Badanie procesów utleniania osocza krwi metodami relaksacyjnymi

Badanie procesów utleniania osocza krwi metodami relaksacyjnymi

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2011 • Volume 47 • Number 1 • 85-89
Praca oryginalna • Original Article
Badanie procesów utleniania osocza krwi metodami
relaksacyjnymi NMR
Investigation of oxydative processes of blood serum using NMR
relaxation methods
Lech W. Skórski, Bogdan Solnica1, Barbara Blicharska
Instytut Fizyki Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków, 1Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków
Streszczenie
W pracy przedstawiamy wyniki zastosowania metody relaksacyjnej do badania kinetyki procesów utleniania osocza krwi
króliczej i ludzkiej, zainicjowanych dodaniem do niego roztworu nadtlenku wodoru. Jako wprowadzające wykonane zostały
pomiary czasów relaksacji w wodnych roztworach nadtlenku wodoru w funkcji koncentracji H2O2. Interesującym jest fakt, że w
roztworach tych czasy relaksacji T2 i T1ρ zachowują się podobnie jak w roztworach jonów paramagnetycznych (np. jonów Fe2+
lub Cu2+), podczas gdy T1 w zasadzie nie zależy od koncentracji H2O2. Od momentu dodania roztworu H2O2 do osocza krwi,
które w naturalny sposób zawiera jony Fe2+ i Cu2+ oraz antyoksydanty, czasy relaksacji zaczynają się zmieniać. Na początku
czasy T1 i T2 szybko maleją i po osiągnięciu minimum zaczynają odrastać. Interpretację takiego zachowania oparliśmy na pomiarach czasowych zmian czasów relaksacji w roztworach jonów żelaza i miedzi, w roztworach albuminy oraz w osoczu krwi
króliczej po dodaniu antyoksydantów - witaminy C oraz glutationu. Pokazały one, że odrosty czasów relaksacji obserwowane
są jedynie w osoczu i są one zależne od koncentracji antyoksydantów. Uważamy, że zaprezentowana przez nas metoda relaksacyjna w pełni nadaje się do badań kinetyki procesów utleniania substancji biologicznych i być może okaże się przydatna
w diagnozowaniu niektórych chorób.
Summary
In this paper we present results of the relaxation method used to research oxidative kinetic processes in human and rabbit blood serum by adding hydrogen peroxide. As a first step, measurements of the relaxation times in aqueous hydrogen peroxide
solutions as a function of H2O2 concentration were done. It is interesting that in aqueous H2O2 solutions, T2 and T1ρ behavior
is similar to that obtained for paramagnetic ions like Fe2+ and Cu2+, while T1 is almost independent on H2O2 concentration up
to very high values. When H2O2 is added to blood serum, which naturally containing Fe2+ and Cu2+ ions and antioxidants, relaxation times start to change. At the beginning relaxation time T1 and T2 decreases rapidly and, after reaching its minimum, it
again starts to grow. The measurements of the relaxation time are helpful in the evaluation of the role of antioxidants like Vit.C
and glutathione. These antioxidants’ concentration dependence of relaxation behavior shows that the presence of these media
in a solution restrain the progress of oxidation.
Our results indicate that measurements of relaxation times may be used for the study of kinetics of oxidative processes in
biological liquids and, in the future, be helpful in the diagnosis of certain diseases.
Słowa kluczowe:procesy utleniania, osocze krwi, metody relaksacyjne NMR
Key words:Oxidative processes, blood serum, NMR relaxation methods
Wstęp
Dwutlenek wodoru H2O2 należy do aktywnych form tlenu
(ROS – reactive oxygen species), które inicjują procesy utleniania, będące reakcją chemiczną przenoszącą elektrony
z substancji utlenianej do czynnika utleniania. W ten sposób powstają tzw. wolne rodniki, które mają silne działanie
przeciwbakteryjne [1,9]. Własność tę wykorzystuje się powszechnie używając 3% wodnego roztworu H2O2, zwane-
go potocznie wodą utlenioną, do odkażania ran. Po polaniu rany i zetknięciu wody utlenionej z krwią obserwujemy
gwałtownie powstające pęcherzyki tlenu i tak zachodząca
reakcja, katalizowana przez jony ciężkich metali (Fe2+, Cu2+,
Co2+, Ti3+, Cr5+), nazywa się reakcją Habera-Fentona [8].
