docceluloza bakteryjna jako nanobiomateria
download 
Reklamacja Transkrypt
celuloza bakteryjna jako nanobiomateria
CELULOZA BAKTERYJNA JAKO NANOBIOMATERIA£ POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI 85 TOM 36, 2009 SUPLEMENT NR 25 (8598) RolaCELULOZA BAKTERYJNA JAKO NANOBIOMATERIA£ BACTERIAL CELLULOSE AS A NANOBIOMATERIAL Katarzyna KUBIAK, Halina KALINOWSKA, Marta PEPLIÑSKA, Stanis³aw BIELECKI Instytut Biochemii Technicznej, Wydzia³ Biotechnologii i Nauk o ¯ywnoci, Politechnika £ódzka, £ód Streszczenie: Celuloza bakteryjna jest nanobiomateria³em o interesuj¹cych w³aciwociach, decyduj¹cych o jej szerokim zastosowaniu w medycynie i licznych CELULOZA BAKTERYJNA JAKO NANOBIOMATERIA£ dziedzinach techniki. Ten wytwarzany biotechnologicznie materia³ charakteryzuje siê m.in. ogromn¹ higroskopijnoci¹, wysok¹ czystoci¹ chemiczn¹, unikaln¹ struktur¹ BACTERIAL CELLULOSE AS A NANOBIOMATERIAL oraz pe³n¹ biokompatybilnoci¹, biofunkcjonalnoci¹ i brakiem toksycznoci. Jednak dotychczas molekularne podstawy biosyntezy celulozy przez Gluconacetobacter HalinaZnane KALINOWSKA, Marta PEPLIÑSKA, xylinusKatarzyna nie s¹ do KUBIAK, koñca poznane. dotychczas sekwencje i funkcje genów i Stanis³aw BIELECKI bia³ek bezporednio zaanga¿owanych w szlak metaboliczny, prowadz¹cy do syntezy 1,4-beta-glukanu nie s¹ wystarczaj¹ce do zrozumienia sieci zale¿noci i regulacji, Instytut Biochemii Technicznej, Wydzia³ Biotechnologii i Nauk o ¯ywnoci, decyduj¹cych o intensywnoci tego procesu oraz w³aciwociach wydzielanej Politechnika £ódzka, £ód celulozy. Prawdopodobnym wydaje siê zaanga¿owanie w te mechanizmy globalnych regulatorów ekspresji genów, znanych z opisanych wczeniej mechanizmów Streszczenie: Celuloza bakteryjna jest nanobiomateria³em o interesuj¹cych w³aciwociach, decyduj¹cych kontroluj¹cych tworzenie biofilmów przez organizmy modelowe. Ze wzglêdu na swój o jej szerokim zastosowaniu w medycynie i licznych dziedzinach techniki. Ten wytwarzany biotechnopotencja³ aplikacyjny, zarówno w formie natywnej jak i zmodyfikowanej, logicznie materia³ charakteryzuje siê m.in. ogromn¹ higroskopijnoci¹, wysok¹ czystoci¹ chemiczn¹, wykraczaj¹cy zewnêtrzne i wewnêtrzne zastosowaniai brakiem w medycynie, celuloza unikaln¹ struktur¹poza oraz pe³n¹ biokompatybilnoci¹, biofunkcjonalnoci¹ toksycznoci. Jednak bakteryjna to materia³ przysz³oci, odkrycia w obszarzexylinus molekularnych systemów molekularne podstawy biosyntezy celulozya przez Gluconacetobacter nie s¹ do koñca poznane. Znane dotychczas sekwencje imog¹ funkcjedoprowadziæ genów i bia³ek bezporednio zaanga¿owanych w szlak metaboliczkontroli jej biosyntezy do znacznego zwiêkszenia jej produkcji ny, prowadz¹cy do syntezy b-1,4-glukanu nie s¹ wystarczaj¹ce do zrozumienia sieci zale¿noci i regulana skalê przemys³ow¹. cji, decyduj¹cych o intensywnoci tego procesu oraz w³aciwociach wydzielanej celulozy. PrawdopoS³owa kluczowe: nanomateria³y, celuloza bakteryjna, biosynteza c-didobnym wydaje siê zaanga¿owanie w te mechanizmy globalnych regulatorów ekspresjicelulozy, genów, znanych GMP, regulacja ekspresji genów, CsrA/BC,tworzenie sRNA biofilmów przez organizmy modelowe. z opisanych wczeniej mechanizmów kontroluj¹cych Ze wzglêdu na swój potencja³ aplikacyjny w formie natywnej, jak i zmodyfikowanej, wykraSummary: Bacterial cellulose zarówno is a nanobiomaterial with many interesting czaj¹cy poza zewnêtrzne i wewnêtrzne zastosowania w medycynie, celuloza bakteryjna to materia³ characteristics, deciding of its numerous applications in medicine and other areas. przysz³oci, a odkrycia w obszarze molekularnych systemów kontroli jej biosyntezy mog¹ doprowadziæ This material is biotechnologically obtained and shows several important features: do znacznego zwiêkszenia jej produkcji na skalê przemys³ow¹. is extremely hygroscopic, chemically pure, uniquely structured, biocompatible, S³owa kluczowe: nanomateria³y, celuloza bakteryjna, biosynteza celulozy, c-di-GMP, regulacja ekspresji biofunctional non-toxic. However, its biosynthesis by Gluconacetobacter xylinus genów, CsrA/BC,and sRNA. has not been completely elucidated at the molecular level. The knowledge on Summary: Bacterial cellulose is a nanobiomaterial with many interesting characteristics, deciding of its sequences and functions of known genes and proteins that are directly involved in numerous applications in medicine and other areas. This material is biotechnologically obtained and shows the metabolic pathway producing the 1,4-?-glucan is insufficient to understand the several important features: is extremely hygroscopic, chemically pure, uniquely structured, biocompatible, overall network of the However, interplayitsand regulation influencing the intensity bacterial biofunctional and non-toxic. biosynthesis by Gluconacetobacter xylinus has notof been completely elucidated at the molecular level. The knowledge on sequences andmechanism functions of known genes and cellulose synthesis and its properties. It is possible that this involves some proteins that are directly involved in the metabolic pathway producing the b-1,4-glucan is insufficient to global gene expression regulators which are known from described earlier understand the overall network of the interplay and regulation influencing the intensity of bacterial cellulose mechanisms formation ofthis biofilms by involves model some organisms. Due to its synthesis and itscontrolling properties. It is possible that mechanism global gene expression applicable potential nativeearlier and mechanisms modified controlling form, exceeding itsbiofilms external and regulators which are knownboth from in described formation of by model organisms. uses Due toinits medicine, applicable potential both cellulose in native andismodified form, exceeding its external and internal bacterial a material of future. Expected internal uses in medicine, bacterial cellulose is a material of future. Expected discoveries in a field of molecular discoveries in a field of molecular control systems of BC biosynthesis can give rise control systems of BC biosynthesis can give rise to its much larger production in industrial scale. to its much larger