie hypsochromowe).
Agregaty,
dla
których
widmo
ulega
przesunięciu
batochromowemu
lub hypsochromowemu nazywamy odpowiednio agregatami typu J lub H.
Najogólniejszym przypadkiem są agregaty, w których dipolowe momenty przejścia
ustawione są pod pewnym kątem (0<α<π i 0<φ<π/2), efektem czego jest przesunięcie widma
zarówno w stronę długo jak i krótkofalową.
Do
wykonywania
praktycznych
obliczeń
(wyznaczania
odległości
między
molekułami w agregacie, określania liczby cząsteczek wchodzących w skład agregatu)
wygodniej jest korzystać ze wzoru na współczynnik β w postaci (Somsen i wsp., 1996):
β = 5.04κ
μi ⋅ μ j
η 2 Rij3
(5)
Równanie 5 jest poprawne wyłącznie, gdy odległość między środkami chromoforów Rij
wyrazimy w nm, dipolowy moment przejścia cząsteczki w D, energię oddziaływania
β w cm-1.
Elektronowe widma absorpcyjne agregatów zbudowanych z małej liczby cząsteczek
(N=2,3) zachowują strukturę oscylacyjną. Wzrost liczby molekuł w agregacie (N>3)
powoduje zanik struktury oscylacyjnej widma.
Struktury dimeryczne
Rysunek 2a przedstawia schemat poziomów energetycznych struktury dimerycznej w
której molekuły tworzą agregat typu H (nazywany również „card pack”). Pierwszy stan
wzbudzony ulega rozszczepieniu na dwa poziomy, przy czym poziom leżący poniżej
poziomu wzbudzonego monomeru (m=2), odpowiada antyrównoległemu ustawieniu
dipolowych momentów przejść cząsteczek, natomiast poziom znajdujący się powyżej
poziomu wzbudzonego monomeru (m=1) odpowiada równoległemu ustawieniu dipolowych
momentów przejść cząsteczek wchodzących w skład dimeru. Ponieważ całkowity moment
przejścia dimeru jest wektorową sumą poszczególnych momentów dipolowych to przejście
ze stanu podstawowego do stanu o m=2 jest zabronione (μw=0). Dozwolone jest tylko
przejście do stanu o m=1, co powoduje, iż widmo dla tego typu dimerów ulega przesunięciu
w stronę krótkofalową względem widma monomeru. Przerwa energetyczna pomiędzy
poziomem wzbudzonym monomeru a poziomem ekscytonowym m=1 wynosi:
νm - νmon = β.
b)
a)
m=1
m=1
β
2β
m=2
m=2
monomer
dimer
monomer
dimer
Rysunek 2 Diagramy energetyczne dla cząsteczek w formie dimerów typu: a) „card pack”, b) „head
to tail”. Liniami przerywanymi oznaczono przejścia wzbronione, ciągłymi dozwolone.
Diagram energetyczny cząsteczek tworzących dimery typu J (nazywane również
„head to tail”) przedstawia rysunek 2b. Dwie możliwe konfiguracje dipolowych momentów
przejść prowadzą do powstania dwóch ekscytonowych poziomów energetycznych,
przy czym przejście ze stanu podstawowego do poziomu o m=1 jest wzbronione
(wypadkowy dipolowy moment przejścia wynosi 0). Efektem tego jest przesunięcie widma w
stronę długofalową dla tego typu dimerów.
Jeżeli dipolowe momenty przejść cząsteczek w dimerze są ustawione względem
siebie pod pewnym kątem, poziom wzbudzony ulega rozszczepieniu na dwa poziomy
ekscytonowe, do których dozwolona jest absorpcja promieniowania.
Agregaty wyższych rzędów
W przypadku, gdy w skład agregatu molekularnego wchodzą więcej niż dwie
cząsteczki (N>2), poziom wzbudzony ulega rozszczepieniu na N stanów ekscytonowych.
