streszczenie (PL)

STRESZCZENIE
Grypa corocznie wywołuje epidemie i sporadycznie – pandemie. Światowa
Organizacja
Zdrowia
podaje,
że
każdego
roku
na
grypę
choruje
5-15% populacji ludzkiej, w tym u 3-5 milionów ludzi obserwuje się ciężki przebieg
choroby, natomiast 250-500 tysięcy umiera z powodu infekcji lub powikłań
pogrypowych. Czynnikiem etiologicznym wywołującym chorobę jest wirus grypy
należący do rodziny Orthomyxoviridae, rodzaju Influenzavirus. Wyróżnić można trzy
typy wirusa – A, B, C. Dodatkowo, typ A dzieli się na podtypy zgodnie z odmianą
glikoprotein powierzchniowych (hemaglutyniny - H i neuraminidazy – N)
występujących w otoczce wirusa. Opisano 18 wariantów H i 9 wariantów N,
a kombinacja tych dwóch glikoprotein stanowi nazwę podtypu, np. H1N1, H5N1, czy
H7N2.
Genom wirusa stanowi jednoniciowa ujemnie spolaryzowana cząsteczka RNA
(vRNA) podzielona na 8 segmentów, która łącznie koduje 11 białek niezbędnych
w cyklu replikacyjnym wirusa. Genomowe RNA oddziałuje z nukleoproteiną
i trzema podjednostkami polimerazy tworząc kompleks rybonukleoproteinowy (vRNP,
ang. ribonucleoprotein complex). Kompleks vRNP pojedynczego segmentu stanowi
niezależną jednostkę replikacyjną i transkrypcyjną.
Informacje o strukturze drugorzędowej vRNA są ograniczone i dotyczą głównie
końców 5’ i 3’ cząsteczki vRNA. Fragmenty te zbudowane są z odpowiednio 13 i 12
nukleotydów, które charakteryzują się wysoką zachowawczością sekwencyjną, zarówno
wśród szczepów, jak i typów wirusa. Dodatkowo, wykazują one częściową, wzajemną
komplementarność, w wyniku czego możliwe jest powstanie zamkniętej formy vRNA.
Terminalne rejony odgrywają również istotną funkcję podczas cyklu replikacyjnego
wirusa. Są one rozpoznawane przez wirusową polimerazę i stanowią swoisty dla niej
promotor. Ponadto, różne struktury drugorzędowe tego regionu,
powstające
w kolejnych etapach namnażania wirusa, mogą brać udział w regulacji procesów
transkrypcji i replikacji. Pomimo braku informacji o strukturze drugorzędowej
cząsteczek vRNA postuluje się, że zawarte w niej motywy strukturalne są istotne
podczas selektywnego pakowania vRNP do potomnego wirionu.
Obiektem badań przedstawionych w niniejszej pracy było genomowe RNA
segmentu 8 wirusa grypy szczepu A/VietNam/1203/2004 (H5N1), które w dalszej
części określano skrótem vRNA8. Cząsteczka ta, o długości 875 nukleotydów, koduje
dwa białka, białko niestrukturalne (NS1, ang. nonstructural protein) oraz białko
eksportu jądrowego (NEP, ang. nuclear export protein), które powstaje w wyniku
alternatywnego składania mRNA NS1. Z uwagi na to, że vRNP pojedynczego segmentu
tworzy niezależną jednostkę transkrypcyjną i replikacyjną, jak również z tego powodu,
że vRNA odgrywa istotną rolę w procesie tworzenia potomnego wirionu, może ona
stanowić interesujący cel terapeutyczny.
Badania rozpoczęto od mapowań chemicznych vRNA8 metodą SHAPE
oraz
z
zastosowaniem
siarczanu
dimetylu
(DMS,
ang.
dimethyl
sulfate).
Po wprowadzaniu uzyskanych wyników do programu RNAstructure 5.3 wygenerowano
strukturę drugorzędową nazwaną CM-vRNA8. Wirusowe RNA było wysoce
ustrukturalizowane i zbudowane z czterech domen, z których domenę I stanowiły
częściowo sparowane końce 3’ i 5’ tworzące motyw strukturalny panhandle opisany
wcześniej w literaturze.