Wykonane przez nas wstępne pomiary pokazały, że
dodanie H2O2 do czystej wody zmienia wartości jej czasów relaksacji (ryc. 1.). Tym sposobem odkryliśmy
85
Badanie procesów utleniania osocza krwi metodami relaksacyjnymi NMR
możliwość wykorzystania metody relaksacyjnej NMR
do obserwacji kinetyki procesów utleniania. Jako materiał, którego składniki poddano utlenianiu, wybraliśmy
osocze krwi króliczej i ludzkiej badane in vitro. Wiadomo, że osocze krwi ludzkiej zawiera niewielkie ilości
jonów żelaza i miedzi (w ilości ok. 10-21 µmol/l i 11-24 µmol /l), i dlatego po dodaniu do niego dwutlenku wodoru zachodzi reakcja Fentona. W naszych eksperymentach mierzyliśmy, pojawiające się w czasie po zmieszaniu
osocza z roztworem H2O2, zmiany wartości czasów relaksacji spinowo-sieciowej T1 i spinowo-spinowej T2.
Mimo że procesy utleniania są aktualnie przedmiotem
licznych badań przeprowadzanych metodami fizyko-chemicznymi (w szczególności EPR), nadal pozostaje wiele
niewyjaśnionych pytań dotyczących ich kinetyki [5]. Dlatego uważamy, że zaprezentowana poniżej metoda badań
relaksacyjnych NMR, jako innowacyjna względem dotychczas używanych metod, może okazać się być bardzo użyteczną w praktyce.
Materiały i metody
Pomiary czasów relaksacji wykonano za pomocą spektrometru NMR firmy Bruker typu MINISPEC, pracującego w polu
magnetycznym 1.41 T (co odpowiada częstości rezonansu
protonowego 60 MHz). Czas relaksacji spinowo sieciowej T1
zmierzono metodą IR (Inversion Recovery), czas relaksacji
spinowo-spinowej T2 metodą ciągu ech CPMG, zaś czas relaksacji T1ρ w wirującym układzie współrzędnych za pomocą
specjalnej sekwencji (π/2-impuls podtrzymujący o długości
τ-FID) [6,10]. Pomiarom poddano wiele próbek osocza, zarówno króliczego, jak i ludzkiego. Każdy pomiar powtarzano
w co najmniej dwóch próbkach przygotowanych z tego samego osocza. Powtarzalność i dokładność pomiaru czasów
relaksacji wynosiła ok. ±2%. Pomiary wykonano w temperaturze +25°C, która stabilizowana była z dokładnością do ±1oC.
W badaniach używano nadtlenku wodoru w roztworze wodnym o stężeniu 30% (zakupionego w firmie Serva Aldrich)
oraz kupionej w aptece wody utlenionej (3% roztwór H2O2).
Osocze krwi króliczej sporządzono rozpuszczając liofilizat
ocenić, jak zmieniają się one w zależności od koncentracji
nadtlenku wodoru. Maksymalna koncentracja wodnego roztworu nadtlenku wodoru wynosiła tylko 30%, w większych
koncentracjach wodny roztwór H2O2 jest bowiem niedostępny jako substancja silnie wybuchowa po zetknięciu z jonami
żelaza lub miedzi.
Rycina 1. przedstawia zależność zmierzonych czasów relaksacji T1, T2 i T1ρ od koncentracji H2O2 dla jego roztworów
wodnych. Widać na nim, że o ile obecność H2O2 zaczyna
znacznie skracać czasy relaksacji T2 i T1ρ powyżej koncentracji wagowej 1%, to czas T1 w badanym zakresie pozostaje
praktycznie stały - zaczyna lekko rosnąć dopiero dla koncentracji ponad 10%. Przebieg zależności dla T2 i T1ρ przypomina zależności tych czasów relaksacji od koncentracji jonów
paramagnetycznych (np. w roztworach wodnych jonów Fe2+
i Cu) [4]. Ponieważ sama woda utleniona nie jest paramagnetyczna, skracanie czasu relaksacji może być tutaj spowodowane m.in. zmianami lepkości wody po dodaniu H2O2
[2,14]. Wiadomo także, że w wodnym roztworze H2O2 zachodzi szybka wymiana chemiczna jąder wodoru pomiędzy drobinami nadtlenku wodoru i wody [2]. Czas tej wymiany determinuje wartość T1, gdyż jest od niego znacznie krótszy i nie
pozwala protonom wody, zanim się wymienią, wyrelaksować
poprzez oddziaływanie dipolowe. Dlatego czas relaksacji T1
nie zmienia się wraz z koncentracją. Z drugiej strony, ten
sam czas wymiany jest dużo dłuższy względem czasów T2
i T1ρ i dlatego nie zaburza obserwowanej ich silnej zależności od stężenia H2O2. Zatem, w zależności od relacji między
czasem wymiany i czasami relaksacji, które związane są
z oddziaływaniami dipolowymi, mierzone wartości czasów
relaksacji zależą albo od odwrotności czasu korelacji (parametru dynamiki molekularnej), albo od czasu wymiany [2].