production in industrial scale. KeyKey words:words: nanomaterials, bacterial cellulose, cellulose biosynthesis, c-di-GMP, gene expression regulation, CsrA/BC, sRNA. nanomaterials, bacterial cellulose, cellulose biosynthesis, c-di-GMP, gene expression regulation, CsrA/BC, sRNA WSTÊP Nanomateria³y, zawdziêczaj¹ce sw¹ nazwê wymiarom, z których co najmniej jeden mieci siê w przedziale od 1 do 100 nm i z tego wzglêdu posiadaj¹ce 86 K. KUBIAK, H. KALINOWSKA, M. PEPLIÑSKA, S. BIELECKI WSTÊP Nanomateria³y, zawdziêczaj¹ce sw¹ nazwê wymiarom, z których co najmniej jeden mieci siê w przedziale od 1 do 100 nm i z tego wzglêdu maj¹ce stosunkowo du¿¹ powierzchniê w³aciw¹ (stosunek powierzchni do masy), charakteryzuj¹ siê wysok¹ reaktywnoci¹ chemiczn¹ [47]. Jest ona spowodowana silniejszymi, w porównaniu z tradycyjnymi materia³ami, oddzia³ywaniami pomiêdzy atomami wchodz¹cymi w sk³ad nanomateria³ów a otoczeniem. Wp³yw efektów kwantowych nadaje im unikalne w³aciwoci optyczne, magnetyczne i elektryczne. Dziêki tym cechom nanomateria³y znajduj¹ coraz to nowe zastosowania praktyczne, przede wszystkim w elektronice, medycynie, chemii i produkcji materia³ów kompozytowych. Na przyk³ad ich dodatek do wyrobów hutniczych i tworzyw sztucznych podnosi odpornoæ chemiczn¹ i wytrzyma³oæ mechaniczn¹, za u¿ycie do produkcji materia³ów medycznych pozwoli³o zwiêkszyæ skutecznoæ terapii przeciwnowotworowych i przyspieszyæ gojenie ran. Jak dot¹d, wiêkszoæ nanomateria³ów otrzymuje siê przy zastosowaniu metod chemicznych, fizycznych i fizykochemicznych. Wymagaj¹ one stosowania wyspecjalizowanej aparatury i sterylnej czystoci linii technologicznych. Ich przyk³adami s¹ np. synteza chemiczna dendrymerów i innych polimerów, fotolitografia, nak³adanie monowarstw atomów, techniki laserowe itp. Interesuj¹c¹ alternatyw¹ dla wyrafinowanych i kosztownych nanotechnologii jest produkcja nanomateria³ów metodami biotechnologicznymi z wykorzystaniem ¿ywych organizmów b¹d preparatów enzymatycznych. W ten sposób najczêciej otrzymywane s¹ niektóre nanobiomateria³y, takie jak np. polisacharydy i materia³y kompozytowe, powsta³e w wyniku ich modyfikacji. Do tej grupy nale¿y celuloza bakteryjna i jej pochodne. NANOBIOMATERIA£Y: W£ACIWOCI I ZASTOSOWANIA Stosunkowo du¿a grupa nanomateria³ów jest stosowana w medycynie, co poci¹ga za sob¹ kontakt z ¿ywymi komórkami oraz tkankami. Z tego wzglêdu musz¹ one spe³niaæ szereg wymogów: efektem ich wprowadzenia do organizmu nie mo¿e byæ nowotworzenie, musz¹ byæ biokompatybilne (nie wykazywaæ cytotoksycznoci) oraz biofunkcjonale (byæ zdolne do biologicznych, biofizycznych i biochemicznych oddzia³ywañ z ¿ywym organizmem) i hipoalergiczne oraz nie mog¹ wywo³ywaæ reakcji zapalnej ani w inny sposób stymulowaæ systemu immunologicznego organizmu [35]. W zale¿noci od zastosowania biomateria³y albo musz¹ wykazywaæ wysok¹ adhezjê do bia³ek (je¿eli s¹ np. nonikami cz¹steczek aktywnych), albo wprost przeciwnie, powinny zapobiegaæ ich wi¹zaniu (je¿eli np. stymulowa³yby niepo¿¹dan¹ adhezjê komórek lub rozwój mikrobiologicznego biofilmu) [2]. Wyznacznikiem tej cechy jest tzw. krytyczne naprê¿enie powierzchniowe CST (ang. Critical Surface Tensions), które w tym drugim przypadku powinno mieciæ siê w zakresie 2030 mN/m. CELULOZA BAKTERYJNA JAKO NANOBIOMATERIA£ 87 Do nanobiomateria³ów stosowanych w medycynie nale¿¹: nanomuszelki (ang. nanoshells), nanorurki wêglowe, dendrymery, kwantowe kropki (ang. quantum dots), superparamagnetyczne nanocz¹steczki, liposomy [23], nanocz¹steczki o charakterze przeciwutleniaczy (np. tlenek trójwartociowego ceru) [21], a tak¿e niektóre biomoleku³y, np. polipeptydy o charakterze kopolimerów [8] i polisacharydy [4], otrzymywane metodami biotechnologicznymi. Stosowane s¹ one w nastêpuj¹cych zastosowaniach: a) do ukierunkowanego i kontrolowanego transportu leków do okrelonych narz¹dów czy tkanek, gdy¿ dziêki mo¿liwoci przenikania przez b³ony komórkowe stanowi¹ tzw. inteligentne noniki enzymów, receptorów i innych bia³ek oraz zwi¹zków chemicznych, o charakterze leczniczym; b) jako opatrunki do leczenia ran, zw³aszcza przewlek³ych, o ró¿nej etiologii, zapewniaj¹ce przyspieszenie procesu gojenia, regeneracjê tkanek i ochronê przed wtórnymi infekcjami; c) jako doskonalsze, nowe materia³y do produkcji: sztucznych organów hybrydowych, implantów, pow³ok, przeciwdzia³aj¹cych rozwojowi biofilmów wytwarzanych przez mikroorganizmy chorobotwórcze; a tak¿e narzêdzi tn¹cych [28]. Przyk³adem pierwszego z wymienionych zastosowañ s¹ próby wykorzystania wspomnianych wy¿ej nanomuszelek w nowej odmianie terapii fotodynamicznej. Nanocz¹steczki te s¹ zbudowane z krzemowego centrum, otoczonego cieniutk¹ warstewk¹ atomów z³ota, które absorbuj¹ i rozpraszaj¹ fale wietlne z zakresu bliskiej podczerwieni, wydzielaj¹c przy tym ciep³o. Przy³¹czone s¹ do nich, za porednictwem glikolu polietylenowego, przeciwcia³a specyficzne wobec bia³ek znajduj¹cych siê na powierzchni komórek rakowych. Dziêki nim wprowadzone do krwiobiegu nanomuszelki wybiórczo wi¹¿¹ siê z markerami powierzchniowymi komórek nowotworowych, za nawietlone falami o odpowiedniej d³ugoci (np. 800 nm) silnie siê nagrzewaj¹, co prowadzi do zniszczenia tych¿e komórek. Jako specyficzne noniki cz¹steczek kwasów nukleinowych i innych zwi¹zków terapeutycznych do wnêtrza komórek testowane s¹ tak¿e nanorurki wêglowe, czy dendrymery. Te drugie s¹ kulistymi polimerami o rozga³êzionym j¹drze, zbudowanym np. z reszt kwasu akrylowego i etylenodiaminy, do którego do³¹czone s¹ kolejne warstwy rozga³êzionych zwi¹zków, np. cukrów prostych. Uzyskana w ten sposób du¿a iloæ grup aktywnych na powierzchni dendrymeru pozwala przy³¹czyæ np. barwniki fluorescencyjne, zwi¹zki rozpoznawane przez okrelone receptory, leki i tym podobne substancje, co czyni dendrymery przydatnymi zarówno w diagnostyce, jak i w terapii (np. przeciwnowotworowej). Innymi nanocz¹steczkami przydatnymi w diagnostyce s¹ tzw. nanokropki kwantowe, czyli zbudowane z pó³przewodników (np. selenku kadmu pokrytego siarczkiem cynku, razem 1050 atomów) nanokryszta³y o rednicy od 2 do 10 nm, zwi¹zane z np. specyficznymi bia³kami lub kwasami nukleinowymi. Poniewa¿ wykazuj¹ fluorescencjê