Barwienie tkanki 1. Czemu konieczne jest barwienie? - Neuro

Barwienie tkanki 1. Czemu konieczne jest barwienie? -­‐ bez barwienia obraz jest słabo kontrastowy – nie można rozróżnić struktur gdyż komórki podobnie absorbują światło 2. Po co wykorzystujemy wybarwione skrawki? -­‐ zobrazowanie struktur mózgu, zmian w tych strukturach -­‐ przy badaniach funkcjonalnych potwierdzenie miejsca umieszczenia elektrody bądź aplikacji leku -­‐ zliczanie neuronów w strukturach i obserwacja zmian -­‐ obserwacja patologii -­‐ IMS – wskazanie struktur w których obserwowane są zmiany 3. Różne metody cięcia: -­‐ mikrotom: konieczne utrwalenie – „wymiana wody na parafinę” -­‐ kriotom: tylko zamrożenie więc możliwa immunocytochemia, szybsza metoda, stosowana do szybkiej diagnostyki -­‐ vibratom: delikatne tkanki, o wystarczy agaroza, o brak parafiny i jej późniejszego odmywania, o mniej artefaktów spowodowanych np. niską temperaturą, o krótsza immunohistochemia, ale o grubsze skrawki, trudniejsza, utrwalenie: szkiełko + DPX może być niemożliwe ze względu na grubość. 4. Jaka jest różnica między histologią a histochemią? Histologia: -­‐ histos – tkanka, logos – wiedza, nauka -­‐ Nauka o budowie rozwoju i funkcji tkanek (anatomia – narządy) -­‐ Badanie mikroskopowe tkanki (badanie struktury mózgu, identyfikacja odpowiednich obszarów mózgu, badania anatomiczne, „cytoarchitektura” mózgu -­‐ skontrastowanie struktur komórkowych i tkankowych -­‐ Techniki służące odpowiedniemu przygotowaniu tkanki do obserwacji pod mikroskopem. Histochemia: -­‐ Pogranicze histologii i biochemii -­‐ Umiejscowienie w komórkach (cytochemia) i tkankach (histochemia) określonych substancji chemicznych oraz enzymów. -­‐
-­‐
lokalizacja receptorów, ekspresji genów itp. uwidocznienia w preparacie mikroskopowym jedynie ściśle określonych substancji lub grup chemicznych, będących przedmiotem badań. Reakcje te cechuje zatem specyficzność (swoistość), stanowiąca podstawową własność metodyki histochemicznej. 5. Dlaczego do czasu przygotowywania skrawków tkanki przetrzymywane są w ciekłym azocie? -­‐ zatrzymanie aktywności biologicznej (zapobieganie zmianom pośmiertnym, enzymatycznym) -­‐ zachowanie struktury najbardziej zbliżonej do naturalnej – bardzo szybkie zamrażanie (od +37, do -­‐196 0C) – powstaje lód amorficzny nie tworzący sieci krystalicznej, nie zwiększający objętości i nie niszczący komórek -­‐ ochrona przed bakteriami -­‐ utrwalanie mechaniczne tkanki (utwardzenie jej, wzmocnienie wytrzymałości) 6. Różne techniki barwienia: -­‐
-­‐
-­‐
-­‐
-­‐
-­‐
Barwienie Golgiego o Barwienie pojedynczych neuronów (1/10) – brak informacji ilościowej o Dwuchromian potasu i azotan srebra Barwienie Hematoksyliną i Eozyną o Hematoksylina: zabarwienie jądra -­‐ niebieskie (ładunek +) (zasadochłonne struktury) o Eozyna: białka cytoplazmatyczne – różowy (ładunek -­‐) (kwasochłonne struktury) Barwienie mieliny (LFB Luxol fast blue) o Zasadowe elementy lipoprotein o Mielina niebieska, komórki nerwowe purpurowe Fiolet krezylu: niżej Techniki immunohistochemiczne Techniki pozwalające śledzić przebieg neuronów o Następcze – ze struktury gdzie prowadzą o Następcze -­‐ gdzie jest źródło unerwienia 7. Co barwi fiolet krezylu? -­‐
-­‐
Barwienie ciałek Nissla – szorstka siateczka śródplazmatyczna, ciasno upakowana, rybosomy, RNA Struktury obecne w ciele komórki (soma) i dendrytach, brak w aksonach -­‐
-­‐
-­‐
Nadaje szarą barwę istocie szarej Zanik przy wyczerpaniu komórki np. przez długotrwałe barwienie Możliwość policzenia komórek w strukturze 8. Otrzymany skrawek jest za jasno wybarwiony. Podaj dwie zmiany, które mogą poprawić jakość preparatu. 9. Jakim typem barwienia: progresywnym, czy regresywnym jest barwienie fioletem krezylu? -­‐
-­‐
progresywne: gdy w barwiku przetrzymujemy tkankę do odpowiedniego nasycenia kolorem regresywne: gdy najpierw przesycamy, a potem odmywamy nadmiar barwnika 10. Kolejne etapy barwienia: 1) Usunięcie lipidów i utrwalacza -­‐ alkohol (95% etanol) 2) Rechydratacja – fiolet rozpuszcza się w wodzie – konieczne do zabarwienia (etanol 70%, 50%, woda) 3) Barwienie 4) Odmycie nadmiaru barwnika 5) Różnicowanie przebarwionych skrawków (barwienie regresywne – kwaśny etanol) 6) Dehydratacja (etanol 95%) 7) Prześwietlenie – Histochoice (ksylen) 8) Utrwalenie i zamknięcie – DPX 11. Opisz przekroje mózgu poziomy czołowy strzałkowy