Pobierz i wydrukuj materiały

Test ELISA do wykrywania przeciwciał przeciwko Mycobacterium bovis
VetExpert BTB Ab ELISA 2.0
•
Zasada działania testu
Test VetExpert BTB Ab ELISA 2.0 jest bezpośrednim testem immunoenzymosorbcyjnym służącym
do jakościowego wykrywania przeciwciał przeciwko Mycobacterium bovis w surowicy.
Test VetExpert BTB Ab ELISA 2.0 składa się z płytki mikrotitracyjnej, której studzienki są pokryte
oczyszczonym antygenem BTB. W czasie wykonywania testu płytki ELISA pokryte antygenem są
inkubowane z jednakową mieszaniną surowicy i koniugatu (1:100 roztworu w rozcieńczalnikach
koniugatu) przez 60 minut w temperaturze 37°C. Podczas inkubacji przeciwciała przeciwko M.bovis
obecne w próbce testowej wiążą się ze znajdującym się w studzience oczyszczonym antygenem
M.bovis. Po inkubacji niezwiązany materiał badany zostaje usunięty poprzez odessanie i wypłukanie, a następnie do dołka dodawany jest roztwór substratu. W efekcie aktywność enzymu w studzience będzie wprost proporcjonalna do stężenia koniugatu w próbkach materiału badanego
i można ją zmierzyć poprzez inkubację fazy stałej z roztworem substratu. Reakcja jest hamowana
poprzez dodanie roztworu hamującego, a uzyskany wynik należy odczytać kolometrycznie przy
użyciu spektrofotometru przy długości fali 450 nm wobec fali referencyjnej 630 nm.
W teście zastosowano specjalnie wyselekcjonowane antygeny M.bovis jako materiał wychwytujący. Pozwalają one testowi Vetexpert BTB Ab ELISA 2.0 na identyfikację przeciwciał przeciwko
M.bovis w badanych próbkach z dużym stopniem dokładności.
Zawartość (480 testów/zestaw)
W skład zestawu VetExpert BTB Ab ELISA 2.0 wchodzą następujące elementy do wykonania testu.
1) Mikropłytka opłaszczona oczyszczonym BTB Ag (1): 5 płytek (96 studzienek/płytka) ułożonych
w dwanaście pasków 1x8.
2) Negatywna surowica kontrolna (2): 1 fiolka (2.5 ml) zwykłej surowicy krowiej poddana działaniu wapnia. Azydek sodu (0.01%) dodany jako środek konserwujący.
3) Silnie pozytywna surowica kontrolna (3): 1 fiolka (2.5 ml) surowicy krowiej silnie dodatniej
anty-BTB poddanej działaniu wapnia. Sodek azydu (0.01%) dodany jako środek konserwujący.
4) Roztwór płuczący (skoncentrowany 10x) (4): 1 butelka (250 ml) PBS-Tween 20. Środek konserwujący: Thimerosal (0.01 %)
5) Uwaga: Przed zastosowaniem zawartość jednej butelki napełnić do 1000 ml wodą destylowaną.
W przypadku nierozpuszczonych kryształków, ponownie zawiesić roztwór, umieszczając butelkę w temperaturze 37°C na kilka minut.
6) Koniugat (5): 1 butelka (40 ml) antygenu M.bovis -HRP, zbuforowany fosforanami roztwór fizjologiczny. Środek konserwujący: Proclin (0.06%)
7) Substrat (gotowy do użycia) (6): 1 butelka (60 ml) roztworu tetrametylobenzydyny z buforem
cytrynianowo-fosforanowym zawierającym H2O2.
8) Roztwór hamujący (7): 1 butelka (80 ml) kwasu siarkowego 1N. Gotowy do użycia.
9) Samoprzylepna nakładka uszczelniająca: 10EA
10) Instrukcja użycia
•
•
Środki ostrożności
W celu uzyskania wiarygodnych wyników należy ściśle przestrzegać poniższych zasad:
1) Do stosowania tylko w diagnostyce in vitro.