W drugim etapie badań wykonano porównanie strukturalno–sekwencyjne,
w którym wykorzystano 8146 unikatowych sekwencji vRNA8 wirusa grypy typu A
znajdujących się w bazie danych NCBI. Analizy bioinformatyczne wykazały obecność
konserwatywnych par zasad w sześciu rejonach vRNA8: 261-270/279-288, 312317/322-327, 632-636/645-649, 696-701/775-780, 704-713/767-758 oraz 736-740/744748. Na podstawie uzyskanych wyników bioinformatycznych i eksperymentalnych
został wygenerowany model struktury drugorzędowej CMC-vRNA8. Struktura
drugorzędowa uległa przemodelowaniu w dwóch rejonach, w których wystąpiły
zachowawcze fragmenty dwuniciowe (domena III, rejon 206-374 oraz domena IV,
rejon 718-752).
W badaniach struktury drugorzędowej vRNA8 zastosowano również metodę
hybrydyzacji RNA do sond oligonukleotydowych mikromacierzy izoenergetycznych.
Wykorzystano 444 sondy komplementarne, krok po kroku, do badanego RNA. Sondami
z
biblioteki
izoenergetycznej
są
2’-O-metylowane
pentamery
i
heksamery
z modyfikacjami typu LNA oraz 2,6-diaminopurynorybozydem. Modyfikacje rybozy
oraz reszty adenozyny zaprojektowano tak, aby energia swobodna dupleksów
hybrydyzacyjnych tworzonych z docelowym RNA była bardziej korzystna i wyrównana
(izoenergetyczna). Idea mapowania mikromacierzowego opiera się na obserwacji, że
pofałdowane, badane RNA może związać się z sondą oligonukleotydową tylko
w rejonie, który nie jest uwikłany w strukturę drugorzędową. Za pomocą
modyfikowanych sond można określić dostępne rejony jednoniciowe w RNA, a więc
uzyskać informacje o jego strukturze i jednocześnie miejscach silnie wiążących
oligonukleotydy. Wyniki uzyskane tym sposobem wykazują dużą zgodność z modelem
struktury
drugorzędowej
CMC-vRNA8,
co
potwierdza
prawidłowość
jego
wymodelowania.
W
celu
weryfikacji
modelu
struktury
drugorzędowej
CMC-vRNA8
przeprowadzono także analizy bioinformatyczne. Przy pomocy programu RNAstructure
prawdopodobieństwo
oszacowano
występowania
określonych
par
zasad
oraz
niesparowanych nukleotydów. Największy stopień prawdopodobieństwa obserwowano
w domenie IV. Wprowadzenie ograniczeń w postaci zachowawczych par zasad
z
analizy
sekwencyjno–strukturalnej
spowodowało
także
zwiększenie
prawdopodobieństwa poszczególnych par zasad i niesparowanych nukleotydów
w domenie III. Na podstawie analizy 8146 unikatowych sekwencji vRNA8
pochodzących z bazy danych przeprowadzono kolejną analizę bioinformatyczną
weryfikującą strukturę CMC-vRNA8. Uzyskano wysoki procent występowania par
zasad zaproponowanych w CMC-vRNA8 (średnio 87,4%) wśród wszystkich sekwencji
vRNA segmentu 8 wirusa grypy typu A. Było ono wyższe o 0,4% w porównaniu
z CM-vRNA8.
Cząsteczkę vRNA8 poddano również ograniczonym cięciom w obecności
rodnika hydroksylowego. Metoda ta wnosiła informację o trzeciorzędowym
pofałdowaniu vRNA8. Analiza wykazała, że w vRNA8 dla wolnego rodnika dostępna
była większość nukleotydów w regionach: 254-389, 405-461, 532-539, 630-647 oraz
750-820. Natomiast niedostępna była większość nukleotydów w regionach: 150-200,
217-235, 398-404, 526-531, 547-600 i 699-715.