wzbudzan¹ falami UV, mo¿na obserwowaæ np. ich lokalizacjê wewn¹trz organizmu, tkanki czy komórki. Jeli s¹ przy³¹czone do specyficznych przeciwcia³, rozpoznaj¹cych komórki rakowe, mog¹ u³atwiaæ wykrycie guzów. W podobnym celu wykorzystuje siê superparamagnetyczne nanocz¹steczki o rednicy poni¿ej 10 nm, 88 K. KUBIAK, H. KALINOWSKA, M. PEPLIÑSKA, S. BIELECKI zbudowane z tlenków ¿elaza, w tym magnetytu Fe3O4, które s¹ doskona³ym rodkiem kontrastowym podczas badañ z zastosowaniem rezonansu magnetycznego. Równie¿ liposomy stanowi¹ nonik do transportu substancji leczniczych do wnêtrza komórek, gdy¿ w³aciwoci ich otoczki umo¿liwiaj¹ fuzjê z b³on¹ komórkow¹. Nie s¹ one nanomateria³ami sensu stricte, gdy¿ rednica tych otoczonych dwuwarstw¹ lipidow¹ pêcherzyków waha siê od 90 do 150 nm, ale umownie zalicza siê je do tych substancji. Do nanomateria³ów stosowanych jako materia³y opatrunkowe oraz sk³adnik implantów nale¿y celuloza bakteryjna. Jest ona jednym z wielu polisacharydów syntetyzowanych przez drobnoustroje. Polimery te s¹ generalnie rzecz bior¹c doskona³ym przyk³adem gotowych do u¿ycia nanobiomateria³ów, odznaczaj¹cych siê wysok¹ czystoci¹ chemiczn¹ i bardzo uporz¹dkowan¹ budow¹. Zalet¹ wiêkszoci polisacharydów mikrobiologicznych jest regularna, liniowa lub rozga³êziona struktura, zapewniaj¹ca przyjmowanie przez ³añcuch uporz¹dkowanej konformacji nawet w rozcieñczonych roztworach wodnych i/lub tworzenie stabilnych ¿eli lub liotropowych ciek³ych kryszta³ów [11]. Ich w³aciwoci mo¿na jeszcze udoskonaliæ za pomoc¹ manipulacji genetycznych szczepu producenta, przez zastosowanie odpowiednich warunków podczas hodowli drobnoustroju albo stosuj¹c modyfikacje chemiczne i/lub enzymatyczne po zakoñczeniu procesu hodowlanego. W£ACIWOCI CELULOZY BAKTERYJNEJ Celuloza bakteryjna jest nanomateria³em, gdy¿ ³añcuchy liniowego b-1,4-glukanu o stopniu polimeryzacji zbli¿onym do 15000 tworz¹ nanofibryle o przekroju poprzecznym 510 nm ´ 3035 nm [4]. Te z kolei tworz¹ wstêgi o szerokoci 70150 nm (ryc. 1). Polisacharyd wytwarzany przez bakterie ma szereg zalet w porównaniu z celuloz¹ rolinn¹. Charakteryzuje siê mniejszym przekrojem RYCINA 1. U³o¿enie przestrzenne nanow³ókien celulozy bakteryjnej tworz¹cych membranê [4] FIGURE 1. Arrangement of nanofibers building up a bacterial cellulose membrane [4] CELULOZA BAKTERYJNA JAKO NANOBIOMATERIA£ 89 poprzecznym w³ókien, wysokim stopniem krystalicznoci (ponad 60%) i brakiem zanieczyszczeñ, takich jak hemicelulozy czy lignina. Najwydajniejszymi producentami celulozy bakteryjnej s¹ szczepy gram-ujemnych, tlenowych bakterii Gluconacetobacter xylinus (wczeniej klasyfikowanych jako Acetobacter xylinum). W warunkach laboratoryjnych, aby utrzymaæ siê na powierzchni ciek³ych po¿ywek, gdzie nie grozi im brak tlenu, syntetyzuj¹ one bia³¹, skóropodobn¹, silnie uwodnion¹, elastyczn¹ i zwi¹zan¹ z komórkami membranê. Ga. xylinus nale¿y do drobnoustrojów barotolerancyjnych i syntetyzuje BC nawet pod cinieniem do 100 MPa, choæ ze wzrostem cinienia obni¿a siê wydajnoæ tego procesu [20]. Membrany wytwarzane przez szczepy Ga. xylinus i innych bakterii ró¿ni¹ siê elastycznoci¹, zdolnoci¹ wi¹zania wody, stopniem polimeryzacji (zwykle 20006000, ale w niektórych przypadkach nawet 16000 lub 20000) i stopniem krystalicznoci. W³aciwoci te zale¿¹ tak¿e od warunków hodowli (stacjonarna lub wstrz¹sana), czasu jej trwania i sk³adu pod³o¿a (ród³a C i N, obecnoci innych polimerów, np. kolagenu, hemiceluloz) oraz od metody oczyszczania BC z komórek bakterii i resztek pod³o¿a, a tak¿e sposobu ewentualnej modyfikacji po zakoñczeniu hodowli. Drog¹ modyfikacji fizyko-chemicznych celulozy bakteryjnej otrzymano inne ciekawe nanomateria³y, do których nale¿¹ nanoprzewodniki zbudowane z nanokryszta³ów TiO2 [55] lub ZnO [5], zwi¹zanych z matryc¹ celulozow¹. Wiele badañ nad Ga. xylinus jako wydajnym producentem celulozy by³o powiêconych przede wszystkim optymalizacji sk³adu pod³ó¿ hodowlanych i warunków prowadzenia hodowli. Ogromn¹ zalet¹ szczepów Ga. xylinus jest ich dobry wzrost na ró¿norodnych ród³ach wêgla i azotu. Celem obni¿enia kosztów produkcji BC bakterie bywaj¹ hodowane na po¿ywkach zawieraj¹cych substancje odpadowe, takie jak np. glicerol, melasa, serwatka, odpady przetwórstwa warzyw itp. [1, 26, 45]. Zauwa¿ono równie¿, ¿e szczepy Ga. xylinus wydajnie produkuj¹ b³onê celulozow¹ na pod³o¿ach sta³ych lub o charakterze ¿elu [13]. Z kolei szerokoæ wstêg BC uda³o siê zwiêkszyæ przez dodatek do po¿ywki chloramfenikolu, który powodowa³ wyd³u¿enie komórek Ga. xylinus, a tym samym wp³yn¹³ na wzajemne po³o¿enie por, przez które wydzielane s¹ poza komórkê ³añcuchy b-1,4-glukanu [53]. Istotn¹ obserwacj¹ wydaj¹ siê tak¿e doniesienia na temat intensyfikacji produkcji BC przez Ga. xylinus hodowanych w jednym pod³o¿u z Lactobacillus mali. Co ciekawe, hodowla mieszana z innymi gatunkami bakterii kwasu mlekowego nie mia³a wp³ywu na produkcjê BC [39]. Badania te mog¹ sugerowaæ istnienie wspó³zale¿noci pomiêdzy tymi dwoma gatunkami, mog¹cymi w naturze konkurowaæ o rodowisko ¿ycia, gdy¿ obydwa bytuj¹ na materiale rolinnym. Sugestia na temat wytwarzania b³ony celulozowej celem dominacji innych gatunków, zajmuj¹cych tê sam¹ niszê ekologiczn¹, znalaz³a siê tak¿e w bardzo wczesnej pracy Williamsa i Cannona [49]. Autorzy dowiedli ponadto, ¿e b³ona celulozowa pe³ni funkcje ochronne przed szkodliwymi czynnikami rodowiskowymi (np. promieniowanie UV, niska wilgotnoæ). Cechy te sugeruj¹, ¿e b³ona celulozowa stanowi rodzaj biofilmu wytwarzanego przez Ga. xylinus. 