ocena - Centrum Onkologii

prof. dr hab.med. Anna Korycka-Wołowiec
Klinika Hematologii
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Łódź. dnia 6 maja 2015r.
Ocena rozprawy doktorskiej mgr Tomasza Sewastianika
pt „ Ekspresja tioredoksyny w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B: mechanizmy
regulacji oraz konsekwencje inhibicji”
Chłoniak rozlany z dużych komórek B (diffuse large B-cell lymphoma; DLBCL) jest
nowotworem wywodzącym się z germinalnych lub postgerminalnych komórek limfoidalnych
B, które po kontakcie z obcym antygenem uległy transformacji nowotworowej. Należy on
do chłoniaków agresywnych i stanowi 30-50% wszystkich chłoniaków nieziarniczych u
dorosłych. W ostatnich latach, dzięki rozwojowi metod biologii molekularnej, dokonano
istotnego postępu w zakresie zrozumienia patogenezy tej choroby. Szczególnie dużą rolę
odegrało profilowanie ekspresji genów, które pozwoliło na sklasyfikowanie pod względem
transkrypcyjnym chłoniaków DLBCL nierozróżnialnych metodami tradycyjnymi. W
klasyfikacji WHO 2008 w obrębie DLBCL wyodrębniono grupę chłoniaków NOS (not
otherwise specified), bez specyficznych cech klinicznych, w której wyróżniono 2 główne
podgrupy: germinal centre B-cell like (GCB) i activated B-cell like (ABC), różniące się
profilem ekspresji genów. Stosując narzędzia analizy nienadzorowanej opracowano
klasyfikację CCC bardziej oddającą biologię komórek chłoniakowych i wyodrębniającą 3
podtypy DLBCL różniące się pod względem wiodących procesów patogenetyczno molekularnych: HR (host responce), BCR (B-cell receptor) i OxPhos (oxidative
phosphorylation).
Chłoniaki OxPhos cechują się nietypowym profilem metabolicznym.
Mimo, iż większość nowotworów charakteryzuje tak zwany efekt Warburga, czyli
wykorzystanie procesu glikolizy do produkcji energii nawet w warunkach tlenowych
(„tlenowa glikoliza”), komórki chłoniaków OxPhos są przykładem odstępstwa od tej reguły
i produkują więcej energii w mitochondriach niż w procesach glikolizy. W komórkach tych
zachodzi wzmożony proces fosforylacji oksydacyjnej, której efektem ubocznym jest
produkcja reaktywnych form tlenu (ROS, reactive oxygen species). Wiele nowotworów
wykorzystuje komórkowe systemy antyoksydacyjne, takie jak np. układ reduktaza
tioredoksyny-tioredoksyna-peroksyredoksyny do neutralizacji nadmiernej produkcji ROS
wynikającej z procesów onkogennych. Rola systemu tioredoksyny (TXN) w patogenezie
1
DLBCL nie jest jednak dotychczas poznana. Uzasadnione wydaje się więc podjęcie przez mgr
Tomasz Sewastianika badań dotyczących mechanizmu regulacji ekspresji tioredoksyny w
DLBCL oraz konsekwencji wynikających z zahamowania tego systemu.
Przedłożona mi do oceny rozprawa doktorska mgr Tomasz Sewastianika
p.t.
„Ekspresja tioredoksyny w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B: mechanizmy regulacji
oraz konsekwencje inhibicji” liczy 95 stron maszynopisu i ma typowy dla rozpraw
doktorskich układ, składając się ze spisu treści oraz rozdziałów zatytułowanych: Wstęp, Cele
pracy, Materiał i metody, Wyniki, Dyskusja, Wnioski, Streszczenie oraz Piśmiennictwo.
Całość uzupełniona jest wykazem używanych skrótów oraz spisem tabel i rycin, które
ułatwiają zapoznanie się z treścią pracy.