Maksymalne przesunięcie spektralne (odległość pomiędzy stanem wzbudzonym
monomeru a skrajnym stanem ekscytonowym) dla N-agregatu uzyskujemy w przypadku,
gdy N>>2 i wynosi ono 2β, co wynika ze wzoru 1.
m=1
4β
m=N
monomer
agregat
Rysunek 3 Diagram energetyczny agregatu składającego się z N molekuł.
Zagadnienia do kolokwium:
• Zjawisko absorpcji, prawo Lamberta-Beera (wyznaczanie stężeń barwników
w oparciu o widma absorpcji)
• Barwniki aparatu fotosyntetycznego (budowa, własności spektralne, struktura
elektronowa karotenoidów)
• Rodzaje i charakterystyka oddziaływań molekularnych
• Proces agregacji karotenoidów (teoria rozszczepienia ekscytonowego, rodzaje
agregatów i ich właściwości spektralne, wyznaczanie parametrów struktury agregatu)
Cel ćwiczenia
•
W oparciu o dane literaturowe (tabela 2) określić rodzaj oraz stężenie barwnika
otrzymanego od prowadzącego ćwiczenia (pomiar wykonać w roztworze etanolu)
•
Na podstawie widm absorpcji barwnika w roztworach etanolowo-wodnych
określić typ agregacji
•
Na podstawie analizy rejestrowanych widm absorpcji oszacować odległość
pomiędzy cząsteczkami tworzącymi agregat w oparciu o teorię rozszczepienia
ekscytonowego (równanie 5).
Wykonanie ćwiczenia
Identyfikacji barwnika oraz pomiar jego stężenia dokonujemy przy pomocy
spektrometru absorpcyjnego. W tym celu próbkę otrzymaną od prowadzącego ćwiczenia
odparowujemy w strumieniu azotu i zalewamy odpowiednią ilością rozpuszczalnika (etanol).
Pomiaru widma absorpcji dokonujemy wg instrukcji „przygotowanie aparatury do pomiaru”
(patrz dalej).
1. Identyfikacja barwnika odbywa się w oparciu o porównanie położenia maksimów
absorpcji na skali długości fal z odczytanymi z tabeli 2.
2. Stężenie barwnika wyznaczamy w oparciu o wzór Lamberta – Beera.
3. Agregacji barwników karotenoidowych dokonujemy poprzez zwiększanie udziału
wody w roztworze etanolowym (np. co 20%). Badania prowadzimy do momentu w
którym dalsze dodawanie H2O nie powoduje zmian widma. Obszar stężeń, w obrębie
którego widoczne są istotne zmiany widma należy przebadać bardziej szczegółowo
(np. co 5%). Próbki należy sporządzać w taki sposób, aby stężenie barwnika było
stałe. Np.:
Tabela 1
Etanol
[ μl ]
Woda dest.
[ μl ]
Stężony roztwór barwnika w EtOH
[ μl ]
Zawartość EtOH
2800
0
200
100%
2050
750
200
75%
1300
1500
200
50%
550
2250
200
25%
Przygotowanie aparatury do pomiaru:
•
włączyć spektrofotometr UV 160A i odczekać aż zakończą się procedury inicjujące
(brak komunikatu o błędzie – error);
•
włączyć komputer, uruchomić Windows, w grupie głównej odszukać aplikację
PC 160 A
•
z menu Configure wybrać polecenie Load i z listy plików konfiguracyjnych zbiór o
nazwie pra_spec.cfg; należy sprawdzić i ewentualnie poprawić parametry pomiaru
tzn.:
−
zakres widma: 300 - 700 nm,
−
rodzaj pomiaru: Absorbancja
−
prędkość skanu: Medium,
−
ścieżki dostępu: c:\160pls\data\pracowni\
Configure/Parameters
Configure/PC Configura
Pomiar rozpoczynamy od umieszczenia w uchwycie pomiarowym (bliższy operatora)
kuwety z czystym rozpuszczalnikiem (bez barwnika) w celu zarejestrowania linii odniesienia
– Baseline (widma absorpcji rozpuszczalnika, które będzie odejmowane w kolejnych
pomiarach od widma całej próbki dając w efekcie spektrum absorpcji barwnika). Tło
(Baseline) należy mierzyć za każdym razem po zmianie rozpuszczalnika np. etanol na
metanol, czy różne proporcje EtOH : H2O.
