COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0

Transkrypt

COBAS® AmpliPrep/COBAS®
TaqMan® HBV Test, version 2.0
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
HBV Test, v2.0
®
®
®
COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan
Wash Reagent
HBV V2.0
72 Tests
P/N: 04894570 190
PG WR
5.1 Liters
P/N: 03587797 190
ZASTOSOWANIE
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, wersja 2.0 (v2.0), jest testem in vitro opartym na
amplifikacji kwasu nukleinowego, służącym do ilościowego oznaczania DNA wirusa zapalenia wątroby
®
typu B (HBV) w ludzkim osoczu oraz surowicy, wykorzystującym aparat COBAS AmpliPrep do
automatycznego przetwarzania próbki oraz analizator COBAS® TaqMan® lub COBAS® TaqMan® 48 do
automatycznej amplifikacji i detekcji.
Test ten jest przenaczony do użycia jako pomoc w opiece klinicznej nad chorymi z przewlekłym
zakażeniem wirusem HBV, poddawanymi terapii przeciwwirusowej. Oznaczenie można zastosować
do zmierzenia wyjściowego poziomu DNA wirusa HBV oraz do powtórnego pomiaru podczas
leczenia, co pomaga w ocenie odpowiedzi chorego na leczenie. Wyniki uzyskane za pomocą testu
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, należy interpretować w kontekście wszystkich
istotnych objawów klinicznych oraz wyników badań laboratoryjnych.
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, nie jest przeznaczony do
przesiewowego badania na obecność wirusa HBV we krwi lub produktach krwiopochodnych
ani do stosowania jako test diagnostyczny, potwierdzający zakażenie wirusem HBV.
PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIE TESTU
Wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) jest jednym z szeregu wirusów o znanej zdolności
wywoływania wirusowego zapalenia wątroby. Przeszło dwa miliardy ludzi na całym świecie uległo
zakażeniu wirusem HBV, a pośród nich ponad 350 milionów osób to przewlekle zakażeni nosiciele1,2.
Przewlekli nosiciele wykazują podwyższone ryzyko odległych powikłań zakażenia, w tym
przewlekłego zapalenia i marskości wątroby oraz pierwotnego raka wątrobowokomórkowego3,4,5.
Markery serologiczne są powszechnie stosowane w roli diagnostycznych i/lub prognostycznych
wskaźników ostrego lub przewlekłego zakażenia wirusem HBV. Najczęściej stosowanym markerem
zakażenia wirusem HBV jest obecność jego antygenu powierzchniowego (HBsAg). Choć u nosicieli
może dochodzić do eliminacji antygenu HBsAg oraz do wytwarzania przeciwciał skierowanych
przeciwko niemu, okazuje się, że osoby te są obarczone ryzykiem rozwoju w późniejszym okresie
życia poważnych powikłań dotyczących wątroby6,7. Antygenu e wirusa HBV (HBeAg) używa się
zazwyczaj jako markera wtórnego, wskazującego na czynną replikację HBV związaną z postępującą
chorobą wątroby. Okazuje się, że niezdolność do eliminacji antygenu HBeAg zwiększa ryzyko
wystąpienia krańcowych stadiów rozwoju choroby wątroby8,9. Różne szczepy wirusa HBV mogą
wytwarzać antygen HBeAg niemożliwy do wykrycia w surowicy albo tracić zdolność produkcji HBeAg
nawet w obecności czynnej infekcji10. Zatem wykorzystywanie tego markera do monitorowania
postępu choroby może mieć ograniczoną użyteczność11. Według doniesień możliwość wykrycia DNA
wirusa HBV w surowicy posiada wartość prognostyczną, umożliwiającą rokowanie co do wyników
leczenia ostrych i przewlekłych zakażeń wirusem HBV12-15. Metoda ta może umożliwić wykrywanie
DNA wirusa HBV po eliminacji antygenu HBsAg16 lub wykrywanie HBV ubogiego w markery
serologiczne17. Jednak dotąd nie ustalono związku pomiędzy markerami serologicznymi
a poziomami DNA wirusa HBV. Skuteczność leczenia przeciwwirusowego, stosowanego
u pacjentów zakażonych wirusem HBV, można także oceniać na podstawie badania markerów
serologicznych lub pomiarów aktywności enzymów wątrobowych. Jednak za najbardziej bezpośredni
Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu.
05909813001-11PL
1
Doc Rev. 12.0
i rzetelny sposób pomiaru replikacji wirusa uważa się ilościową ocenę stężenia DNA HBV w surowicy
14,18-20
. Wykazano, że szybki i trwały spadek poziomów DNA wirusa HBV u pacjentów
lub osoczu
otrzymujących alfa-interferon, lamiwudynę, gancyklowir lub dipiwoksyl adefowiru jest czynnikiem
11,21-25
. Monitorowanie poziomów DNA wirusa HBV
predykcyjnym pomyślnego wyniku leczenia
pozwala przewidzieć rozwój jego oporności na lamiwudynę26. Zatem ilościowy test służący do
pomiaru stężenia DNA wirusa HBV jest cennym narzędziem, które można wykorzystywać
w połączeniu z badaniami innych markerów serologicznych podczas leczenia zakażenia HBV.
