pobierz plik - Wydział Biologii UW

Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr. Kamila Steczkiewicza
“Sequence and structure diversity of PD-(D/E)XK phosphodiesterases”
Promotor rozprawy:
Promotor pomocniczy:
Recenzenci:
prof. Ewa Bartnik, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
dr Krzysztof Ginalski, Centrum Nowych Technologii, Uniwersytet Warszawski
prof. Andrzej Koliński, Wydział Chemii, Uniwersytet Warszawski
dr hab. Krzysztof Pawłowski, Katedra Doświadczalnictwa i Bioinformatyki, SGGW
Rozprawa doktorska przygotowana pod kierunkiem dr. Krzysztofa Ginalskiego w Laboratorium Bioinformatyki i
Biologii Systemów, Centrum Nowych Technologii, Uniwersytet Warszawski
Fosfodiesterazy PD-(D/E)XK tworzą zróżnicowaną sekwencyjnie i strukturalnie nadrodzinę białek.
Początkowo identyfikowane były jako enzymy restrykcyjne, będące istotnym elementem bakteryjnych
systemów restrykcji i modyfikacji DNA. Obecnie wiadomo, że występują w organizmach należących do
wszystkich domen życia i uczestniczą m.in. w naprawie i ochronie materiału genetycznego, transpozycji,
dojrzewaniu tRNA oraz translacji. Funkcjonują jako endonukleazy, egzonukleazy, fosfatazy lub, jeśli są
nieaktywne enzymatycznie, wiążą kwasy nukleinowe. W zależności od pełnionej funkcji wykazują
specyficzność substratową względem określonej sekwencji nukleotydowej (np. endonukleazy
restrykcyjne) lub struktury przestrzennej kwasu nukleinowego (np. rezolwazy). Pomimo zróżnicowania
funkcji i mechanizmów działania, fosfodiesterazy PD-(D/E)XK charakteryzują się zachowaniem
wspólnego rdzenia strukturalnego będącego rusztowaniem dla centrum aktywnego, które w kanonicznej
postaci składa się z kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego oraz lizyny. Jednocześnie,
różnorodności funkcji w obrębie tej nadrodziny białek towarzyszy znaczna zmienność sekwencyjna oraz
strukturalna. Założeniem niniejszej rozprawy doktorskiej było zidentyfikowanie wszystkich rodzin białek
należących do nadrodziny fosfodiesteraz PD-(D/E)XK oraz zaproponowanie ich spójnej klasyfikacji.
Wykrywanie podobieństw sekwencyjnych, będące podstawą opisanych w niniejszej rozprawie prac,
przeprowadziłem z wykorzystaniem metody Meta-BASIC opartej na porównywaniu meta profili,
łączących informację sekwencyjną z przewidywaną informacją o strukturze drugorzędowej.
Porównywanie meta profili sekwencyjnych pozwala na wykrywanie homologii między białkami znacznie
różniącymi się na poziomie sekwencyjnym, lecz ciągle zachowującymi podobieństwo strukturalne.
Metodę tę zastosowałem do przewidywania struktury i funkcji dla białek należących do rodzin DUF2401
oraz DUF2319. Wykazałem, że białka z rodziny DUF2401 są aktywnymi homologami hydrolaz
glikozylowych oraz mogą brać udział w procesie modyfikacji struktury ściany komórkowej, np. u
drożdży podczas pączkowania. Przeprowadziłem również analizę bioinformatyczną białek z rodziny
DUF2319, w której wykazałem, że te błonowe białka są odległymi homologami hydrolaz alfa/beta.
Ponadto wskazałem na zachowanie aminokwasów katalitycznych, charakterystycznych dla tej klasy
enzymów, co może świadczyć o ich potencjalnej aktywności hydrolitycznej. Białka te występują głównie
w organizmach zasiedlających środowiska bogate w tłuszcze. Analiza architektury operonów dla białek z
tej rodziny pozwoliła na postawienie hipotezy o ich roli w początkowych etapach metabolizmu
tłuszczów.