W modelu struktury vRNA8 w rejonie 661-814 występował motyw strukturalny
typu spinki do włosów. Wykazano, że struktury takie mogą być wydajnym substratem
dla enzymów z rodziny ADAR, które katalizują deaminację hydrolityczną adenozyny,
w wyniku której powstaje inozyna. Analiza bioinformatyczna sekwencji tego rejonu
wykazała, że 31 adenozyn z udziałem ADAR może ulegać deaminacji do inozyny.
W zaproponowanej strukturze CMC-vRNA8 występowały rejony jednoniciowe
nie wykazujące reaktywności podczas mapowania chemicznego. Analiza tych rejonów
wykazała
sześć
regionów
potencjalnie
zaangażowanych
w
oddziaływania
trzeciorzędowe: 227-231/409-405 lub 226-231/533-528, 258-260/341-339, 426430/852-848 lub 400-404/431-428,426 oraz 450-456/859-853.
W
celu
udokładnienia
uzyskanej
struktury
drugorzędowej
vRNA8
zaprojektowano 4 krótsze, modelowe cząsteczki: mini-vRNA8, M1-RNA, M2-RNA
i M3-RNA. Cząsteczka mini-vRNA8 zbudowana z 376 nukleotydów i zawierała 182
nukleotydy z końca 5’ vRNA8 oraz 188 z końca 3’. Postuluje się, że w rejonach do 150200 nukleotydów w obu terminalnych regionach vRNA mogą występować sygnały
pakowania cząsteczki do wirionu potomnego. M1-RNA (fragment domeny III, rejon
204-376) oraz M2-RNA (fragment domeny IV, rejon 694-782) zawierały motywy
helikalne zbudowane z zachowawczych par zasad. Natomiast cząsteczka M3-RNA
stanowiła fragment domeny IV obejmujący rejon 503-561. W modelu CMC-vRNA8
rejon ten tworzył strukturę typu spinki do włosów i zawierał miejsca wiązania sond
mikromacierzowych.
Dodatkowo,
w
regionie
tym
sekwencję
znaleziono
komplementarną do vRNA czterech innych segmentów.
Modelowe cząsteczki RNA poddano mapowaniu chemicznemu, jak również
określono miejsca dostępne dla wiązania oligonukleotydów z użyciem mikromacierzy
izoenergetycznych.
W
wygenerowanej
strukturze
drugorzędowej
mini-vRNA8
zaobserwowano identyczne lub podobne motywy strukturalne do tych występujących
w pełnej długości vRNA8. Zaproponowana struktura drugorzędowa modelowych
cząsteczek (M1-RNA, M2-RNA, M3-RNA) potwierdziła duże prawdopodobieństwo
odpowiednich motywów strukturalnych w vRNA pełnego segmentu 8.
Dzięki obecności tych samych elementów struktury drugorzędowej domen
vRNA8 na 5’ i 3’ końcu, cząsteczka mini-vRNA8 mogłaby stanowić trzon wydajnego,
nowego DI-RNA (ang. Defecting Interfering RNA). Wykazano, że zmutowane
cząsteczki vRNA z delecją lub insercją w środkowej części sekwencji mają zdolność do
replikacji i włączania do potomnych wirionów. DI-RNA stworzone na bazie minivRNA8 mogłoby służyć do wprowadzania genów reporterowych do komórki podczas
badań związanych z wirusem grypy. Jednakże jej funkcjonalność należałoby
potwierdzić w testach na liniach komórkowych. Wskazywałoby to na istotną rolę
elementów struktury drugorzędowej zachowanych w mini-vRNA8.
Sugeruje się, że, tak jak w przypadku innych wirusów, struktura drugorzędowa
vRNA ma istotne znaczenie podczas cyklu replikacyjnego, a jej ważne elementy
strukturalne muszą być zachowane mimo ewolucyjnej zmienności wirusa grypy.
W związku z tym, zaprojektowano 14 oligonukleotydów antysensowych (ASO)
kierując
się
zaproponowaną
strukturą
drugorzędową
vRNA8
[szczep
A/VietNam/1203/2004 (H5N1)], mapowaniem mikromacierzowym oraz regionami
komplementarnymi pomiędzy vRNA poszczególnych segmentów.