90 K. KUBIAK, H. KALINOWSKA, M. PEPLIÑSKA, S. BIELECKI MOLEKULARNE ASPEKTY BIOSYNTEZY CELULOZY PRZEZ Gluconacetobacter xylinus Pomimo d³ugoletnich badañ nad optymalizacj¹ warunków hodowli Ga. xylinus, w tej chwili nie jest mo¿liwa pe³na kontrola procesu biosyntezy celulozy ani jej w³aciwoci. Aby osi¹gn¹æ ten cel, konieczne s¹ szerokie badania genetyczne, umo¿liwiaj¹ce poznanie zale¿noci molekularnych pomiêdzy bia³kami zaanga¿owanymi bezporednio i porednio w wydzielanie tego polimeru. Istotnym utrudnieniem we wdro¿eniu procesu biosyntezy celulozy do przemys³u jest ogromna ró¿norodnoæ pomiêdzy szczepami Ga. xylinus pod wzglêdem wymogów pokarmowych, jak i wydajnoci produkcji BC. Ponadto, w przypadku niektórych szczepów obserwuje siê powstawanie komórek niewytwarzaj¹cych celulozy (tzw. formy Cel), szczególnie czêsto podczas hodowli wg³êbnych. Dotychczas nie zosta³y wyjanione molekularne podstawy wystêpowania tej zmiennoci fenotypowej Ga. xylinus. Jedn¹ z dyskutowanych w literaturze przyczyn jest obecnoæ elementu insercyjnego IS1031, jednak jego decyduj¹ca rola w powstawaniu form Cel nie zosta³a jednoznacznie udowodniona [10]. Szczepy Ga. xylinus zawieraj¹ zwykle system kilku plazmidów o ró¿nej wielkoci (od 16 do 300 kpz). Na ogó³ komórki Cel+ i Cel ró¿ni¹ siê profilem plazmidowym, ale nale¿y podkreliæ, ¿e znaleziono równie¿ szczepy syntetyzuj¹ce BC i niemaj¹ce plazmidów [46]. Dotychczas materia³ genetyczny Ga. xylinus nie zosta³ zsekwencjonowany, taki projekt trwa w NITE (National Institute of Technology and Evaluation) w Japonii (wed³ug informacji podanej na stronie http://www.bio.nite.go.jp/ngac/e/project-e.html). W bazach danych zamieszczono jak dot¹d 90 sekwencji nukleotydowych i 160 sekwencji bia³ek Ga. xylinus, w wiêkszoci zwi¹zanych bezporednio z biosyntez¹ celulozy. Organizacja operonu syntazy celulozowej jest znana od ponad dekady. Operon ten zawiera gen syntazy celulozy (podjednostki katalitycznej) acsA oraz gen bia³ka wi¹¿¹cego cz¹steczkê cyklicznego diguanozylomonofosforanu (c-di-GMP) acsB, pe³ni¹cego funkcjê aktywatora podjednostki A [24]. Ponadto, u czêci szczepów Ga. xylinus (m.in. ATCC 53582) zidentyfikowano równie¿ geny acsC i acsD, których produkty prawdopodobnie odgrywaj¹ rolê, odpowiednio, w formowaniu porów w zewnêtrznej otoczce (podjednostka C) oraz w procesie krystalizacji celulozy (podjednostka D) [50]. Obecnoæ obydwu genów jest niezbêdna do biosyntezy celulozy in vivo, ale nie jest wymagana dla syntezy BC in vitro [37]. Ponadto proces in vivo wymaga wspó³dzia³ania syntazy celulozowej i bia³ek enzymatycznych, kodowanych przez pewne geny umiejscowione poni¿ej i powy¿ej jej operonu, takich jak: b-glukozydaza [43], b-1,4-glukanaza i bia³ko CcpAX (ang. Cellulose complementing Protein Acetobacter xylinum). Ich dok³adna rola w procesie biosyntezy BC nie zosta³a dotychczas wyjaniona. Szlak metaboliczny prowadz¹cy do powstania celulozy rozpoczyna siê od przekszta³cenia glukozy w urydynodi-fosfoglukozê (UDP-glukozê), która jest donorem reszt b-D-glukopiranozy do reakcji polimeryzacji b-1,4-glukanu. W procesie tym bierze udzia³ co najmniej 8 bia³ek, w tym 4 kluczowe enzymy: glukokinaza, fosfoglukomutaza, urydililotransferaza glukozo-1-fosforanowa i wspomniana wy¿ej syntaza celulozowa. Bia³ka te oraz sekwencje koduj¹cych je genów s¹ dobrze poznane [4, 22], ale nic nie wiadomo na temat regulacji ich ekspresji. CELULOZA BAKTERYJNA JAKO NANOBIOMATERIA£ 91 Jedynym potwierdzonym mechanizmem regulacji procesu biosyntezy celulozy u Ga. xylinus jest wspomniana wy¿ej allosteryczna aktywacja podjednostki B syntazy celulozowej poprzez c-di-GMP [18, 37]. Za kontrolê poziomu tego zwi¹zku w komórce odpowiadaj¹ enzymy o przeciwnych funkcjach: cyklazy diguanylowe (DGC, odpowiedzialne za jego syntezê z dwóch cz¹steczek GTP z uwolnieniem dwóch cz¹steczek pirofosforanu) i fosfodiesterazy A (PDE A, odpowiedzialne za jego degradacjê do nieaktywnego, liniowego pGpG, ulegaj¹cego dalszej hydrolizie do GMP, katalizowanej przez PDE B). Geny tych trzech enzymów tworz¹ wspólny operon (pomimo przeciwstawnych aktywnoci), wystêpuj¹cy u Ga. xylinus w 3 ró¿nych wariantach, których ekspresja dostarcza odpowiednio 80, 15 i 5% tych bia³ek [44]. W budowie fosfodiesterazy A zidentyfikowano domenê sensoryczn¹, zawieraj¹c¹ hem, która powoduje obni¿enie zdolnoci tego enzymu do hydrolizy c-di-GMP w warunkach dobrego natlenienia [7]. Stanowi to czêciowe wyjanienie gorszej wydajnoci produkcji BC w hodowlach wg³êbnych. W³aciwoæ ta nie jest jednak uniwersalna dla wszystkich szczepów Ga. xylinus. Cyklazy diguanylowe i fosfodiesterazy zawieraj¹ charakterystyczne domeny GGDEF i EAL. Na podstawie ich obecnoci zaczêto klasyfikowaæ podobne bia³ka, znajdowane u innych mikroorganizmów. Wród licznych funkcji, pe³nionych przez bia³ka z tych rodzin ich wspóln¹ cech¹ jest udzia³ w kontroli poziomu c-di-GMP w komórce. Obecnie c-di-GMP jest uwa¿any za tzw. bakteryjny wtórny przekanik (ang. secondary messenger). Udowodniono jego regulacyjn¹ rolê w wielu ró¿nych procesach komórkowych poprzez m.in. uzale¿nianie ich tempa od sygna³ów p³yn¹cych ze rodowiska [38]. Czêsto kontrolowane z jego udzia³em szlaki s¹ zaanga¿owane w syntezê sk³adników biofilmu (m.in. celulozy). Najnowsze badania w komórkach Escherichia coli ujawni³y nadrzêdn¹ rolê globalnego regulatora CsrA (ang. Carbon storage regulator A) w kontroli ekspresji bia³ek nale¿¹cych do rodzin GGDEF i EAL [19]. Bia³ko to zosta³o odkryte kilkanacie lat temu u E. coli, jako odpowiedzialne za regulacjê ekspresji genów zaanga¿owanych w metabolizm wêglowodanów [52]. Obecnie znane s¹ jego homologi u licznych gatunków bakterii i uwa¿any jest za stra¿nika przejcia w fazê stacjonarn¹ wzrostu. Iloæ bia³ka CsrA, pe³ni¹cego funkcjê represora, jest kontrolowana przez regulatorowe RNA (CsrB i CsrC), zdolne do wi¹zania po kilkanacie jego cz¹steczek. Powi¹zanie dwóch wa¿nych globalnych mechanizmów regulacyjnych, jakimi s¹ system Csr i sygnalizacja c-di-GMP, jest bardzo wa¿nym odkryciem. Udowodniono, ¿e CsrA kontroluje poziom ekspresji bia³ek ycdT i ydeH, zawieraj¹cych domenê GGDEF, odpowiedzialnych za regulacjê stê¿enia c-di-GMP w komórkach E. coli [19]. W ten sposób, porednio decyduje ono o zmanie planktonicznego trybu ¿ycia na osiad³y. Ponadto CsrA bezporednio wp³ywa na ruchliwoæ bakterii i tworzenie przez nie biofilmu poprzez regulacjê ekspresji odpowiednio: flhDC (koduje bia³ko uczestnicz¹ce w tworzeniu wici) i pgaA (koduje bia³ko odpowiedzialne za syntezê zewn¹trzkomórkowych polisacharydów) [19]. W literaturze nie ma ¿adnych informacji na temat szlaków regulacji ekspresji genów koduj¹cych bia³ka GGDEF/EAL czy enzymy zaanga¿owane bezporednio w biosyntezê celulozy u Ga. xylinus. Bez opisu takich procesów trudno myleæ o kontroli wydzielania 92 