recenzja1

Wydział Biologii
Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii
Poznań, 24.08.2014
dr hab. Mikołaj Olejniczak, prof. UAM
Zakład Biochemii, Wydział Biologii
Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu
ul. Umultowska 89
61-614 Poznań
RECENZJA
pracy doktorskiej Pani mgr Elżbiety Lenartowicz, pt.
„Badania struktury segmentu 8 RNA wirusa grypy nakierowane na inhibicję jego
namnażania”
Praca doktorska Pani mgr Elżbiety Lenartowicz została wykonana w pracowni prof.
IChB dr hab. Elżbiety Kierzek. Celem badań Doktorantki było określenie struktury
drugorzędowej jednego z ośmiu segmentów genomowego RNA wirusa grypy typu A. 875nukleotydowy segment 8, który był obiektem badań, koduje białko niestrukturalne NS1 oraz
białko eksportu jądrowego NEP, które jest produktem alternatywnego splicingu pre-mRNA
genu białka NS1. Ponieważ białka NS1 oraz NEP odgrywają ważne role w cyklu życiowym
wirusa grypy Doktorantka postanowiła wykorzystać uzyskaną przez siebie wiedzę na temat
struktury drugorzędowej tego RNA do zaprojektowania antysensowych nukleotydów, których
wiązanie do RNA segmentu 8 mogłoby prowadzić do zahamowania namnażania wirusa.
Efektywność oligonukleotydów w inhibicji cyklu replikacyjnego tego wirusa została
potwierdzona na liniach komórkowych zainfekowanych wirusem grypy.
Genomowe RNA, którego strukturę badała Doktorantka pochodzi z wirusa grypy typu
A (podtyp H5N1). Wirusy grypy typu A są najbardziej patogenne spośród wirusów grypy
infekujących człowieka i powodują zarówno epidemie jak i pandemie grypy. Genomowe
RNA tego wirusa jest podzielone na osiem segmentów o długości od prawie 900 do ponad
2200 reszt nukleotydowych, które funkcjonują jako odrębne jednostki w replikacji
genomowego RNA oraz w syntezie mRNA. Wszystkie te segmenty są niezbędne dla
infekcyjności wirusa. Badana przez Doktorantkę cząsteczka RNA segmentu 8 jest najkrótszą
z tych cząsteczek i zawiera jeden region kodujący, który w drodze alternatywnego splicingu
odpowiada za powstawanie dwóch cząsteczek mRNA kodujących białka NS1 i NEP.
1
Poznanie struktury segmentu 8 RNA wirusa grypy jest bardzo ważne ze względu na
potencjalne znaczenie medyczne w związku z projektowaniem nowych inhibitorów cyklu
życiowego tego wirusa, czyli potencjalnych terapeutyków. Ponadto, badania te mają istotne
znaczenie poznawcze ponieważ mogą posłużyć wyjaśnieniu roli elementów struktury tego
RNA dla jego funkcji biologicznej, m.in. w transkrypcji oraz alternatywnym składaniu
cząsteczek pre-mRNA, a także w replikacji genomowego RNA, jego transporcie do
cytoplazmy i pakowaniu do wirionów.
W badaniach struktury drugorzędowej RNA segmentu 8 Doktorantka
wykorzystała zarówno metody eksperymentalne (SHAPE, modyfikacja DMS, mikromacierze
izoenergetyczne) jak i analizę bioinformatyczną. Analiza metodą SHAPE oraz modyfikacji
DMS pozwoliła Doktorantce na zaproponowanie, że RNA segmentu 8 zorganizowane jest w
postaci 4 modułów strukturalnych. Analiza prawdopodobieństwa występowania par zasad
oraz regionów jednoniciowych w programie RNAStructure pozwoliła na wskazanie, że
zaproponowana struktura regionu III oraz IV jest bardziej prawdopodobna niż struktura
regionów I i II. Wygenerowany model został następnie potwierdzony i udokładniony za
pomocą analizy bioinformatycznej pozwalającej na identyfikację regionów zachowawczych
w ponad 8.000 sekwencji RNA segmentu 8 wirusa grypy typu A z bazy danych NCBI.
Zaproponowana struktura została także potwierdzona w oparciu o analizę hybrydyzacji RNA
segmentu 8 do sond oligonukleotydowych na macierzach izoenergetycznych. Miejsca
wiązania wybranych sond, świadczące o dostępności tych regionów dla komplementarnych
oligonukleotydów, zostały dodatkowo zweryfikowane za pomocą RNazy H. Tak szczegółowa
analiza pozwoliła Doktorantce na wskazanie z dużym prawdopodobieństwem regionów
jednoniciowych w strukturze segmentu 8. Dane dotyczące struktury zostały też poparte w
badaniach krótszych fragmentów segmentu 8 obejmujących domeny II, III lub IV. Struktura
tych fragmentów była taka sama jak w pełnej długości cząsteczce RNA segmentu 8, co
potwierdza uzyskaną dla niej strukturę drugorzędową. Szerokie spektrum metod
zastosowanych przez Doktorantkę dla zaproponowania możliwej struktury drugorzędowej
RNA segmentu 8 świadczy o jej dużym doświadczeniu badawczym, a duża zgodność
wyników uzyskanych za pomocą różnych metod potwierdza prawidłowość proponowanej
struktury.
Ciekawym wnioskiem była także obserwacja, że jedna ze struktur spinkowych
zaproponowanego modelu może być substratem dla enzymów ADAR. Wniosek ten wynikał z
2
analizy bioinformatycznej wykonanej za pomocą oprogramowania opracowanego w
laboratorium prof. Brendy Bass, nie został jednak poparty wynikami eksperymentalnymi.