Ilościowe oznaczenie DNA wirusa HBV w osoczu i surowicy można przeprowadzić przy użyciu
technik amplifikacji kwasów nukleinowych, takich jak reakcja łańcuchowej polimerazy
27-29
. w teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV,
(ang. Polymerase Chain Reaction, PCR)
v2.0, wykorzystano technologię PCR do osiągnięcia maksymalnej czułości i dynamicznego zakresu
ilościowych oznaczeń DNA wirusa HBV w osoczu z dodatkiem EDTA jako antykoagulanta
i w surowicy.
ZASADY PROCEDURY
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, jest testem opartym na amplifikacji kwasu
nukleinowego, służącym do ilościowego oznaczania DNA wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV)
w ludzkim osoczu i surowicy. Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, jest oparty na
dwóch głównych procesach: (1) przygotowaniu próbki w celu wyizolowania DNA wirusa HBV oraz
27
docelowego DNA i detekcji rozszczepionej, podwójnie
(2) jednoczesnej amplifikacji PCR
znakowanej sondy oligonukleotydowej, swoistej dla łańcucha docelowego.
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, umożliwia automatyczne przygotowanie
próbki, a następnie automatyczną amplifikację PCR oraz detekcję docelowego DNA wirusa HBV
i DNA standardu ilościowego HBV (ang. Quantitation Standard, QS). Odczynnik Master Mix zawiera
pary primerów i sondy swoiste zarówno dla DNA wirusa HBV, jak i DNA standardu HBV QS.
Odczynnik Master Mix opracowano w celu zapewnienia równoważnego oznaczenia ilościowego
genotypów wirusa HBV od A do H. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje się przy użyciu
swoistych dla sekwencji docelowych oraz swoistych dla standardu QS, podwójnie znakowanych
sond oligonukleotydowych, umożliwiających niezależną identyfikację amplikonu wirusa HBV
i amplikonu standardu HBV QS.
Oznaczenie ilościowe DNA wirusa HBV wykonuje się za pomocą standardu HBV QS. Kompensuje
on wpływ hamowania oraz kontroluje proces przygotowywania i amplifikacji, pozwalając uzyskać
dokładniejsze oznaczenie ilościowe DNA wirusa HBV w każdej próbce. Jest to niezakaźny konstrukt
DNA, zawierający sekwencje wirusa HBV o identycznych miejscach wiązania primerów, jak
docelowe DNA HBV, a także charakterystyczne miejsce wiązania sondy, co umożliwia odróżnienie
amplikonu standardu HBV QS od amplikonu wirusa HBV.
Standard HBV QS jest dodawany do każdej próbki w znanej liczbie kopii i wraz z nią przechodzi
przez kolejne etapy procesu przygotowania oraz jednoczesnej amplifikacji PCR i detekcji
rozszczepionych, podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych. Analizator COBAS® TaqMan®
lub analizator COBAS® TaqMan® 48 oblicza stężenie DNA wirusa HBV w badanych próbkach przez
porównywanie sygnału HBV z sygnałem standardu HBV QS dla każdej próbki i kontroli.
Wybór sekwencji docelowej
Wyboru docelowej sekwencji DNA wirusa HBV dokonuje się w zależności od identyfikacji w obrębie
genomu HBV regionów wykazujących maksymalny konserwatyzm spośród różnych genotypów HBV.
Próbki DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS przygotowuje się przy użyciu techniki
wiązania kwasów nukleinowych na krzemionce, a jako primery w procesie amplifikacji DNA wirusa
HBV i DNA standardu HBV QS wykorzystywane są określone oligonukleotydy. Podwójnie
znakowane sondy oligonukleotydowe, swoiste dla sekwencji docelowej oraz swoiste dla standardu
QS, umożliwiają niezależną identyfikację amplikonów: wirusa HBV oraz standardu HBV QS. Wobec
tego właściwy wybór primerów oraz podwójnie znakowanej sondy oligonukleotydowej ma kluczowe
znaczenie dla zdolności testu do amplifikacji i detekcji genotypów wirusa HBV. w teście COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, w reakcji PCR wykorzystano trzy primery. Generująca
sygnał, podwójnie znakowana sonda ulega hybrydyzacji do nici komplementarnej i jest
05909813001-11PL
2
Doc Rev. 12.0
rozszczepiana przez polimerazę DNA Z05 podczas wydłużania primerów. Amplikon genotypów A–F
oraz H składa się z sekwencji 145 nukleotydów. Natomiast amplikon genotypu G składa się
z sekwencji 181 nukleotydów. Dodatkowe 36 zasad w obrębie jednoniciowego, wysoce
konserwatywnego regionu przedrdzeniowego/rdzeniowego genomu wirusa HBV skutkuje dłuższym
31
amplikonem w przypadku genotypu G .
Przygotowanie próbki
W teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, zastosowano automatyczne
przygotowywanie próbek w aparacie COBAS® AmpliPrep przy użyciu techniki wiązania kwasów
nukleinowych na krzemionce. w procedurze używana jest objętość 500 µl osocza lub surowicy.