W rozdziale „Wstęp” Doktorant szczegółowo omawia zagadnienia dotyczące cech
molekularnych DLBCL, roli reaktywnych form tlenu w transformacji nowotworowej,
tioredoksynie pełniącej funkcję regulatora odpowiedzi redox oraz roli rodziny czynników
transkrypcyjnych FOXO w odpowiedzi na ROS. W ostatniej części tego rozdziału Doktorant
skoncentrował się na roli ROS w chłoniakach DLBCL, dzięki czemu w sposób bardzo
zręczny powraca do zagadnień stanowiących podstawowy temat rozprawy. Cały omawiany
rozdział traktuje o skomplikowanych procesach biochemicznych i molekularnych. Jest on
napisany w sposób świadczący o znakomitym przygotowaniu teoretycznym Doktoranta do
łączenia trudnych zagadnieniach molekularnych i klinicznych. Autor wykazał się także dużą
umiejętnością korzystania z piśmiennictwa naukowego.
W rozdziale „Cel pracy” mgr Tomasz Sewastianik przedstawia w sposób syntetyczny
pięć podstawowych celów badawczych. Są one nowatorskie oraz istotne z punktu widzenia
poznawczego, a także klinicznego.
Rozdział „Materiały i metody” otwiera podrozdział poświęcony liniom komórkowym
chłoniaka DLBCL wykorzystanym w pracy oraz ogólnym zasadom prowadzenia hodowli w
warunkach in vitro. W dalszej części rozdziału Doktorant przedstawia bioinformatyczne i
biostatystyczne metody badawcze. Stan acetylacji FOXO1 i jej wpływ na funkcje FOXO1 w
komórkach DLBCL, immunoblotting oraz koimmunoprecypitacja to kolejne podrozdziały, w
których Doktorant udowodnił biegłość w posługiwaniu się narzędziami biologii molekularnej.
Rozdział ten uzupełnia 7 logiczne skonstruowanych tabel ułatwiających czytelnikowi
zapoznanie się z niejednokrotnie skomplikowaną metodyką. W rozdziale tym zwraca uwagę
umiejętność swobodnego korzystania z technik bioinformatycznych, ich adekwatne
zastosowanie i budowanie hipotez eksperymentalnych lub ich weryfikowanie w oparciu o
publicznie dostępne dane. Dobór zastosowanych metod badawczych, jak również testów
2
statystycznych i bioinformatycznych nie budzi zastrzeżeń, a szczegółowość przedstawienia
procedur eksperymentalnych wskazuje na biegłość doktoranta w posługiwaniu się metodami
molekularnymi, bioinformatycznymi i biostatystystycznymi.
Jedynym zastrzeżeniem jest
umieszczenie przez Doktoranta metod analizy statystycznej i bioinformatycznej na początku
rozdziału, przed opisaniem technik badawczych, których te analizy dotyczą.
W rozdziale zatytułowanym „Wyniki” Doktorant przedstawia uzyskane wyniki zarówno,
opisowo, jak i w formie 7 rozbudowanych rycin i 1 tabeli. Kolejność prezentacji wyników jest
przejrzysta, logiczna i zgodna z postawionymi celami pracy. Autor analizuje kolejno
nadekspresję tioredoksyny w komórkach OxPhos i BCR chłoniaka DLBCL, wpływ BCL6 na
regulację ekspresji TXN oraz toksyczny wpływ zahamowania TXN dla komórek OxPhos,
wpływ wyciszenia TXN na odpowiedź komórek OxPhos na doksorubicynę, jak również
wpływ p300 na acetylację FOXO1 i regulację jego aktywności transkrypcyjnej oraz wpływ
acetylacji i jej zablokowania na funkcję FOXO1 w komórkach DLBCL. Zastrzeżenia budzi
rycina 8 , na której błędnie oznakowano sposób analizy komórek apoptotycznych w panelu C.
Autor przedstawia bowiem apoptozę mierzoną w układzie Aneksyna V/PE-7-AAD, podczas
gdy panel D, który jest ilościowym przedstawieniem wyników z panelu C w postaci wykresu
słupkowego, zgodnie z metodyką, jako apoptozę mierzoną w układzie Aneksyna V-PI.