Pomiaru właściwego dokonujemy ‘klikając’ na Start. Po skończonym pomiarze
należy podać nazwę pod jaką ma zostać zapamiętane dane widmo (aby zachować widmo na
dysku należy wybrać dodatkowo opcję File/Save.
Wybrane funkcje programu:
−
Presentation
−
Channel Status
– m.in. pozwala chwilowo podświetlać i wygaszać wybrane
widma
−
Radar [CTRL+R] – dopasowuje skale osi X i Y do aktualnie wyświetlanych widm
−
Set Limits
– pozwala na ręczne dopasowanie zakresów osi stosownie do
potrzeb
−
−
Plot
– drukuje aktualną zawartość okna
File
−
Save
– nagrywa widmo(a) na dysku w katalogu wskazanym w
Configure/PC Configuration
−
Load
– wczytuje widmo(a) z dysku z katalogu podanego w
Configure/PC Configuration
−
ASCII Translate
– nagrywa widmo jako kolumny w kodzie ASCII (możliwość
dalszego opracowania w innym programie, np. Grapher)
−
Manipulate
−
Peak Pick
– odnajduje położenia maksimów i minimów widma oraz podaje
wartość Abs. dla tych długości fali
Dodatkowych informacji proszę szukać w instrukcji obsługi spektrometru.
Tabela 2
Carotenoid
ε mol
λ
Anteraxanthin
(231)
137200
446
138900
125300
140400
450
465
450
128500
134300
107600
111500
465
452
484
449
134700
453
148200
134600
438
439
144800
127000
140900
147700
122700
445
458
445
445
475
β,β-carotene
(3)
Neoxanthin
(234)
Lutein
(133)
Violaxanthin
(259)
153000
134400
144000
440
454
442
Zeaxanthin
(119)
132900
133400
140900
144300
452
449
450
450
λ
Solvent
C
EtOH
H, P
A
C
P
B
EtOH
456
444
445
452
461
450
462
450
484
472
472
478
485
477
487
476
416
426
423
440
453
448
470
483
476
85
415
416
435
439
438
458
467
467
485
80
87
P
EtOH
B
Et2O
Et2O
CS2
C
421
422
432
445
445
458
474
474
487
60
60
426
449
478
P
EtOH
B
A
B
C
A
P
EtOH
EtOH
416
419
427
440
440
453
465
470
483
440
433
430
424
428
463
462
452
449
450
491
493
479
476
478
CHCl3
Cy
CS2
Et2O
A
B
C
EtOH
EtOH
P
C
430
422
422
429
435
425
435
% III/II
max
A –
acetone
B –
benzene
C –
chloroform
CS2
–
carbon disulphide
Cy
–
cyclohexane
Et2O
–
diethyl ether
EtOH
–
ethanol
H
–
hexane
P
–
light petroleum
[1] – Britton, G., Liaaen-Jensen, S., Pfander, H., Carotenoids Volume 1B: Spectroscopy, 1995
55
60
55
25
25
98
95
25
26
Proponowana literatura:
1. Wanda Leyko (red.), Biofizyka dla Biologów, PWN Warszawa, 1983
2. Jerzy Kączkowski, Biochemia roślin, PWN Warszawa, 1992
3. Lubert Stryer, Biochemia, PWN Warszawa 1997
4. Jan Sielewiesiuk, Fotoprotekcyjna rola karotenoidów w świetle badań modelowych,
Rozprawa habilitacyjna Lublin, 1988
5. Wiesław I. Gruszecki, Formy zagregowane wiolaksantyny i cykl wiolaksantynowy,
Rozprawa habilitacyjna Lublin, 1991
6. Rafał Luchowski, Zastosowanie spektroskopii efektu Starka do badania oddziaływań
molekularnych nukleotydów, Rozprawa doktorska, Lublin, 2000, (rozdział I.4).