Zasób informacji na temat białek organizmów zimnolubnych jest

Nr wniosku: 156740, nr raportu: 6337. Kierownik (z rap.): mgr inż. Natalia Maciejewska
Zasób informacji na temat białek organizmów zimnolubnych jest wyjątkowo ograniczony, zwłaszcza jeśli
weźmie się pod uwagę rozprzestrzenienie organizmów psychrofilnych w środowisku (około 85% biosfery
ziemskiej to psychrosfera o temperaturach poniżej 5˚C), m. in. ze względu na trudności w ich pozyskiwaniu.
Jak na razie znanych jest zaledwie kilkanaście struktur białek pochodzenia psychrofilnego. Białka
pochodzące z psychrofilnych mikroorganizmów charakteryzują się wysoką aktywnością w niskich
temperaturach. Do jednych z najbardziej pożądanych zimnolubnych produktów mikrobiologicznych należą
enzymy – nukleazy. Nukleazy są ważnymi narzędziami molekularnymi, należącymi do grupy hydrolaz,
degradującymi kwasy nukleinowe.
Obecnie w przemyśle stosowane są głównie enzymy pochodzące z drobnoustrojów mezofilnych lub
termofilnych, produkowane na drodze biosyntezy, która jest technicznie łatwa do przeprowadzenia z powodu
ich przystosowania do wzrostu w łagodnych warunkach temperaturowych. Aktualnie komercyjnie znane są
jedynie dwie nukleazy degradujące każdą formę kwasu nukleinowego. Są to nukleazy działające
w temperaturze powyżej 20ºC tj. Cryonase® (Topt=20ºC, Takara, Japonia) oraz Benzonaza® (Topt=37ºC,
Merck, USA).
Do tej pory nikt nie przedstawił otrzymywania i charakterystyki nukleaz organizmów psychrofilnych,
,dlatego jednym z zadań niniejszego projektu było ich otrzymanie oraz poznanie właściwości. Z puli ponad
1100 zsekwencjonowanych genomów bakteryjnych lub będących w trakcie sekwencjonowania wybrano trzy
psychrofilne mikroorganizmy: Desulfotalea psychrophila LSv54, Psychromonas ingrahamii 37 i Shewanella
violacea DSS12 zawierające w swoim genomie gen kodujący endonukleazę I. Zazwyczaj występuje
zależność pomiędzy optymalną temperaturą wzrostu danego mikroorganizmu, a temperaturą w której jego
enzymy osiągają maksymalną aktywność. Powyższe mikroorganizmy, zostały zatem wybrane ze względu na
ich zdolność wzrostu w temperaturze poniżej 20ºC.
Przedstawione w raporcie badania dotyczące otrzymania i charakterystyki nukleaz z organizmów
psychrofilnych są pionierskie w skali światowej. Po raz pierwszy wyizolowano geny endonukleazy
z Desulfotalea psychrophila LSv54, Psychromonas ingrahamii 37 i Shewanella violacea DSS12 oraz
skonstruowano systemy ekspresji tych genów w komórkach E. coli. Przeprowadzono dokładną
optymalizację otrzymywania natywnych, funkcjonalnych białek z wybranych w projekcie organizmów
zimnolubnych. Otrzymano w ten sposób dwa nieznane jeszcze w literaturze enzymy PinNuc i DpsNuc. Po
wykonaniu testów aktywności potwierdzono, że odkryte białka degradują kwasy nukleinowe. Dla białka
DpsNuc przeprowadzono pełną charakterystykę trawienia. Sprawdzono wydajność reakcji w zależności od
czasu reakcji, temperatury, warunków buforowych, obecności dwuwartościowych jonów metali. Zgodnie
z założeniami projektu enzymy są aktywne w temperaturze poniżej 20oC i degradują kwasy nukleinowe
o wiele szybciej niż dostępne komercyjnie nukleazy.
Wykorzystanie enzymów zaadoptowanych do zimna pozwala na zmniejszenie kosztów procesu
biotechnologicznego, dzięki obniżeniu zużycia energii. Ponadto unikalne cechy tych enzymów, czyli
aktywność w niskich temperaturach rozszerzają pulę ich aplikacji. W przypadku nukleaz jest to niezmiernie
istotne, gdyż pozwoli to na użycie ich w reakcji usuwania kwasów nukleinowych z temperaturo wrażliwych
preparatów. Jest to niezmiernie ważne ze względu na narzucone wytyczne prawne dotyczące zezwoleń na
dopuszczenie do obrotu preparatów leczniczych i żywieniowych, w których zawartość zanieczyszczeń
w postaci kwasów nukleinowych musi być niższa niż 100 pg w jednej dawce (wytyczne FDA ang. Food and
Drug Administration, USA). Innym potencjalnym zastosowaniem nukleaz jest obniżenie lepkości próbki
w bakteryjnych i drożdżowych ekstraktach bezkomórkowych oraz podwyższenie efektywności oczyszczania
białka docelowego, w tym również zwiększenie wydajności oczyszczania białek z ciałek inkluzyjnych, jak
również skrócenie całej metody. Opisywane nukleazy mogłyby również zostać wykorzystane do technik
bioanalitycznych m.in. w teście ELISA, w metodzie Western Blott, w elektroforezie dwukierunkowej (2D)
poprzez ułatwienie nanoszenia próbek i polepszenie rozdzielczości uzyskanych prążków (punktów) na
żelach poprzez obniżenie wpływu naładowanych fragmentów DNA.