Opracowaną w wyżej opisanych projektach metodologię wykorzystałem do analizy jednej z
najbardziej zróżnicowanych pod względem sekwencyjnym i strukturalnym nadrodzin białek, jaką są
fosfodiesterazy PD-(D/E)XK. Wykrycie podobieństw sekwencyjnych pomiędzy ewolucyjnie odległymi
przedstawicielami tej nadrodziny wymagało wykorzystania zaawansowanych metod bioinformatycznych,
w tym podejścia tranzytywnego oraz analizy mapowań o różnej wiarygodności wspartej dodatkowym
modelowaniem oraz ekspercką wiedzą z zakresu struktury i funkcji analizowanych białek. W wyniku
przeprowadzonych prac zidentyfikowałem 118 rodzin białkowych opisanych w bazie Pfam, 49 rodzin z
bazy COG, 11 rodzin z bazy KOG oraz 99 struktur PDB. Klastrowanie sekwencyjne obejmujące
wszystkie znalezione rodziny i struktury pozwoliło na wyróżnienie 121 grup białek. Pięć
zidentyfikowanych rodzin nie posiadało adnotacji strukturalnej i funkcjonalnej, a w przypadku kolejnych
sześciu znana była jedynie funkcja, nie znano natomiast ich struktury przestrzennej. Dla każdej ze 121
grup zidentyfikowałem domenę fosfodiesterazy PD-(D/E)XK oraz wskazałem aminokwasy, które tworzą
jej centrum aktywne. Dane te mogą stanowić punkt wyjścia dla dalszych badań doświadczalnych
prowadzących do poznania szczegółowej funkcji dla niescharakteryzowanych przedstawicieli tej
nadrodziny białek. Dalsza analiza architektury centrum aktywnego wykazała istnienie wielu nieopisanych
dotąd przypadków migracji aminokwasów katalitycznych. Opisałem również zmienność strukturalną tych
białek ze szczególnym uwzględnieniem cyklicznych permutacji struktur drugorzędowych oraz insercji
dodatkowych elementów strukturalnych. Wynikiem pracy jest spójna, jednorodna i unikatowa
klasyfikacja nadrodziny fosfodiesteraz PD-(D/E)XK.
Jednym ze zidentyfikowanych przeze mnie białek należących do nadrodziny fosfodiesteraz PD(D/E)XK był niescharakteryzowany dotychczas enzym ludzki – Ddk1, dla którego zbudowałem model
struktury przestrzennej, wskazałem położenie aminokwasów tworzących centrum aktywne oraz
zaproponowałem funkcję nukleazy. Przewidywania teoretyczne zostały potwierdzone przez grupę prof.
Andrzeja Dziembowskiego, która wykazała eksperymentalnie, że Ddk1 jest mitochondrialną,
funkcjonującą jako monomer nukleazą procesującą jednoniciowe DNA. Przeprowadzone przeze mnie
analizy bioinformatyczne pozwoliły na szczegółowe wyjaśnienie obserwowanych własności białka Ddk1
w kontekście strukturalnym.
Podsumowując, w swojej pracy doktorskiej przewidziałem strukturę i funkcję dla białek należących
do rodzin DUF2401 oraz DUF2319, dokonałem całościowej klasyfikacji fosfodiesteraz PD-(D/E)XK oraz
zidentyfikowałem 11 nowych rodzin białkowych należących do tej nadrodziny, jak również
zaproponowałem mechanizm działania ludzkiej nukleazy Ddk1, który został potwierdzony
doświadczalnie.
W skład niniejszej rozprawy wchodzą cztery publikacje:
1. Steczkiewicz K, Knizewski L, Rychlewski L, Ginalski K (2010) TOS1 is circularly permuted 1,3beta-glucanase. Cell Cycle 9:201-204.
2. Lazniewski M, Steczkiewicz K, Knizewski L, Wawer I, Ginalski K (2011) Novel transmembrane
lipases of alpha/beta hydrolase fold. FEBS Lett 585:870-874.
3. Steczkiewicz K, Muszewska A, Knizewski L, Rychlewski L, Ginalski K (2012) Sequence, structure
and functional diversity of PD-(D/E)XK phosphodiesterase superfamily. Nucleic Acids Res 40:70167045.
4. Szczesny RJ, Hejnowicz MS, Steczkiewicz K, Muszewska A, Borowski LS, Ginalski K,
Dziembowski A (2013) Identification of a novel human mitochondrial endo-/exonuclease Ddk1/c20orf72
necessary for maintenance of proper 7S DNA levels. Nucleic Acids Res 41:3144-3161.
Publikacja „Sequence, structure and functional diversity of PD-(D/E)XK phosphodiesterase superfamily”
została wyróżniona przez redakcję czasopisma Nucleic Acid Research jako NAR’s featured article (5%
najlepszych artykułów publikowanych w czasopiśmie pod względem oryginalności, znaczenia oraz
wartości naukowej).