Po dodaniu do osocza dwutlenku wodoru w proporcji 1:10
mierzone czasy relaksacji zaczynają się zmieniać. Przykładowy przebieg czasowy zmian czasu relaksacji T1 pokazany
jest na rycinie 2 dla próbek osocza ludzkiego o różnej zawartości żelaza i miedzi. Podobne przebiegi obserwowali-
zakupiony w Wytwórni Surowic i Szczepionek w Krakowie
w wodzie dwukrotnie destylowanej i dejonizowanej. Próbki osocza krwi ludzkiej otrzymano z Zakładu Diagnostyki
Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie. Próbki te stanowiły
nadmiar osocza, w którym wcześniej oznaczono (metodą
fotometryczną) koncentrację żelaza i miedzi.
Do próbek osocza dodawano wody utlenionej w stosunku
wagowym 1:8 i 1:10 w zależności od przeprowadzanego
eksperymentu. Jako antyoksydantów używano czystej witaminy C oraz glutationu (firmy Serva) wówczas po dodaniu
ich do osocza proporcje wynosiły 1:1:8 (odpowiednio: roztworu 3% H2O2, roztworu antyoksydantu, osocza).
Wyniki i dyskusja
Jak już wspomniano wyżej, przed pomiarami w osoczu zmierzyliśmy czasy relaksacji dla wodnych roztworów H2O2 aby
86
Rycina 1.
Zależność czasów relaksacji T1 T2 i T1ρ od koncentracji H2O2 w roztworze wodnym w temperaturze 25º C.
L.W. Skórski, B. Solnica i B. Blicharska
cji zmierzone dla wielu próbek osocza o różnej ich koncentracji, nie znaleźliśmy żadnej regularności zmian.
W pierwszym dodatkowym eksperymencie dodaliśmy wody
utlenionej do wodnego roztworu FeSO4 (o koncentracji jonów Fe2+ równej 10-1 M) (ryc. 4.). Po zainicjowaniu reakcji
Fentona mierzony czas relaksacji ulegał szybkiemu skróceniu i po pewnym czasie stabilizował się. Dla takiej próbki nie
zaobserwowaliśmy odrostów.
Rycina 2.
Czasowe przebiegi zmian czasu relaksacji T1 po dodaniu wody utlenionej (w proporcji 1:10 wagowo) do próbek osocza krwi ludzkiej
o różnej zawartości żelaza i miedzi.
śmy, mierząc T2 [12]. Jak widać na rycinie 2, mierzony czas
relaksacji najpierw gwałtownie się skraca i po osiągnięciu
minimum (po ok. 5 minutach) zaczyna odrastać. Odrosty te
mają różny przebieg dla różnych próbek osocza.
Wyjaśnienie otrzymanej zależności czasowej, pokazanej na
rycinie. 2, rozpoczęliśmy od analizy czynników determinujących czas relaksacji spinowo-sieciowej osocza. Czynników
tych jest kilka, dlatego wartość zmierzonego T1, z powodu
różnego składu osocza (np. dla próbek osocza pochodzących od różnych osób), nie jest taka sama [15].
Najważniejszymi trzema czynnikami wpływającymi na wartość czasu relaksacji są:
–– obecność w osoczu szeregu białek (m.in. albumin) o różnym stężeniu,
–– obecność jonów paramagnetycznych (np. Fe2+, Cu2+),
–– obecność antyoksydantów.