K. KUBIAK, H. KALINOWSKA, M. PEPLIÑSKA, S. BIELECKI polimeru na poziomie molekularnym. Dotychczasowe próby modyfikacji genetycznej Ga. xylinus nie przynios³y spektakularnych sukcesów. Opisane w literaturze manipulacje dotyczy³y ingerencji w szlaki metaboliczne wêglowodanów. Pierwszym przyk³adem takich badañ by³o wprowadzenie do Ga. xylinus BPR2001 zmienionego genu syntazy sacharozy z fasoli Mung. Enzym ten bardzo wydajnie katalizuje konwersjê sacharozy do UDP-glukozy, jednoczenie zapewniaj¹c niskie stê¿enie wolnego UDP w komórce. Wprowadzenie go do Ga. xylinus wywo³a³o dwu- a nawet trzykrotny wzrost wydajnoci syntezy celulozy [31]. Inn¹ interesuj¹c¹ modyfikacj¹ szczepu Ga. xylinus BPR2001 by³a atenuacja genu aceA koduj¹cego b-glukozylotransferazê o postulowanej przez autorów roli w szlaku syntezy acetanu (polisacharydu rozpuszczalnego). Otrzymane mutanty nie by³y zdolne do produkcji acetanu, ale wytwarza³y tak¿e mniej celulozy ni¿ szczep rodzicielski. Produkcja celulozy na wyjciowym poziomie by³a indukowana przez dodatek acetanu do pod³o¿a. Wyniki te doprowadzi³y autorów do wniosku, ¿e w badanym szczepie szlaki metaboliczne prowadz¹ce do wytwarzania celulozy i rozpuszczalnego acetanu s¹ od siebie niezale¿ne genetycznie [17]. Najnowszym i ostatnim przyk³adem udanego zwiêkszenia produktywnoci szczepu Ga. xylinus BPR2001 s¹ badania nad mutantem pozbawionym genu koduj¹cego dehydrogenazê glukozow¹, katalizuj¹c¹ utlenienie glukozy do kwasów glukonowego i ketoglukonowego. Reakcja ta mo¿e byæ traktowana jako konkurencyjna do polimeryzacji UDP-glukozy do b-1,4-glukanu. W efekcie tej zmiany poprawa produktywnoci szczepu nie by³a ewidentna dotyczy³a tylko hodowli prowadzonej w po¿ywce zawieraj¹cej glukozê jako ród³o wêgla (nie by³o zmian w przypadku stosowania fruktozy), a iloæ powstaj¹cej celulozy zwiêkszy³a siê jedynie 1,7 raza [41]. Istotnym zagadnieniem w obszarze badañ nad wydajnoci¹ produkcji celulozy przez Ga. xylinus jest wp³yw dodatku etanolu na jego metabolizm. W literaturze s¹ dyskutowane czêsto sprzeczne doniesienia na temat efektu wywo³ywanego przez ten alkohol u ró¿nych szczepów. Istniej¹ dwie hipotezy na temat mechanizmu, za którego porednictwem jest wywierany ten wp³yw. Niektórzy badacze przychylaj¹ siê do hipotezy, ¿e etanol wp³ywa na szlaki przemian cukrów u Ga. xylinus blokuj¹c szlak fosfotransacetylazy [25]. Inni uwa¿aj¹, ¿e etanol stymuluje wytwarzanie ATP, a tym samym prowadzi do aktywacji glukoheksokinazy i zintensyfikowania szlaku prowadz¹cego do produkcji celulozy [41]. Niedyskutowanym dot¹d w literaturze, a bardzo interesuj¹cym aspektem oddzia³ywania etanolu na komórki Ga. xylinus jest wywo³ywanie stresu komórkowego, jak to jest sugerowane np. u bakterii kwasu mlekowego [42] czy Bacillus subtilis [16]. Jak wspomniano wy¿ej, mo¿liwe, ¿e b³ona celulozowa jest form¹ biofilmu, zatem stymulacja jej wytwarzania przez czynniki wywo³uj¹ce stres komórkowy wydaje siê prawdopodobna. Za regulacjê ekspresji genów w warunkach stresu wywo³anego ró¿nymi czynnikami (m.in. podwy¿szon¹ lub obni¿on¹ temperatur¹, zmianami cinienia osmotycznego, obecnoci¹ etanolu) odpowiadaj¹ regulatorowe podjednostki polimerazy RNA, tzw. alternatywne czynniki sigma, np.: sS, sE, sB. Ich aktywnoæ bywa te¿ uzale¿niona od mechanizmów uruchamianych przez sygna³y ze rodowiska tzw. systemów dwusk³adnikowych TCS (ang. Two Component Systems). Specyficzna informacja jest odbierana przez wyspecjalizowane bia³ko sensorowe i przenoszona do wnêtrza komórki, a nastêpnie przekszta³cana na odpowied komórki poprzez aktywacjê (np. CELULOZA BAKTERYJNA JAKO NANOBIOMATERIA£ 93 w drodze fosforylacji) regulatorów ekspresji genów. Regulatory te mog¹ byæ zarówno aktywatorami, jak i represorami, wi¹¿¹cymi siê ze specyficznymi sekwencjami znajduj¹cymi siê w obszarze poprzedzaj¹cym promotor regulowanego genu. Mechanizmy molekularne, odpowiedzialne za kontrolê takich z³o¿onych procesów, jak reakcja na stres czy tworzenie biofilmów, czêsto anga¿uj¹ ponadto regulatorowe cz¹steczki RNA, nazywane ma³ymi RNA sRNA (ang. small RNA). Zastosowanie takich regulatorów jest bardzo korzystne dla komórek bakteryjnych m.in. ze wzglêdu na krótki czas potrzebny do zsyntetyzowania cz¹steczki kwasu rybonukleinowego w porównaniu z czasem niezbêdnym do utworzenia funkcjonalnej proteiny. Mechanizmy dzia³ania sRNA s¹ bardzo ró¿norodne i mog¹ polegaæ zarówno na oddzia³ywaniu z komplementarnym (przynajmniej czêciowo) odcinkiem mRNA (np. DsrA, reguluj¹ce ekspresjê rpoS, koduj¹cego s S [6]) lub na modulowaniu aktywnoci bia³kowych regulatorów translacji (np. wspomniany wczeniej system CsrA/BC [19]). W naszym zespole rozpoczêto badania maj¹ce na celu identyfikacjê globalnych systemów regulacji ekspresji genów odpowiedzialnych za kontrolê procesu biosyntezy celulozy u Ga. xylinus. ZASTOSOWANIA CELULOZY BAKTERYJNEJ Przyk³ady zastosowañ celulozy bakteryjnej w ró¿nych dziedzinach przedstawiono w tabeli 1. Polimer ten jest wykorzystywany w medycynie i kosmetyce, gdy¿ po dok³adnym usuniêciu resztek komórek bakterii i sk³adników pod³o¿a spe³nia wszystkie warunki stawiane biomateria³om. W Instytucie Biochemii Technicznej rozwijanych jest kilka kierunków badañ nad praktycznymi zastosowaniami BC. Przede wszystkim b³ony natywne i produkty otrzymane po ich chemicznej modyfikacji s¹ badane w zastosowaniach medycznych (zarówno zewnêtrznych, jak i wewnêtrznych). Ponadto BC jest testowana jako matryca do immobilizacji naturalnych enzymów oraz do produkcji tzw. synzymów (krótkich, kilkuamino-kwasowych peptydów, katalizuj¹cych reakcje chemiczne). Najnowsze wyniki naszego zespo³u sugeruj¹ ponadto interesuj¹ce zastosowanie hydrolizatów celulozy w regeneracji starodruków. Szczególna, nanofibrylarna struktura BC powoduje, ¿e charakteryzuje siê ona licznymi cechami czyni¹cymi z niej doskona³y nanobiomateria³, tzn. jest biokompatybilna, biofunkcjonalna, hipoalergiczna oraz nie jest mutagenna, czy teratogenna. W tej chwili, w IBT jest wprowadzany do ci¹g³ej produkcji i dystrybucji produkt medyczny o znaku handlowym CelMat®, który uzyska³ certyfikat typu i weryfikacjê partii produkcyjnej, a tym samym znak CE o numerze 1435. Wytwarzany w IBT opatrunek celulozowy nale¿y