2) Nie mieszać odczynników pochodzących z różnych partii.
3) W czasie wykonywania testu używać dokładnie oczyszczonych naczyń szklanych, niezanieczyszczonych jonami metalu lub substancjami o działaniu utleniającym
4) Stosować rękawice jednorazowego użytku w trakcie obchodzenia się z potencjalnie zakaźnym
materiałem oraz w trakcie wykonywania testu.
5) Należy obchodzić się ostrożnie z substancjami i roztworem hamującym. Unikać kontaktu
produktu ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. W sytuacji wypadku przemyć starannie pod
bieżącą wodą.
•
Pobranie próbek i przechowywanie
1) Odwirować pełną krew w celu uzyskania surowicy.
2) Jeżeli próbki materiału badanego nie są analizowane bezpośrednio po pobraniu, należy je
umieścić w warunkach chłodniczych w temperaturze 2~8°C. W przypadku okresu przechowywania dłuższego niż trzy dni, próbki należy zamrozić w temperaturze -20°C lub niższej. Przed
użyciem należy je doprowadzić do temperatury otoczenia (18~25°C).
3) Próbki materiału badanego zawierające osad mogą dać sprzeczne wyniki testu. Takie próbki
należy oczyścić przed poddaniem testowi.
•
Przygotowanie odczynników
1) Przed użyciem wszystkie odczynniki należy ogrzać do temperatury otoczenia (18~25°C).
2) Przygotować odpowiednią objętość płynu do płukania: skoncentrowany 10x roztwór płuczący
(4) przed użyciem należy rozcieńczyć w proporcji 1:9 z wodą destylowaną/dejonizowaną (np.
100 ml roztworu płuczącego (4) dodać do 900 ml wody destylowanej) i dobrze wymieszać.
W przypadku obecności nierozpuszczonych kryształków, roztwór należy ponownie zawiesić
poprzez podgrzanie przez kilka minut w temperaturze 37°C.
•
Wykonanie testu
1) Przygotować paski studzienek: dla negatywnej surowicy kontrolnej 3 studzienki, dla pozytywnej surowicy kontrolnej 3 studzienki a dla próbek badanych po jednej studzience.
2) Dodać 50 µl każdej z podstawowej surowicy kontroli negatywnej i pozytywnej do 3 studzienek
oraz 50 µl każdej z próbek do odpowiednich studzienek.
3) Dodać 50 µl antygenu M.bovis – HRP do każdej studzienki.
Producent: BioNote, Inc.
2-9 Seogu-dong
Hwaseong-si
Gyeonggi-do
Republic of Korea 445-170
Importer na Europę Środkowo-Wschodnią
Vet Planet Sp. z o.o.
Biuro Handlowe
ul. Elżbiety Drużbackiej 7/3, 01-622 Warszawa
tel. +48 662 216 773
www.vetexpert.pl
4) Przykryć mikropłytkę samoprzylepną nakładką uszczelniającą i dokładnie wymieszać w mieszadle wibracyjnym. Mieszanie jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych rezultatów.
5) Inkubować studzienki w temperaturze 37°C przez 60 minut.
6) Wypłukać mikropłytkę 6 razy używając 350 µl / studzienkę rozcieńczonego roztworu płuczącego. Odessać cały płyn ze studzienek.
7) Dodać 100 µl substratu (gotowy do użycia) do każdej studzienki.
8) Inkubować studzienki w temperaturze otoczenia (18~25°C) przez 15 minut.
9) Dodać 100 µl roztworu hamującego do każdej studzienki.
10) Odczytać gęstość optyczną (OD) studzienek za pomocą spektrofotometru bichromatycznego
przy długości fali 450 nm, używając referencyjnej fali 620 nm. Odczyt musi zostać ukończony
w przeciągu 1 godziny od zakończenia testu.
•
Interpretacja wyniku
1) Walidacja testu
1. Wartość OD negatywnej surowicy kontrolnej powinna być poniżej 0,150.
2. Wartość OD pozytywnej surowicy kontrolnej powinna być powyżej 1,500.
3. Jeżeli żadna z tych wartości nie znajduje się w tym przedziale, VetExpert BTB Ab ELISA
2.0 należy uznać za nieważny, a próbki należy zbadać ponownie.