Wykonane przez nas systematyczne pomiary pokazały, że
naturalnie występujące jony żelaza skracają liniowo czasy
relaksacji wraz ze wzrostem koncentracji jonów (ryc. 3). Jeśli
chodzi o jony miedzi, to dla nich, porównując czasy relaksa-
Rycina 3.
Wartości czasów relaksacji T1, T2 i T1ρ dla różnych próbek osocza
ludzkiego w funkcji koncentracji żelaza.
Rycina 4.
Czasowy przebieg zmian czasów relaksacji T1 po dodaniu wody utlenionej (w proporcji 1:10 wagowo) do roztworu jonów żelaza (10-1 M).
W następnym kroku wykonaliśmy czasowe pomiary T1 polegające na, podobnym jak wyżej, dodawaniu wody utlenionej
do 7% wodnego roztworu liofilizowanej albuminy krwi bydlęcej. Zaobserwowaliśmy, że zaraz po wymieszaniu, podobnie
jak dla roztworów jonów, czas relaksacji także ulega skróceniu,
a następnie stabilizacji. I tu też nie było widać odrostu (ryc. 5).
Doświadczenia te pokazały, że odrost czasu relaksacji obserwowany jest tylko dla osocza krwi i jest on, naszym zdaniem, wynikiem działania obronnych mechanizmów antyoksydacyjnych.
Aby sprawdzić słuszność tej hipotezy wykonaliśmy pomiary
czasowych zmian T1 w osoczu krwi króliczej (o koncentracji
Rycina 5.
Czasowy przebieg zmian czasów relaksacji T1 po dodaniu wody
utlenionej (w proporcji 1:10 wagowo) do wodnego roztworu albuminy o koncentracji 7%
87
Badanie procesów utleniania osocza krwi metodami relaksacyjnymi NMR
liofilizatu 10%) wzbogaconym antyoksydantami: witaminą C
i glutationem [3,11,7]. Przebiegi te, dla różnych stężeń witaminy C (w granicach od 6% do 16 % wagowo) pokazuje
ryc. 6. Podobne pomiary wykonano dla osocza króliczego
po dodaniu, użytego jako antyoksydant, roztworu glutationu
o trzech stężeniach (w granicach od 6% do 9% wagowo)
(ryc. 7). Analogiczne pomiary wykonano dla osocza krwi
ludzkiej [7].
Wyniki przedstawione na ryc. 6. i ryc. 7. pokazują, że obecność podwyższonej koncentracji antyoksydantów zmienia
przebieg czasowy zmian czasów relaksacji osocza zachodzących po dodaniu wody utlenionej. Widać, że wraz ze
wzrostem stężenia witaminy C (lub glutationu) maleje zarówno głębokość minimum, jak i wartość „ustabilizowanego”
czasu relaksacji. To skrócenie ustabilizowanej wartości spowodowane jest częściowo tym, że w roztworach wodnych
zarówno witamina C, jak i glutation, powodują także skrócenie czasów relaksacji [7].
Rycina. 6.
Czasowa zależność czasu relaksacji T1 surowicy krwi króliczej po
dodaniu wody utlenionej i wodnego roztworu witaminy C w czterech
różnych koncentracjach w proporcji 8:1:1 wagowo.
Rycina 7.
Czasowa zależność czasu relaksacji T1 dla roztworów osocza krwi
króliczej po dodaniu wody utlenionej i roztworu glutationu w czterech różnych koncentracjach w proporcji 8:1:1 wagowo.
88
Wnioski
Badania relaksacyjne NMR w układach biologicznych takich, jak osocze krwi, polegają na pomiarach czasów relaksacji protonów wody. Zachodzący, po zmieszaniu osocza
z roztworem H2O2, proces utleniania prowadzi, jak zaobserwowaliśmy, do zmian czasów relaksacji. Skracająca
się gwałtownie wartość czasu relaksacji T1 (podobnie jak
i T2) nie jest stabilna i, po osiągnięciu minimum, w dalszym
przebiegu odrasta ku wartości początkowej czasu relaksacji
otrzymanego dla czystego osocza. Z naszych dodatkowych
pomiarów wynika, że takie zachowanie się czasów relaksacji po dodaniu H2O2 jest charakterystyczne tylko dla osocza,
bowiem analogiczne badania przebiegów zmian czasu relaksacji T1 w wodnych roztworach jonów paramagnetycznych i w wodnych roztworach białek nie wykazują odrostów.