W rozdziale „Dyskusja” Doktorant omawia uzyskane wyniki w szeroko zakreślonym
kontekście danych literaturowych, poświęconych badanemu zagadnieniu oraz przedstawia ich
własną interpretację. Uwagę Recenzenta zwraca fakt, że Doktorant analizuje uzyskane wyniki
w sposób ostrożny i wyważony, świadczący o Jego dojrzałości naukowej. Lektura tego
rozdziału po raz kolejny przekonuje czytelnika rozprawy o głębokiej wiedzy Doktoranta i
Jego umiejętności twórczego i krytycznego korzystania z piśmiennictwa naukowego.
Kolejny rozdział zawiera pięć wniosków, logicznie wynikających z uzyskanych wyników
i odpowiadających postawionym celom pracy.
1. TXN ulega nadekspresji w chłoniakach DLBCL o profilu OxPhos oraz ABC w
porównaniu do odpowiednio BCR i GCB, a nadekspresja TXN wiąże się z krótszym
całkowitym czasem przeżycia u chorych na DLBCL niezależnie od schematu leczenia (RCHOP vs CHOP),
2. Nadekspresja TXN w chłoniakach OxPhos przynajmniej po części wynika z braku
aktywności czynnika transkrypcyjnego BCL6,
3. Wyciszenie ekspresji TXN zwiększa wrażliwość komórek OxPhos na stres oksydacyjny
oraz doksorubicynę,
3
4. TXN zmniejsza zależną od p300 acetylację FOXO1 w odpowiedzi na RFT, co z kolei
prowadzi do zmniejszenia aktywności transkrypcyjnej FOXO1 w zakresie genów
proapoptotycznych,
5. W komórkach z wyciszoną ekspresją TXN, FOXO1 w odpowiedzi na stres oksydacyjny
ulega translokacji do jądra komórkowego i indukuje ekspresję genów zaangażowanych w
zahamowanie cyklu komórkowego oraz apoptozę. Wyciszenie FOXO1 ogranicza nasilenie
apoptozy w komórkach ze zmniejszoną ekspresją TXN w odpowiedzi na RFT, co wskazuje,
że FOXO1 jest sensorem oraz efektorem stresu oksydacyjnego w komórkach OxPhos
DLBCL.
Zdaniem Recenzenta należałoby podkreślić, że wniosek 1 został sformułowany na podstawie
dostępnych baz ekspresji genów z mikromacierzy RNA u chorych na DLBCL, a nie są to
wyniki badań eksperymentalnych przeprowadzonych przez Doktoranta. Ponadto zarówno
wniosek 3, jak i 4 jest raczej obserwacją.
Rozprawę kończy streszczenie w języku polskim i angielskim oraz spis 182 pozycji
piśmiennictwa ułożonych w kolejności cytowań, trafnie dobranych i poprawnie cytowanych
w tekście.
Podsumowując stwierdzam, że przedłożona mi do oceny rozprawa doktorska mgr
Tomasz Sewastianika p.t. „Ekspresja tioredoksyny w chłoniaku rozlanym z dużych komórek
B: mechanizmy regulacji oraz konsekwencje inhibicji” spełnia wszystkie wymogi stawiane
rozprawie na stopień naukowy doktora nauk medycznych. Przedstawione powyżej uwagi,
poczynione z obowiązku recenzenta, nie mają charakteru zarzutów merytorycznych i nie
umniejszają mojej ogólnej opinii na temat pracy, którą oceniam bardzo wysoko. Temat
rozprawy jest nowoczesny i dobrze wpisujący się w aktualne kierunki badań molekularnych i
bioinformatycznych, a sama praca stanowi oryginalne rozwiązanie przez Doktoranta
zagadnienia naukowego. Doktorant wykazał się głęboką wiedzą teoretyczną dotyczącą
biochemii i biologii molekularnej, umiejętnością twórczego i krytycznego korzystania z
piśmiennictwa, planowania badań naukowych i samodzielnego ich przeprowadzenia, oraz
rzetelnej analizy uzyskanych wyników.
Mam więc zaszczyt i przyjemność wnioskować do Wysokiej Rady Naukowej
Centrum Onkologii-Instytutu im M. Skłodowskiej-Curie w Warszawie o dopuszczenie
mgr Tomasza Sewastianika do dalszych etapów przewodu doktorskiego oraz o
wyróżnienie pracy.
prof.dr hab.med. Anna Korycka-Wołowiec
4