do grupy produktów prze³omowych w leczeniu ran przewlek³ych. Jego najwa¿niejszymi zaletami jest cis³e dopasowanie do wszelkiego kszta³tu i rozmiaru ran (ryc. 2), silne i trwa³e uwodnienie, zdolnoæ wi¹zania wydzielin z rany oraz zapewnienie niezbêdnej wymiany gazowej z otoczeniem [12]. Dodatkowo wilgotny opatrunek z BC dobrze chroni ranê przed wtórnymi zaka¿eniami. Istotne jest tak¿e, ¿e przy jego stosowaniu obni¿one jest odczucie bólu podczas gojenia, a tak¿e w trakcie zmiany opatrunku, poniewa¿ celuloza nie przywiera do skóry i dziêki temu nie 94 K. KUBIAK, H. KALINOWSKA, M. PEPLIÑSKA, S. BIELECKI TABELA 1 . Za sto so wa nia c e lulo zy b a k te ryjne j [4 ] TABLE 1 . Ap p lic a tio ns o f b a c te ria l c e llulo se [4 ] Dzie d zina Me d yc yna K o sme tyk a P rze mys³ te k stylny P a p ie rnic two O c hro na ro d o wisk a Za sto so wa nie Ma te ria ³ o p a trunk o wy (sztuc zna sk ó ra ) p rzysp ie sza j¹ c y go je nie wsze lk ie go typ u ra n, imp la nty na c zyñ, tc ha wic y itp . , imp la nty d e ntystyc zne S ta b iliza to r e mulsji (k re my, to nik i itp . ), sk ³a d nik sztuc znyc h p a zno k c i itp . Tk a niny, sztuc zna sk ó ra , ma te ria ³y o wyso k ic h zd o lno - c ia c h a b so rp c yjnyc h, ma te ria ³y d o p ro d uk c ji na mio tó w i sp rzê tu turystyc zne go P a p ie r o sp e c ja lnyc h w³a c iwo c ia c h, na p ra wa sta ro d ruk ó w, trwa lsze b a nk no ty i inne wyro b y p a p ie rnic ze Ultra filtra c ja wo d y, o c zyszc za nie c ie k ó w, a b so rp c ja za nie c zyszc ze ñ ro p o p o c ho d nyc h, to k syn itp . Ja d a lna c e lulo za typ u "n a t a d e c o c o " P ro d uk c ja ¿ywno c i d ie te tyc zne j Ak ustyk a Me mb ra ny g³o nik o we Ba d a nia na uk o we Unie ruc ha mia nie b ia ³e k , c hro ma to gra fia , sk ³a d nik p o d ³ó ¿ d o ho d o wli jest uszkadzana regeneruj¹ca siê tkanka. Dziêki tym wszystkim cechom, gojenie ran chronionych opatrunkami z BC jest szybsze od prowadzonych tradycyjnymi metodami i nie pozostawia blizn [26]. Testowana jest tak¿e mo¿liwoæ wzmocnienia leczniczego dzia³ania produkowanych w IBT opatrunków przez nasycanie BC znanymi lekami, czy rodkami przeciwbakteryjnymi (np. nanosrebro, lizozym, antybiotyki) b¹d, bêd¹cymi w fazie badañ, substancjami stymuluj¹cymi angiogenezê. Ze wzglêdu na biozgodnoæ i brak stymulacji uk³adu odpornociowego organizmu obecnie intensywnie badane s¹ zastosowania celulozy bakteryjnej w medycynie implantacyjnej. Odpowiednio formuj¹c powierzchniê, na której tworzona jest membrana, mo¿na np. uzyskaæ rurki o dowolnej rednicy i d³ugoci, które s¹ doskona³ymi implantami naczyñ krwiononych. Po odpowiedniej modyfikacji chemicznej uzyskuj¹ wiêksz¹ sztywnoæ i mog¹ byæ stosowane jako os³onki zerwanych w³ókien nerwowych. Wstêpne badania in vivo, prowadzone przez zespó³ Profesora Z. Pasieki w Zak³adzie Chirurgii Dowiadczalnej Uniwersytetu Medycznego w £odzi na szczurach rasy Wistar, wskazuj¹ na dobr¹ tolerancjê organizmu dla wszczepów RYCINA 2. Opatrunek z celulozy bakteryjnej celulozowych oraz przyspieszenie regeneracji FIGURE 2. Burn wound dressing made of bacterial nerwu obwodowego (dane niepubl.). cellulose Odpowiednia obróbka po zakoñczeniu CELULOZA BAKTERYJNA JAKO NANOBIOMATERIA£ 95 hodowli pozwala tak¿e uzyskaæ z BC materia³ o charakterze chrz¹stki, który mo¿na zastosowaæ do sporz¹dzania protez. W ramach tej samej wspó³pracy otrzymalimy pozytywne wyniki po wszczepieniu protezy tchawicy szczura, otrzymanej z modyfikowanej celulozy. przysz³oci materia³ chrz¹stko-podobny mo¿e znaleæ liczne inne zastosowania, gdy¿ mo¿liwe jest uzyskanie dowolnego kszta³tu implantu. Bakteryjna celuloza s³u¿y te¿ do produkcji materia³ów kompozytowych, stosowanych do celów medycznych. Przyk³adowo, kompozyty z polifosforanem sodu i hydroksyapatytem, o wysokiej odpornoci mechanicznej zastosowano do regeneracji ubytków koci i leczenia zmian wywo³anych osteoporoz¹ [3]. Oprócz tych sk³adników opisane w literaturze materia³y kompozytowe, wyprodukowane przy u¿yciu BC zawieraj¹ m.in.: kolagen [48], chitozan [9], modyfikowan¹ skrobiê [32], ¿ywice fenolowe [30], alginian i poliwinylopirolidon [34], polifosforany [3], krzemionkê [27], celulozê rolinn¹ [29] itp. Celulozê bakteryjn¹ ³¹czy siê tak¿e z siateczkami z w³ókien syntetycznych, uzyskuj¹c materia³y o bardziej hydrofilowej powierzchni [36]. Ponadto, w efekcie oplecenia siatki polipropylenowej przez w³ókna celulozy bakteryjnej uzyskuje siê kompozyt o zwiêkszonej wytrzyma³oci. Przeprowadzone w naszym zespole wstêpne badania in vivo na analogicznych materia³ach wskazuj¹ na zmniejszon¹ czêstoæ powstawania zrostów (dane npbl). Optymalizacja warunków hodowli Ga. xylinus i odpowiednie modyfikacje pohodowlane doprowadzi³y do otrzymania siatki dwustronnie g³adkiej, której elastycznoæ jest odpowiednia do zastosowania jej w technice laparoskopowej (ryc. 3). Wytwarzanie materia³ów kompozytowych zarówno z celulozy bakteryjnej, jak i rolinnej jest ograniczone ich s³ab¹ rozpuszczalnoci¹, wysok¹ hydrofilowoci¹ i brakiem grup funkcyjnych wi¹¿¹cych np. grupy aminowe bia³ek. Z tego ostatniego powodu, celulozê bakteryjn¹ poddaje siê np. wstêpnemu utlenianiu nadjodanem sodu (NaJO4), powoduj¹cemu rozerwanie wi¹zania C2-C3 w piercieniu glukopiranozy, prowadz¹cemu do powstania grup aldehydowych, reaguj¹cych z grupami aminowymi. Z kolei dzia³anie chlorkiem tozylu, daje pochodn¹ tozylow¹ celulozy, podstawion¹ przy C6, co umo¿liwia wprowadzenie szeregu innych grup funkcyjnych do piercieni glukozy [15]. Rozpoczêto te¿ prace nad kompozytami zawieraj¹cymi wyizolowane z cz¹steczek celulaz modu³y wi¹¿¹ce celulozê CBM (ang. cellulose binding module), które mog¹ pe³niæ rolê linkerów, wi¹¿¹cych z BC peptydy o dzia³aniu biologicznym oraz bia³ka [33]. Struktura CBM jest dobrze znana (pod tym wzglêdem podzielono je na 43 rodziny) i dziêki temu s¹ one produkowane w skali laboratoryjnej. Opatrunki, w których celuloza bakteryjna stanowi³aby nonik kowalencyjnie zwi¹zanych enzymów proteolitycznych, mog³yby jeszcze bardziej u³atwiæ gojenie ran. Wskazuj¹ na to wyniki prac odnosz¹cych siê do analogicznych opatrunków opartych na matrycach otrzymanych z pochodnych celulozy rolinnej