Dlatego uważamy, że odrost ten jest wynikiem działania
czynników antyoksydacyjnych obecnych w osoczu. Mogą
nimi być zarówno przeciwutleniacze (glutation, witamina C),
jak i enzymy, takie jak: katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa
i inne, których rolą jest zapobieganie destruktywnym procesom spowodowanym pojawieniem się wolnych rodników
[3,11,13].
Przeprowadzone przez nas pomiary wykazały, że metoda relaksacyjna NMR, jako nieinwazyjna i wystarczająco
szybka, nadaje się do obserwacji kinetyki przebiegu reakcji
Fentona oraz badania wpływu na nią rozmaitych czynników.
Ze względu na to, że pomiarów czasów relaksacji można
dokonywać in vivo za pomocą tomografów MR, otwiera ona
nowe możliwości prowadzenia badań procesów utleniania,
zachodzących nie tylko w osoczu krwi ex vivo, ale również w
tkankach żywych organizmów. Dodatkowym atutem metody
jest fakt, że badania te przeprowadziliśmy w niskim polu magnetycznym ok. 1.5 tesli, które jest najczęściej stosowane w
diagnostyce medycznej (MRI).
Piśmiennictwo
1. Bartosz G. Druga Twarz Tlenu. Wyd Naukowe PWN, Warszawa
2003.
2. Biljubasich L, Blumich B, Stapf S. Reaction monitoring of hydrogen peroxide decomposition by NMR relaxometry. Chemical
Engineering Science 2010; 65(4): 1394-1399.
3. Bilska A, Kryczyk A, Włodek L. Różne oblicza biologicznej roli
glutationu. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej. 2007;
61: 438–453.
4. Blicharska B, Witek M, Fornal M, Mackay AL. Estimation of
free copper ion concentation in blood serum using T1 relaxation
rates. J Magn Reson 2008; 194: 41-45.
5. Halliwell B, Gutteridge J. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochem J 1984; 219: 1-14.
6. Hausser K, Kalbitzer H. NMR w biologii i medycynie. Badania
strukturalne, tomografia, spektroskopia in vivo. Wyd. Naukowe
UAM, Poznań 1993.
7. Kamińska J. Wpływ antyoksydantów na procesy utleniania osocza krwi badane metodami relaksacyjnymi NMR. Praca magisterska IF UJ 2010.
8. Kehrer JP. The haber-weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology 2000; 149: 43-50.
L.W. Skórski, B. Solnica i B. Blicharska
9. Łuszczewski A, Matyska-Piekarska E, Trefler J i wsp. Reaktywne formy tlenu - znaczenie w fizjologii i stanach patologii organizmu. Reumatologia 2007; 45/5: 284-289.
10. Mc Brierty VJ, Packer KJ. Nuclear Magnetic Resonance in solid
polymers. Cambridge University Press, Cambridge 1993.
11. Naidu K A. Vitamin C in human health and disease is still a mystery? an overview. Nutrition Journal 2003; 2/7: 1-10.
12. Skórski L, Kobierski J, Blicharska B. Kinetyka reakcji Fentona w
osoczu krwi badana metodami relaksacyjnymi NMR. Materiały
Ogólnopolskiego Seminarium MRJ i jego zastosowań, Kraków
IFJ 2008.
13. Sroka Z, Gamian A, Cisowski W. Niskocząsteczkowe związki
przeciwutleniające pochodzenia naturalnego. Postępy Higieny i
Medycyny Doświadczalnej 2005; 59: 34-41.
14. Stephenson NA, Bell AT. Quantitative analysis of hydrogen peroxide by 1H NMR spectroscopy. Anal Bioanal Chem 2005; 381:
1290 -1293.
15. Zefirova TP, Glebov AN. Nuclear magnetic relaxation in biochemical analysis of plasma and serum. Plenum Publishing
Corporation 1993; 29: 958-959.
Adres do korespondencji:
Lech W. Skórski
Zakład Radiospektroskopii, Instytut Fizyki UJ
30 059 Kraków, ul. Reymonta 4
Tel. 12 663 5543
e-mail: [email protected]
Zaakceptowano do publikacji: 02.02.2011
89