Mikromacierze izoenergetyczne dostarczając informacji na temat rejonów
jednoniciowych w cząsteczce, tym samym wskazały również dostępne miejsca dla
wiązania oligonukleotydów antysensowych. Miejsca te dodatkowo były potwierdzone
poprzez hydrolizę RNA z użyciem RNazy H. Informacja ta była istotna podczas
projektowania oligonukleotydów antysensowych, jako potencjalnych inhibitorów cyklu
replikacyjnego wirusa grypy. Jako miejsca wiązania sond oligonukleotydowych (środek
wiązania w sekwencji vRNA8) określono następujące nukleotydy: 17, 68, 69, 117, 141,
142, 163, 169-171, 250, 253, 254, 275, 389, 390, 405, 407-412, 436, 534, 535, 537, 538,
575-577, 728-730 oraz 854.
W vRNA8 wykazano obecność rejonów komplementarnych do vRNA
pozostałych siedmiu segmentów wirusa grypy, korzystając z programu BLAST.
Wykazano, że rejon 513-539 posiada fragmenty komplementarne do vRNA czterech
innych segmentów (segmentu 1, 3, 4 oraz 5). Występowały również trzy rejony (267286, 572-589, 791-813) komplementarne do vRNA trzech segmentów (odpowiednio:
segmentu 3, 5, 6, segmentu 3, 4, 5 oraz segmentu 3, 4, 6). Natomiast aż 11 fragmentów
posiadało wspólną część komplementarną do dwóch innych segmentów: 30-51 (vRNA1
i vRNA7); 84-96 (vRNA1 i vRNA5); 163-176 (vRNA5 i vRNA7); 176-192, 306-318,
640-653 oraz 689-714 (vRNA4 i vRNA7); 220-231 (vRNA3 i vRNA5); 330-344, 623634 (vRNA3 i vRNA7) oraz 770-785 (vRNA4 i vRNA6). Przypuszcza się, że regiony te
mogą być odpowiedzialne za oddziaływania pomiędzy segmentami. Z tego powodu
podczas projektowania ASO szczególną uwagę zwracano również na te rejony
wirusowego RNA.
Aktywność zaprojektowanych oligonukleotydów antysensowych badano na linii
komórkowej MDCK infekowanej wirusem grypy szczepu A/California/04/2009
(H1N1). Wykorzystywany w badaniach wirus w 2009 roku wywołał pandemię. Szczep
ten wybrano ze względu na możliwość przeprowadzenia badań z wykorzystaniem
naturalnego
wirusa
w
laboratorium
prof.
Luisa
Martinez-Sobrido
(Wydział
Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytet w Rochester, USA). Dodatkową zaletą jest
model mysi do badań nad tym wirusem istniejący w tym samym laboratorium.
Wszystkie ASO, z wyjątkiem oligomeru ASO 276-8C, które składały się
z 2’-O-metylowanych oligonukleotydów wykazywały znaczącą inhibicję cyklu
replikacyjnego wirusa w komórkach MDCK. Szczególnie wysoką aktywność wykazał
oligonukleotyd antysensowy 168-8U, który zmniejszał namnażanie wirusa do poziomu
3%. Zaobserwowano również, że oligomer G528-8U promował namnażanie wirusa
w komórkach MDCK, zwiększając ilość wirusa do poziomu 189% w stosunku
do kontroli. Zjawisko to wymaga jednak dodatkowych badań, w celu jego wyjaśniania.
Efekt wywoływany przez G528-8U mógłby być wykorzystany w wydajnym
namnażaniu szczepów laboratoryjnych przy produkcji szczepionek i w celach
naukowych.
Uzyskane
wyniki
inhibicji
cyklu
replikacyjnego
wirusa
wskazują
na znaczenie funkcjonalne struktury drugorzędowej vRNA8. Zastosowana strategia,
której punktem wyjścia jest model struktury drugorzędowej, może być podstawą
projektowania efektywnych inhibitorowych oligonukleotydów nakierowanych na RNA
wirusa grypy.