ĆWICZENIE VIII

ĆWICZENIE VIII
Temat : Udział drobnoustrojów w obiegu węgla w przyrodzie
Fermentacja mlekowa stanowi formę oddychania beztlenowego. Fermentacja mlekowa jest to
mikrobiologiczny beztlenowy proces przekształcania węglowodorów do kwasu mlekowego. W procesie tym
bakterie właściwej fermentacji mlekowej zdobywają energię. Należą do nich ziarniaki z rodziny
Streptococcaceae (rodzaje Streptococcus, Leuconostoc i in.) i pałeczki z rodzaju Lactobacillus. Wszystkie te
bakterie są gramdodatnie i na ogół nieruchliwe. Fizjologicznie są beztlenowcami względnymi. Oznaczają się
złożonymi wymaganiami pokarmowymi (auksotrofy). Proces fermentacji może przebiegać w różny sposób.
•
homofermentacja produkująca prawie wyłącznie (ponad 95%) kwas mlekowy i przebiegająca wg
wzoru sumarycznego:
Rodzaje: Streptococcus, Streptobacterium, Thermobacterium
•
heterofermentacja, w której wyniku powstaje ok. 50% kwasu mlekowego i znaczna ilość CO2, kwasu
octowego i (lub) etanolu. Sposób przebiegu tego typu fermentacji jest cechą gatunkową.
Rodzaje: Betacoccus, Betabacterium
•
rzekoma fermentacja mlekowa (fermentacja pseudomlekowa) - kwas mlekowy może powstawać jako
jeden z produktów metabolizmu niektórych bakterii z rodziny Enterobacteriaceae np. E. coli lub
grzybów z klasy Zygomycetes np. Mucor, Rhizopus. Rozwój tych drobnoustrojów w kiszonkach
roślinnych jest nie pożądany.
Bakterie właściwej fermentacji mlekowej bytują na materiale roślinnym oraz w organizmach ssaków,
głównie na błonach śluzowych. Wtórnie występują w mleku i na materiale roślinnym. Gdzie przy
ograniczonym dostępie tlenu prowadzą samorzutną fermentację mlekową.
Kiszenie roślin ma na celu zabezpieczenie ich przed rozkładem w wyniku różnych procesów
mikrobiologicznych (rozkład białek, fermentacje dające produkty o przykrym zapachu, rozkład celulozy, skrobi
itp.). Dobrze przygotowana kiszonka może być przechowywana przez długi czas. Zepsucie kiszonki bywa
spowodowane przy dostępie powietrza przez rozwijające się na powierzchni grzyby z grupy Fungi imperfekti Oidium lactis i drożdżaki. Użytkują one kwas mlekowy jako źródło energii, w wyniku czego odkwaszają
kiszonkę. Wzrost pH umożliwia rozwój na masie roślinnej innych drobnoustrojów głównie bakterii i grzybów.
1. Mikroflora mleka:
Mleko, dzięki swoim składnikom, jak białka (kazeina, globulina, albumina), aminokwasy, laktoza,
tłuszcze, stanowi bardzo dobre podłoże do rozwoju różnych grup mikroorganizmów. Dojenie nawet w
warunkach aseptycznych zawiera niewielką ilość (rzędu setek komórek w 1 cm3) bakterii, które przenikają do
wymion kanałami strzykowymi. Są to na ogół drobnoustroje saprofityczne, z rodzaju Microccocus, ale mogą
także występować potencjalnie chorobotwórcze szczepy z rodzaju Staphylococcus (np. Staphylococcus
agalactiae - paciorkowiec bezmleczności, powodujący u krów zapalenie wymion). Znacznie ważniejsze jednak
od zakażenia wewnętrznego mleka jest zakażenie zewnętrzne, powodowane przez mikroorganizmy
występujące na skórze krów, w pomieszczeniu hodowlanym, paszy, czy ściółce oraz przenoszone przez
obsługujących pracowników.
Spośród najczęściej występujących w mleku drobnoustrojów można wymienić bakterie fermentacji
mlekowej, propionowej (ważne w procesie produkcji serów) bakterie fermentacji octowej oraz gnilne. Z tych
ostatnich najpopularniejsze są Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus vulgaris (rozkładający kazeinę do
peptonu), a z grupy coli: E. coli, Aerobacter aerogenes. Oprócz bakterii, w mleku znajdujemy także drożdże i
pleśnie. Drożdże, dostające się zwykle z paszy należą najczęściej do rodzaju Saccharomyces i
Zygosaccharomyces. Najpowszechniej występujące gatunki grzybów to Mucor mucedo, Rhizopus nigricanes
oraz Geotrichum candidum, rozwijające się w postaci białego nalotu na skwaśniałym mleku.