i alkoholu poliwinylowego [54]. PERSPEKTYWY Unikalne w³aciwoci celulozy bakteryjnej czyni¹ z niej bardzo interesuj¹cy nanobiomateria³ i sprzyjaj¹ poszukiwaniu jej nowych zastosowañ. Oczekiwane 96 K. KUBIAK, H. KALINOWSKA, M. PEPLIÑSKA, S. BIELECKI w najbli¿szych latach odkrycia w zakresie molekularnych podstaw biosyntezy tego polimeru zostan¹ prawdopodobnie znakomicie przyspieszone dziêki realizacji projektu sekwencjonowania genomu Ga. xylinus. Opis systemów regulacyjnych, odpowiedzialnych za wydzielanie celulozy przez te bakterie mo¿e doprowadziæ do konstrukcji nowych, interesuj¹cych mutantów, umo¿liwiaj¹cych RYCINA 3. Siatka przepuklinowa z materia³u dalsz¹ optymalizacjê procesów produkcyjnych. kompozytowego zawieraj¹cego celulozê do wszczepieñ laparoskopowych. Podobnie jak odkrycie w Ga. xylinus c-di- FIGURE 3. A mesh made up from composite mateGMP otworzy³o zupe³nie nowy, bardzo rial containing cellulose, to be used in laparoscopic istotny rozdzia³ w biologii molekularnej hernia treatment bakterii, poznanie zasad regulacji biosyntezy celulozy mo¿e rzuciæ nowe wiat³o na procesy wytwarzania biofilmów przez inne bakterie. Zapobieganie tworzeniu biofilmów jest istotnym problemem w wielu dziedzinach od medycyny po ochronê rodowiska. Przewidywane przysz³e zastosowania celulozy bakteryjnej wykraczaj¹ poza opisane wy¿ej doskona³e materia³y opatrunkowe do u¿ytku zewnêtrznego i wewnêtrznego, oraz ró¿nego rodzaju implanty. Celuloza bakteryjna jest traktowana jako np. potencjalny materia³ do produkcji tzw. papieru elektronicznego, czyli lekkich, elastycznych i jednoczenie trwa³ych, przenonych wywietlaczy [40]. Nanofibryle celulozy stanowi³yby w tym przypadku matrycê wi¹¿¹c¹ jony metali i barwniki, odwracalnie zmieniaj¹ce kolor pod wp³ywem zmian napiêcia pola elektrycznego pomiêdzy przezroczystymi elektrodami. Ze wzglêdu na du¿¹ iloæ wi¹zañ wodorowych, stabilizuj¹cych strukturê celulozy, jest ona te¿ potencjalnym materia³em do produkcji tzw. elektroaktywnych polimerów [14]. Z kolei, kontrolowana hydroliza BC daje mieszaniny celo-oligosacharydów o okrelonym stopniu polimeryzacji i krystalicznoci, które mog¹ stanowiæ dodatek do produkcji papieru lub materia³ do produkcji klejów, membran, kompozytów itp. [51]. LITERATURA [1] BAE SO, SHODA M. Production of bacterial cellulose by Acetobacter xylinum BPR2001 using molasses medium in a jar fermentor. Appl Microbiol Biotechnol 2005; 67: 4551. [2] BAIER RE. Surface behaviour of biomaterials: the teta surface for biocompatibility. J Mater Sci: Mater Med 2006; 17: 10571062. [3] BARUD HS, RIBEIRO CA, CRESPI MS, MARTINES MAU, DEXPERT-GHYS J, MARQUES RFC, MESSADDEQ Y, RIBEIRO SJL. Thermal characterization of bacterial cellulose-phosphate composite materials. J Therm Anal Calorim 2007; 87: 815818. [4] BIELECKI S, KRYSTYNOWICZ A, TURKIEWICZ M, KALINOWSKA H. Bacterial Cellulose. W: Biopolymers, vol. 5, Chapter 3, (red.) A Steinbuchel, RH Marchessault, Wiley-VCh Verlag Gmbh & Co. KgaA, Weinheim, 2002: 3790. [5] BIN HMZ, YAHAYA AHJ, LING PLC. Acetobacter xylenium as a shape-directing agent for the formation of nano-, micro-sized zinc oxide. J Mater Sci 2005; 40: 63256328. [6] BROWN L, ELLIOTT T. Efficient translation of the RpoS sigma factor in Salmonella typhimurium require host factor I, an RNA-binding protein encoded by the hfq gene. J Bacteriol 1996; 178: 37633770. CELULOZA BAKTERYJNA JAKO NANOBIOMATERIA£ 97 [7] CHANG AL, TUCKERMAN JR, GONZALEZ G, MAYER R, WEINHOUSE H, VOLMAN G, AMIKAM D, BENZIMAN M, GILLES-GONZALEZ MA. Phosphodiesterase A1, a regulator of cellulose synthesis in Acetobacter xylinum, is a heme-based sensor. Biochemistry 2001; 40: 34203426. [8] CHEN T-HH, BAE Y, FURGESON DY. Intelligent biosynthetic nanobio-materials (IBNs) for hyperthermic gene delivery. Pharm Res 2007; 25: 683688. [9] CIECHAÑSKA D. Multifunctional bacterial cellulose/chitosan composite materials for medical applications. Fibres Textiles Eastern Eur 2004; 12: 6972. [10] COUCHERON DH. An Acetobacter xylinum insertion sequence element associated with inactivation of cellulose production. J Bacteriol 1991; 173: 5723-5731. [11] CRESCENZI V. Microbial polysaccharides of applied interest: ongoing research activities in Europe. Biotechnol Prog 1995; 11: 251259. [12] CZAJA W, KRYSTYNOWICZ A, BIELECKI S, BROWN MR. Microbial cellulose the natural power to heal wounds. Biomaterials 2006; 27: 145151. [13] EVANS BR, O'NEILL HM. Effect of surface attachment on synthesis of bacterial cellulose. Appl Biochem Biotechnol 2005; 121124: 439450. [14] FINKENSTADT VL. Natural polysaccharides as electroactive polymers. Appl Microbiol Biotechnol 2005; 67: 735745. [15] HEINZE T, KOSCHELLA A, MAGDALENO-MAIZA L, ULRICH AS. Nucleophilic displacement reactions on tosyl cellulose by chiral amines. Polymer Bull 2001; 46: 713. [16] ECKER M, VÖLKER U. General stress response of Bacillus subtilis and other bacteria. Adv Microb Physiol 2001; 44: 3591. [17] ISHIDA T, SUGANO Y, NAKAI T, SHODA M. Effects of acetan on production of bacterial cellulose by Acetobacter xylinus. Biosci Biotechnol Biochem 2002; 66: 16771681. [18] JENAL U, MALONE J. Mechanisms of cyclic-di-GMP signaling in bacteria. Annu Rev Genet 2006; 40; 385407. [19] JONAS K, EDWARDS AN, SIMM R, ROMEO T, RÖMLING U, MELEFORS Ö. The RNA binding protein CsrA controls cyclic di-GMP metabolism by directly regulating the expression of GGDEF proteins. Mol Microbiol 2008; 70: 236257. [20] KATO N, SATO T, KATO C, YAJIMA M, SUGIYAMA J, KANDA T, MIZUNO M, NOZAKI K, YAMANAKA S, AMANO Y. Viability and cellulose synthesizing ability of Gluconacetobacter xylinus cells under high-hydrostatic pressure. Extremophiles 2007; 11: 693698. [21] KARAKOTI AS, MONTEIRO-RIVIERE NA, AGGRAWAL R, DAVIS JP, NARAYAN RJ, SELF WT, MCGINNIS J, SEAL S. Nanoceria as antioxidant: synthesis and biomedical applications. JOM 2008; 60: 3336. [22] KAWANO S, TAJIMA K, UEMORI Y, YAMASHITA H, ERATA T, MUNEKATA M, TAKAI M. Cloning of cellulose synthesis related genes from Acetobacter xylinum ATCC23769 and ATCC53582: comparison of cellulose synthetic ability between ATCC23769 and ATCC53582. DNA Res 2002; 9: 149156. [23] KELLY Y, KIM MA. Nanotechnology platforms and physiological challenges for cancer therapeutics. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2007; 3: 103110. [24] KIMURA S, CHEN HP, SAXENA IM, BROWN RM JR, ITOH T. Localization of c-di-GMP-binding protein with the linear terminal complexes of Acetobacter xylinum. J Bacteriol 2001; 183: 56685674. [25] KORNMANN H, DUBOC P, MARISON I, von STOCKAR U. Influence of nutritional factors on the nature, yield, and composition of exopolysaccharides produced by Gluconacetobacter xylinus I-2281. Appl Environ Microbiol 2003; 69: 60916098. [26] KRYSTYNOWICZ A, CZAJA W, POMORSKI L, KO£ODZIEJCZYK M. The evaluation of usefulness of microbial cellulose as a wound dressing material. Mededelingen van de Faculteit Landbouwwetenschappen Universiteit Gent, Gent: 2000; 65: 213220. [27] MAEDA H, NAKAJIMA M, HAGAIWARA T, SAWAGUCHI T, YANO S. Bacterial cellulose/silica hybrid fabricated by mimicking biocomposites. J Mater Sci 2006; 41: 56465656. [28] MEYERS MA, LIN AYM, LIN YS, OLEVSKY EA, GEORGALIS S. The cutting edge: sharp biological materials. JOM 2008; 60: 1924. [29] MORMINO R, BUNGAY H. Composites of bacterial cellulose and paper made with a rotating disk bioreactor. Appl Microbiol Biotechnol 2003; 62: 503506. [30] NAKAGAITO AN, IWAMOTO S, YANO H. Bacterial cellulose: the ultimate nano-scalar cellulose morphology for the production of high-strength composites. Appl Phys 2005; A80: 9397. [31] NAKAI T, TONOUCHI N, KONISHI T, KOJIMA Y, TSUCHIDA T, YOSHINAGA F, SAKAI F, HAYASHI T. Enhancement of cellulose production by expression of sucrose synthase in Acetobacter xylinum. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 1418. 98 K. KUBIAK, H. KALINOWSKA, M. PEPLIÑSKA, S. BIELECKI [32] ORTS WJ, SHEY J, IMAM SH, GLENN GM, GUTTMAN ME, REVOL J-F. Application of cellulose microfibrils in polymer nanocomposites. J Polymers Environment 2005; 13: 301306. [33] PINTO R, CARVALHO J, MOTA M, GAMA M. Large-scale production of cellulose-binding domains. Adsorption studies using CBD-FITC conjugates. Cellulose 2006; 13: 557569. [34] RAMANA KV, GANESAN K, SINGH L. Pervaporation performance of a composite bacterial cellulose membrane: dehydration of binary aqueous-organic mixtures. World J Microbiol Biotechnol 2006; 22: 547552. [35] RICKERT D, LENDLEIN A, PETERS I, MOSES MA, FRANKE R-P. Biocompatibility testing of novel multifunctional polymeric biomaterials for tissue engineering applications in head and neck surgery: an overview. Eur Arch Otorhinolarygol 2006; 263: 215222. [36] RING DF, NASHED W, DOW T. Liquid loaded pad for medical applications. US Patent 4,788,146; 1988. [37] RÖMLING U. Molecular biology of cellulose producion in bacteria. Res Microbiol 2002; 153: 205212. [38] RÖMLING U, AMIKAM D. Cyclic di-GMP as a second messenger. Curr Opin Microbiol 2006; 9: 218228. [39] SETO A, SAITO Y, MATSUSHIGE M, KOBAYASHI H, SASAKI Y, TONOUCHI N, TSUCHIDA T, YOSHINAGA F, UEDA K, BEPPU T. Effective cellulose production by a coculture of Gluconacetobacter xylinus and Lactobacillus mali. Appl Microbiol Biotechnol 2006; 73: 915992. [40] SHAH J, BROWN MR JR. Towards electronic paper. Appl Microbiol Biotechnol 2005; 66: 352355. [41] SHIGEMATSU T, TAKAMINE K, KITAZATO M, MORITA T, NARITOMI T, MORIMURA S, KIDA K. Cellulose production from glucose using a glucose dehydrogenase gene (gdh)-deficient mutant of Gluconacetobacter xylinus and its use for bioconversion of sweet potato pulp. J Biosci Bioeng 2005; 99: 415422. [42] SPANO G, MASSA S. Environmental stress response in wine lactic acid bacteria: beyond Bacillus subtilis. Crit Rev Microbiol 2006; 32: 7786. [43] STANDAL R, IVERSEN TG, COUCHERON DH, FJAERVIK E, BLATNY JM, VALLA S. A new gene required for cellulose production and a gene encoding cellulolytic activity in Acetobacter xylinum are colocalized with the bcs operon. J Bacteriol 1994; 176: 665672. [44] TAL R, WONG HC, CALHOON R, GELFAND D, FEAR AL, VOLMAN G, MAYER R, ROSS P, AMIKAM D, WEINHOUSE H, COHEN A, SAPIR S, OHANA P, BENZIMAN M. Three cdg operons control cellular turnover of cyclic di-GMP in Acetobacter xylinum: genetic organization and occurrence of conserved domains in isoenzymes. J Bacteriol 1998; 180: 44164425. [45] THOMPSON DN, HAMILTON MA. Production of bacterial cellulose from alternate feedstocks. Appl Biochem Biotechnol 2001; 9193: 503507. [46] VALLA S, COUCHERON DH, KJOSBAKKEN J. Acetobacter xylinum contains several plasmids: evidence for their involvement in cellulose formation. Arch Microbiol 1983; 134: 911. [47] WARREN HH. Nanomaterials: nomenclature, novelty, and necessity. JOM 2004; 56: 1318. [48] WIEGAND C, ELSNER P, HIPLER U-C, KLEMM D. Protease and ROS activities influenced by a composite of bacterial cellulose and collagen type I in vitro. Cellulose 2006; 13: 689696. [49] WILLIAMS WS, CANNON RE. Alternative environmental roles for cellulose produced by Acetobacter xylinum. Appl Environ Microbiol 1989; 55: 24482452. [50] WONG HC, FEAR AL, CALHOON RD, EICHINGER GH, MAYER R, AMIKAM D, BENZIMAN M, GELFAND DH, MEADE JH, EMERICK AW, et al. Genetic organization of the cellulose synthase operon in Acetobacter xylinum. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 81308134. [51] XIANG Q, KIM JS, LEE YY. A comprehensive kinetic model for dilute-acid hydrolysis of cellulose. Appl Biochem Biotechnol 2003; 105108: 337357. [52] YAMANAKAS, ISHIHARAM, SUGIYAMAJ. Structural modification of bacterial cellulose. Cellulose 2000; 7: 213225. [53] YANG H, LIU MY, ROMEO T. Coordinate genetic regulation of glycogen catabolism and biosynthesis in Escherichia coli via the CsrA gene product. J Bacteriol 1996; 178: 10121017. [54] YOUDANOVA TN, RESHETOV IV. Modern wound dressings: making and properties. II. Wound dressings containing immobilized proteolytic enzymes (a review). Pharmaceut Chem J 2006; 40: 430434. [55] ZHANG D, QI L. Synthesis of mesoporous titania networks consisting of anatase nanowires by templating of bacterial cellulose membranes. Chem Commun 2005: 27352737. Stanis³aw BIELECKI Instytut Biochemii Technicznej, Wydzia³ Biotechnologii i Nauk o ¯ywnoci Politechnika £ódzka ul. Stefanowskiego 4/10 , 90-924 £ód e-mail: [email protected]