Oprócz analizy struktury drugorzędowej Doktorantka podjęła też próbę ustalenia
możliwych kontaktów trzeciorzędowych pomiędzy regionami RNA segmentu 8 za pomocą
metody opartej o degradację RNA indukowaną rodnikami hydroksylowymi. Metoda ta
pozwala na identyfikację regionów zagłębionych w strukturze, potencjalnie zaangażowanych
w oddziaływania trzeciorzędowe. Analiza uzyskanych wyników pozwoliła na wskazanie 6
regionów potencjalnych oddziaływań trzeciorzędowych, w tym m. in. regionu 217-235 w III
module struktury, który był także niedostępny dla wiązania sond oligonukleotydowych oraz
podlegał jedynie słabej modyfikacji chemicznej.
W następnym etapie pracy Doktorantka zaprojektowała oligonukleotydy antysensowe
po to aby sprawdzić ich zdolność do zahamowania cyklu życiowego wirusa grypy. W
projektowaniu Doktorantka w szczególności uwzględniła regiony segmentu 8, które w
zaproponowanym
modelu
strukturalnym
mają
charakter
jednoniciowy
oraz
są
komplementarne do sekwencji innych segmentów genomowego RNA tego wirusa. Wykonane
przez inne osoby badania aktywności tych oligonukleotydów na linii komórkowej
zainfekowanej wirusem grypy pozwoliły na wykazanie, że 9 z 15 badanych oligonukleotydów
hamowało infekcyjność wirusa (nawet do zaledwie 3% w porównaniu do kontroli ujemnej
bez oligonukleotydu), 5 nie miało istotnego wpływu, a jeden z nich stymulował infekcyjność
(prawie 3-krotnie w porównaniu do kontroli z oligonukleotydem o niespecyficznej
sekwencji). Wyniki
te potwierdzają zasadność przyjętej
procedury projektowania
oligonukleotydów antysensowych. Wynik dotyczący stymulacji infekcyjności pod wpływem
oligonukleotydu G528 komplementarnego do pętli w regionie IV segmentu 8 może świadczyć
o ważnej roli tego regionu dla cyklu życiowego wirusa.
Układ pracy doktorskiej jest prawidłowy. We wstępie literaturowym Doktorantka
kompetentnie opisała stan wiedzy dotyczący w szczególności znaczenia struktury RNA dla
prawidłowego przebiegu cyklu życiowego wirusa grypy a także możliwe strategie
terapeutyczne związane z cząsteczkami kwasów rybonukleinowych. W rozdziale Wyniki i
Dyskusja szczegółowo omówiono otrzymane wyniki eksperymentalne, jednakże ich dyskusja
na tle danych literaturowych jest rozproszona w pracy i raczej ściśle odnosi się do
otrzymanych danych eksperymentalnych. W pracy brakuje szerszego omówienia znaczenia
uzyskanych wyników dla stanu wiedzy w tej dziedzinie badań. Zdecydowanie praca
3
zyskałaby na rozdzieleniu Wyników i Dyskusji jako odrębnych rozdziałów. Wyodrębnienie
Dyskusji pozwala na oddzielenie interpretacji wyników od ich bezpośredniego omówienia, co
ułatwia wyjaśnienie Czytelnikowi ich znaczenia, oraz pozwala na pełniejsze ich odniesienie
do wyników uzyskanych przez innych badaczy.
Praca została przygotowana starannie i napisana jasnym, precyzyjnym językiem.
Nieliczne punkty krytyczne dotyczą stosowania takich nazw angielskich jak fork, corkscrew,
czy panhandle zamiast typowej terminologii strukturalnej, a także stosowania terminu
„fałdowanie RNA” zamiast „zwijanie RNA” (ang. folding) (s. 43), jak również w znaczeniu
„denaturacja i renaturacja” (ang. refolding) (s. 163 i inne). Wśród krótkich modelowych
fragmentów badanej cząsteczki Doktorantka wymienia na s. 104 cząsteczkę M4-RNA
jednakże jej dalej nie omawia.
Jednym z wyzwań w pracy z długimi cząsteczkami RNA jest możliwość
przyjmowania przez cząsteczkę więcej niż jednej konformacji. Istnieje także ryzyko, że
denaturacja cząsteczek RNA, stosowana często podczas przygotowywania preparatu do
badań, może doprowadzić do utworzenia innej konformacji RNA niż natywna. W związku z
tym poprosiłbym Doktorantkę o zaproponowanie podczas obrony w jaki sposób można
sprawdzić czy struktura RNA obserwowana in vitro jest strukturą biologicznie aktywną, a
także o krótkie przedstawienie metod, które mogą pozwolić na oczyszczenie RNA w
warunkach natywnych z zachowaniem struktury utworzonej podczas transkrypcji.
Podsumowując, wyniki otrzymane przez Doktorantkę w ramach jej pracy doktorskiej
są oryginalnym i wartościowym wkładem w rozwój badań nad strukturą kwasów
rybonukleinowych. Ponieważ oceniana praca spełnia wszystkie wymogi stawiane rozprawom
doktorskim wnioskuję o dopuszczenie Pani mgr Elżbiety Lenartowicz do dalszych etapów
przewodu doktorskiego. Ponadto ze względu na wysoką wartość naukową osiągniecia
Doktorantki, jakim jest opisanie po raz pierwszy struktury drugorzędowej całego, prawie 900nukleotydowego, segmentu 8 genomowego RNA wirusa grypy, wnioskuję o wyróżnienie
rozprawy.
Mikołaj Olejniczak
4