Za pośrednictwem mleka przenoszą się liczne choroby zakaźne, np.: brucelloza, gruźlica, pryszczyca pochodzące od chorych krów oraz tyfus czy czerwonka, dostające się do mleka poprzez kontakt z wodą
skażoną fekaliami lub wydzielinami ludzi chorych.
Badania mikrobiologiczne mleka jako artykułu powszechnego spożycia i surowca dla przemysłu
przetwórstwa rolnego obejmują ocenę sanitarno-higieniczną oraz badanie przydatności technologicznej.
•
•
•
oznaczanie ogólnej liczby tlenowych drobnoustrojów mezofilnych.
określenie miana coli w mleku
próba reduktazowa z resazuryną
Próba reduktazowa wskazuje na ogólne zakażenie mleka. Rozwijające się w mleku drobnoustroje
zużywają rozpuszczony w nim tlen, obniżając w ten sposób potencjał oksydoredukcyjny. Wzrasta
zapotrzebowanie na akceptator wodoru. Po w wyczerpaniu tlenu akceptorem stają się dodane do badanego
mleka barwniki, takie jak resazuryna lub błękit metylenowy. W wyniku przyłączenia wodoru (redukcji)
barwniki przechodzą w formę leukozwiązków (bezbarwną).
Szybkość zużycia tlenu, czyli odbarwienia barwników zależy od:
•
•
•
liczby drobnoustrojów,
rodzaju drobnoustrojów,
aktywności drobnoustrojów
Redukcja barwników następuje przede wszystkim w wyniku działalności drobnoustrojów bakterii z grupy
pałeczki okrężnicy (coli). Bakterie proteolityczne i psychrofilne, mogące w dużym stopniu wpływać na jakość
mleka, nie mają zdolności odbarwiania resazuryny jak i błękitu metylenowego.
Resazuryna w roztworze w stanie nie zredukowanym ma zabarwienie niebieskie. Tracąc tlen przechodzi
w pierwszym stadium redukcji w resorufinę, która jest różowa, następnie w drugim stadium przy całkowitej
redukcji - w bezbarwną dwuhydroresorufinę. Przy przejściu resazuryny nie zredukowanej w 1 stadium redukcji
pomiędzy zabarwieniem niebieskim, a różowym występuje cały szereg barw pośrednich, jak
niebieskofioletowa i czerwonofioletowa.
W początkowym okresie przechowywania mleka, bezpośrednio po udoju zawartość mikroflory spada na
skutek bakteriostatycznego i bakteriobójczego działania substancji zawartych w mleku, takich jak:
•
•
lizozym niszczący strukturę ścian komórkowych bakterii gramdodatnich
lakteniana hamująca rozwój paciorkowców mlekowych
Zawarte w mleku leukocyty również niszczą bakterie drogą fagocytozy. Czas trwania fazy bakteriobójczej
w mleku jest odwrotnie proporcjonalny do temperatury mleka i liczby bakterii w mleku.
Rodzaj rozwijającej się mikroflory w przechowywanym świeżym mleku zależy od temeratury
przechowywania. W niskich temperaturach (0-10°C) najlepiej rozwijają się psychrofile, drobnoustroje
fluoryzujące i alkalizujące wytwarzające enzymy proteolityczne i syntetyzujące witaminy. W temperaturze 1015°C poza psychrofilami rozwijają się paciorkowce, pałeczki z grupy okrężnicy i heterofermentatywne bakterie
fermentacji mlekowej. W temperaturze 15-30°C najlepiej rozwijają się paciorkowce mlekowe (Streptococcus
lactis). W wyższej temperaturze (30-40°C) następuje silny rozwój pałeczki z grupy coli i bakterie
homofermentacji mlekowej. W temperaturze ponad 40°C rozwijają się laseczki homomlekowe (Lactobacillus),
drożdże fermentujące laktozę, paciorkowce, enterokoki (Str. faecelis) i niektóre szczepy E. coli.