2)S/P
S/P =
(OD próbki – średnia OD negatywnej surowicy kontrolnej)
(średnia OD pozytywnej surowicy kontrolnej – średnia OD negatywnej surowicy kontrolnej)
3) Interpretacja wyników surowicy
Po obliczeniu wartości S/P, wartość dodatnia i ujemna powinna zostać określona na podstawie
poniższych kryteriów S/P.
1. Dodatnia: S/P próbki ≥0.5
2. Ujemna: S/P próbki <0.5.
i zakłócenia
•1) Ograniczenia
Podczas wykonywania testu należy ściśle przestrzegać procedury wykonania testu, zachować
środki ostrożności i odpowiednio zinterpretować wyniki niniejszego testu.
2)Próbki
(1) Próbki zawierające azydek sodu nie mają wpływu na wynik testu.
(2) Pasteryzowane próbki surowic (nie krócej niż 10 godzin w temperaturze 60°C) mogą
prowadzić do zmniejszonej reaktywności i w związku z tym nie powinny być wykorzystywane.
(3) Próbki surowic inaktywowane termicznie (1 godzina w 56°C) nie wpływają ujemnie
na test.
(4) Antykoagulanty takie jak heparyna, EDTA i cytrynian nie mają wpływu na wynik testu.
(5) Próbki hemolityczne należy przed wykorzystaniem poddać odwirowaniu celem uniknięcia zakłóceń składników komórkowych.
(6) Czynniki reumatoidalne, jeżeli znajdują się w próbkach mogą prowadzić do podwyższonej reaktywności.
(7) Próbki z lipemią i żółtaczką nie zakłócają wyników testu.
(8) Niniejszy zestaw testowy wykrywa przeciwciała przeciwko M.bovis w próbkach surowicy i może być wykorzystywany do badań przesiewowych.
(9) Niedodanie materiału badanego w trakcie procedury wykonania testu może spowodować uzyskanie wyniku fałszywie ujemnego. W przypadku podejrzenia klinicznej
infekcji, należy rozważyć powtórne wykonanie testu.
i stabilność
•1) Przechowywanie
Test VetExpert BTB Ab ELISA 2.0 należy przechowywać w temperaturze 2~8°C. Niniejszy zestaw pozostaje stabilny do terminu ważności wydrukowanego na opakowaniu oraz na etykiecie każdego materiału / odczynnika.
2) Stabilność raz otwartych materiałów / odczynników:
Materiał / odczynnik
Stan
Przechowywanie
Stabilność
Rozcieńczony roztwór
płuczący
Rozcieńczony 1:9
2~8°C
temp. otoczenia
(18~25°C)
1 tydzień
•96Opakowanie:
testów/zestaw, 480 testów/zestaw, 960 testów/zestaw.
Precyzja
•Precyzję
pomiarów określono wykonując 10 powtórzeń trzech próbek badanych: surowicy ujemnej, surowicy słabo-dodatniej oraz surowicy silnie-dodatniej. Współczynnik zmienności CV (%)
wartości ujemnych, słabo-dodatnich i silnie-dodatnich mieścił się w przedziale 10%.
•1)Bibliografia
Sang_Nae Cho. Expression of the MPB70 Protein of Myobacterium bovis and Use in the Serodiagnosis of Bovine Tuberculosis. Kor.J.Vet.Publ.,Vol.22, No.2,1998
2) Manual of diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 5th edition. 2004. Part 2. Chapter 2.4.7 ‘Bovine Tuberculosis’.
Podmiot odpowiedzialny
Vet Planet Sp z o.o.
ul. Staszica 20A/3
05-092 Łomianki
tel. +48 662 204 328
Эксклюзивный дистрибьютор в СНГ
OOO "ВетЭксперт"
г. Москва, улица Шипиловская, 64/1
Тел.: (495)645 3657
www.vetexpert-rf.ru