W mleku pozostawionym w temperaturze pokojowej najpierw rozwijają się drobnoustroje proteolityczne,
następnie bakterie fermentacji pseudomlekowej i pałeczki z grupy coli. W następnym stadium rozwijają się
paciorkowce mlekowe zakwaszające środowisko do pH=4,5-4,1. Przy tym poziomie kwasowości zahamowany
zostaje rozwój bakterii proteolitycznych, a dalsze ukwaszanie prowadzą bakterie mlekowe z rodzaju
Lactobacillus, których działalność zostaje zahamowana na skutek zbyt dużej ilości kwasu mlekowego (1,53%). Na powierzchni ukwaszonego mleka rozwijają się pleśnie i drożdże powierzchniowe zużywające kwas
mlekowy. Obniżenie kwasowości mleka w następstwie rozwoju drożdży i pleśni umożliwia ponowny rozwój
drobnoustrojów gnilnych powodujących dalsze zmiany aż do całkowitej mineralizacji mleka.
Mleko możemy utrwalić przez schłodzenie lub przez ogrzanie.
Chłodzenie mleka powoduje zahamowanie rozwoju drobnoustrojów przez obniżoną temperaturę, ale całość
mikroflory pozostaje żywa. W temperaturze 2-5°C możemy przechowywać przez 2-3 dni.
Pasteryzowanie mleka powoduje częściowe zniszczenie mikroflory. Zależnie od przeznaczenia mleka
przeprowadza się trzy rodzaje pasteryzacji:
•
•
•
pasteryzację niską w tem. 62-65°C przez 20-30 min, gdy mleko ma być użyte do produkcji serów
(mleko traci pewne wartości smakowe)
pasteryzację wysoką, krótkotrwałą w tem. 72-78°C przez 10-40 sekund w przypadku mleka
konsumpcyjnego
pasteryzację momentalną w tem. 85-95°C przez 2-3 sekundy, gdy mleko przeznaczone jest do produkcji
mleka zagęszczonego lub mleka w proszku
Skuteczność pasteryzacji mleka powinna wynosić co najmniej 99,5 %.
"Sterylizację" mleka przeprowadza się metodą UHT (ultra high temperature). W metodzie tej przegrzana
para wodna jest wtryskiwana do mleka wytwarzając temperaturę 135-150°C, w której mleko pozostaje przez 12 s, a następnie jest rozpylane przez specjalną dyszą podczas którego zostanie usunięta woda wprowadzona
podczas wstrzyknięcia pary. Tak przygotowane mleko nie ulega zepsuciu przez kilka tygodni, jakkolwiek
zawiera mikroflorę resztkową.
Część praktyczna
a) oznaczanie ogólnej liczby tlenowych drobnoustrojów mezofilnych w mleku metodą płytkową
Każda para wysiewa 1 cm3 mleka w rozcieńczeniu 10-5 lub 10-6 na jałową płytkę Petriego i zalewa ostudzoną
pożywką dla bakterii fermentacji mlekowej o składzie:
laktoza - l0 g
glukoza - l0 g
pepton - 5 g
ekstr. droż. - 0,1g
CaCO3 - 5 g
H2O - 1000 cm3
agar - 12 g
purpura bromokrezolowa - l0 cm3
Założone hodowle inkubujemy w temp. 28oC przez 1 tydzień.
b) określenie miana coli w mleku - określenie stopnia zanieczyszczenia mleka pałeczkami okrężnicy.
Każda para wysiewa określoną próbę mleka do 10 cm3 pożywki Eijkmana wg następującego schematu:
Pierwsza para: wysiewa 0,1 cm3 mleka do 10 cm3 pożywki i dokładnie ale delikatnie miesza.
Druga para: wysiewa 1 cm3 pożywki (z wysianym mlekiem) pierwszej pary do 9 cm3 świeżej pożywki i
dokładnie ale delikatnie miesza.
Trzecia para: wysiew 1 cm3 pożywki (z wysianym mlekiem) drugiej pary do 9 cm3 świeżej pożywki i dokładnie
ale delikatnie miesza.
Czwarta para: wysiewa 1 cm3 pożywki (z wysianym mlekiem) trzeciej pary do 9 cm3 świeżej pożywki i
dokładnie ale delikatnie miesza.
Wysiano:
•
•
•
•
•
Pierwsza para: 0,1 cm3 mleka,
Druga para: 0,01 cm3 mleka,
Trzecia para: 0,001 cm3 mleka,
Czwarta para: 0,0001 cm3 mleka
Wysiany materiał inkubować 24 - 48 h w temp. 37o C.
2. Mikroflora kiszonek - oznaczanie miana siarkowodoru w soku z kiszonki z kapusty - założenie
hodowli.
Kiszenie polega na fermentacyjnej przemianie cukrów w kwas mlekowy, który obniża pH środowiska i
jednocześnie sam w postaci nie zdysocjowanej jest inhibitorem wzrostu wielu drobnoustrojów. W wyniku
fermentacji i gromadzenia się kwasu pH spada poniżej 4,2 - zwykle do 3,5. Trwałe produkty uzyskuje się tylko
w przypadku kiszenia surowców zawierających wystarczająco dużo cukru. Z kiszeniem wiąże się pojęcie
minimum cukrowego; jest to najmniejsza zawartość cukru w suchej masie surowca pozwalająca na utrzymanie
w wyniku fermentacji mlekowej takiej ilości kwasu, aby pH spadło przynajmniej do 4,2. Takie pH zabezpiecza
kiszonki przed rozwojem bakterii gnilnych i masłowych, które jako beztlenowce zużywają mleczany
znalazłyby w słabo zakwaszonym środowisku doskonałe warunki rozwoju. Niektóre pasze zielone, np.
motylkowe zawierające mało cukru, kisi się łącznie z zielonkami zawierającymi nadmiar cukru w suchej masie,
jak np. kukurydza lub buraki.
Kiszoną kapustę otrzymuje się przez poddanie fermentacji mlekowej pociętych na paski liści kapusty.
Pocięte liście ubija się warstwami, dodając jednocześnie sól. Ubijanie ma na celu usunięcie powietrza oraz
przyśpieszanie wyciekania soku komórkowego. W soku komórkowym znajduje się ok. 4% cukrów, które
ulegają fermentacji. W pierwszym etapie fermentacji (do 10 dni) w prawie obojętnym odczynie rozwijają się
oprócz bakterii mlekowych przetrwalnikujące tlenowce, bakterie z grupy coli oraz drożdże. Gdy pH zaczyna
spadać, zmniejsza się liczba pałeczek okrężnicy, a zwiększa się liczba bakterii heteromlekowych, głównie z
gatunku Leuconostoc mesenterioides, która oprócz kwasu mlekowego wytwarza produkty takie jak kwas
mrówkowy, propionowy, masłowy, bursztynowy, octowy, etanol, dwutlenenek węgla, i inne związki
wpływające na smak i aromat kapusty. Przy pH 4,0 zostaje zahamowany całkowicie rozwój bakterii z grupy
coli i bakterii gnilnych.
W drugim etapie fermentacji trwającym od 10 do 16 dni rozwijają się bakterie homofermentywne, takie
jak Lactobacilus palantatum i pseudomlekowe Pediococcus ceravisae. Drobnoustroje te wytwarzają substancje
zapachową - acetylocholinę.
W końcowym etapie działają również bakterie należące do heterofermentatywnego gatunku Lactobacillus
brevis, wytwarzające oprócz kwasu mlekowego kwas octowy i zużywające mannitol.
Po około 2 tygodniach fermentacji kapusta powinna zawierać 1,5-1,8% kwasu mlekowego i wykazywać
pH 3,4-3,5. Ukiszoną kapustę pozostawia się na kilka tygodni w temperaturze 10°C. W tym czasie zachodzą
reakcje chemiczne między związkami powstałymi w czasie fermentacji. Kapusta dojrzewa i nabiera
odpowiednich cech.
Część praktyczna
Oznaczanie miana siarkowodoru w soku z kiszonki z kapusty - założenie hodowli.
Przygotować 10 cm3 soku z kapusty kiszonej świeżej i zepsutej. Jeżeli sok kwaśny (świeża) zalkalizować 0,1 %
NaOH do odczynu obojętnego.
Studenci otrzymują sok rozcieńczony 1:10. Każda para wysiewa materiał wg schematu.
1 para wysiewa 1 cm3 soku rozcieńczonego 10-1 do 9 cm3 pożywki (bulion z dodatkiem cysteiny), wymieszać i
przekazać 2 parze (l:100).
2 para wysiewa 1 cm3 pożywki z wysianym sokiem przez 1 parę (sok rozcieńczony 10-2) do 9 cm3 pożywki,
wymieszać i przekazać 3 parze (l:1000).
Kolejne pary postępują jak wyżej aż do uzyskania rozcieńczeń 10-6 (sok ze świeżej kapusty) i 10-9 (sok z kapusty
zepsutej)
Po wysianiu materiału do każdej probówki studenci wkładają pasek z bibuły przesyconej octanem ołowiu.
Jeden z końców bibuły należy zahaczyć o brzeg probówki tak aby pasek nie zanurzył się w pożywce.
3. Założenie hodowli tlenowych drobnoustrojów celulolitycznych na podłożu stałym i w pożywce
płynnej.
Celuloza - błonnik jest głównym wielocukrem ścian komórkowych roślin. Składa się z monomerów β-Dglukozy (od kilku do kilku tys.) połączonych wiązaniami 1,4 β-glikozydowymi. Charakteryzuje ją odporność
na czynniki chemiczne i mechaniczne, jest trudno rozpuszczalna.
Duże ilości błonnika dostają się wraz z resztkami roślinnymi do gleby, gdzie rozkładane przez
drobnoustroje celulolityczne. Jest to grupa fizjologiczna drobnoustrojów zróżnicowana systematycznie
(bakterie tlenowe i beztlenowe, promieniowce, np. Streptomyces, Streptosporangium, i grzyby, np.
Cheatomium, Trichoderma. Wydzielają one do środowiska enzymy hydrolityczne zwane celulazami które
prowadzą rozkład celulozy do dwucukru celobiazy. Następnie wewnątrzkomórkowo celobiaza jest
hydrolizowana do glukozy, wykorzystywanej przez drobnoustroje jako źródło węgla i energii.
Mikrobiologiczny rozkład błonnika jest bardzo ważnym ogniwem w obiegu węgla w przyrodzie. Tempo tego
procesu stanowi wskaźnik aktywności biologicznej gleby.
Część praktyczna
Założenie hodowli tlenowych drobnoustrojów celulolitycznych na podłożu stałym i w pożywce płynnej.
Każda para wysiewa grudki gleby do pożywki płynnej i na podłoże stałe z bibułą filtracyjną zastosowaną jako
substrat celulozy.
4. Założenie hodowli tlenowych drobnoustrojów amylolitycznych na podłożu stałym i w pożywce płynnej.
Skrobia, wielocukier złożony z amylozy i amylopektyny, jest rozkładana enzymatycznie przez
drobnoustroje zwane amylolitycznymi. Prowadzą one hydrolizę skrobi przez pozakomórkowy enzym aamylazę do dekstryn i dwucukru maltozy. Maltoza jest rozkładana zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowo do
glukozy, która stanowi dla drobnoustrojów źródło węgla i substrat energetyczny.
W glebie drobnoustroje amylolityczne występują bardzo licznie.
Drobnoustroje amylolityczne należą do różnych grup systematycznych. Są wśród nich liczne
promieniowce z rodzaju Streptomyces, Nocardia, Micromonospora, grzyby z rodzajów Aspergillus, Rhizopus,
Fusarium, Penicyllium, a także bakterie tlenowe z rodzajów Bacillus, Pseudomonas, Cytophaga i beztlenowe z
rodzaju Clostridium.
Część praktyczna
Założenie hodowli tlenowych drobnoustrojów amylolitycznych na podłożu stałym i w pożywce płynnej.
Każda para wysiewa na jałową płytkę Petriego 1 cm3 zawiesiny glebowej w rozcieńczeniu 10-5. Wysiany
materiał studenci zalewają podłożem ze skrobią zastosowaną jako jedyne źródło węgla.
Zestawienie przykładowych drobnoustrojów wymienionych w ćwiczeniu
Homofermentacja - ziarniaki z rodzaju: Streptococcus, Leuconostoc, pałeczki z rodzaju Lactobacillus,
laseczki z rodzaju Streptobacterium, Thermobacterium.
Heterofermentacja - Rodzaje: Betacoccus, Betabacterium
Rzekoma fermentacja mlekowa - bakterie z rodziny Enterobacteriaceae np. E. coli lub grzybów z klasy
Zygomycetes np. Mucor, Rhizopus.
Drobnoustroje gnilne mleka
Bakterie: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Proteus vulgaris, E. coli, Aerobacter aerogenes.
Drożdże: Saccharomyces i Zygosaccharomyces.
Grzyby: Mucor mucedo, Rhizopus nigricanes, Geotrichum candidum
Drobnoustroje kiszonek (I etap) E. coli i drożdże, bakterie heteromlekowe Leuconostoc mesenterioides, (II
etap) bakterie homofermentywne, Lactobacilus palantatum, pseudomlekowe Pediococcus ceravisae,
heterofermentatywne gatunki Lactobacillus brevis (III etap) grzyby Geotrichum candidum i drożdżaki
Drobnoustroje celulolityczne - bakterie tlenowe i beztlenowe, promieniowce, np. Streptomyces,
Streptosporangium, i grzyby, np. Cheatomium, Trichoderma.
Drobnoustroje amylolityczne - promieniowce z rodzaju Streptomyces, Nocardia, Micromonospora, grzyby z
rodzajów Aspergillus, Rhizopus, Fusarium, Penicyllium, a także bakterie tlenowe z rodzajów Bacillus,
Pseudomonas, Cytophaga i beztlenowe z rodzaju Clostridium.