Cząstki wirusa HBV zostają poddane lizie poprzez ich inkubację w podwyższonej temperaturze
z proteazą oraz chaotropowym buforem lizującym/wiążącym, który powoduje uwolnienie kwasów
nukleinowych i ochronę uwolnionego DNA HBV przed znajdującymi się w osoczu i surowicy
DNazami. Do każdej próbki wraz z odczynnikiem lizującym i szklanymi cząsteczkami magnetycznymi
wprowadzana jest proteaza oraz znana liczba cząsteczek DNA standardu HBV QS. Mieszanina
poddawane jest następnie inkubacji, a DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS ulegają
związaniu na powierzchni szklanych cząsteczek. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne
zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, ulegają usunięciu poprzez przepłukiwanie szklanych
cząsteczek magnetycznych. Po oddzieleniu cząsteczek szkła i zakończeniu procesu przepłukiwania
adsorbowane kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu przy użyciu roztworu wodnego w podwyższonej
temperaturze. Tak przygotowana próbka, zawierająca szklane cząsteczki magnetyczne oraz
uwolniony DNA wirusa HBV i DNA standardu HBV QS, jest dodawana do mieszaniny do amplifikacji
i umieszczana w analizatorze COBAS® TaqMan® lub analizatorze COBAS® TaqMan® 48.
Amplifikacja PCR
Reakcję amplifikacji PCR przeprowadza się z użyciem termostabilnego, rekombinowanego enzymu
polimerazy DNA Z05 Thermus specie (Z05). w obecności manganu (Mn2+) i w odpowiednich
warunkach układu buforowego Z05 wykazuje aktywność polimerazy DNA32,33. Umożliwia to
prowadzenie amplifikacji PCR równocześnie z detekcją amplikonu w czasie rzeczywistym.
Przetworzone próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (K-tube),
gdzie zachodzi amplifikacja PCR. w obecności jonów Mn2+ i przy nadmiarze trójfosforanów
dezoksyrybonukleotydów (ang. deoxynucleotide triphosphate, dNTP), do których należą trójfosforany
dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny, polimeraza DNA Z05
wydłuża przyłączone w wyniku hybrydyzacji primery, tworząc nić DNA.
Amplifikacja sekwencji docelowej
Zainstalowany w analizatorze COBAS® TaqMan® lub analizatorze COBAS® TaqMan® 48 termocykler
podgrzewa mieszaninę reakcyjną w celu denaturacji dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji
docelowych swoistych dla primerów w obrębie kolistego fragmentu genomu DNA wirusa HBV oraz
DNA standardu HBV QS. Podczas schładzania mieszaniny primery hybrydyzują do DNA docelowego.
Termostabilna polimeraza DNA Thermus specie Z05 (Z05) w obecności jonów Mn2+ oraz nadmiaru
trójfosforanów
dezoksynukleotydów
(dNTP),
do
których
należą:
dezoksyadenozyna,
dezoksyguanozyna, dezoksycytydyna i dezoksyurydyna (zamiast tymidyny), wydłuża przyłączone
w wyniku hybrydyzacji primery wzdłuż docelowej matrycy, tworząc dwuniciową cząsteczkę DNA,
zwaną amplikonem. Analizator COBAS® TaqMan® lub analizator COBAS® TaqMan® 48
automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich zmierzając
do podwojenia ilości amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana w analizatorze
COBAS® TaqMan® lub analizatorze COBAS® TaqMan® 48. Amplifikacja zachodzi wyłącznie
w regionie genomu wirusa HBV, znajdującym się pomiędzy primerami; cały genom HBV nie ulega
zwielokrotnieniu.
05909813001-11PL
3
Doc Rev. 12.0
Amplifikacja wybiórcza
W teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, amplifikację wybiórczą docelowego
kwasu nukleinowego z próbki osiąga się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-Nglikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dUTP). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje
niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę34, lecz nie łańcuchów DNA zawierających
dezoksytymidynę. w DNA występującym w naturze nie ma dezoksyurydyny, natomiast jest ona
zawsze obecna w amplikonie wskutek zastosowania trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego
spośród trójfosforanów dezoksyrybonukleotydu (dNTP) w odczynniku Master Mix. Dlatego dezoksyurydynę zawiera wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna warunkuje wrażliwość zanieczyszczającego
amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym
AmpErase niszczy także wszystkie nieswoiste produkty reakcji powstałe po wstępnej aktywacji
odczynnika Master Mix przez jony manganu. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix,
katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez
otwarcie łańcucha dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym
łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, gdzie znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób
wykluczając dalszą amplifikację DNA. Gdy enzym AmpErase zostanie wystawiony na działanie
temperatury powyżej 55°C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, ulega inaktywacji i dlatego
nie niszczy docelowego amplikonu, utworzonego w trakcie amplifikacji.
Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS® TaqMan®
W teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, wykorzystano technologię PCR27,28
w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR). Zastosowanie sond podwójnie znakowanych
barwnikiem fluorescencyjnym pozwala na detekcję w czasie rzeczywistym gromadzenia się produktu
reakcji PCR przez monitorowanie intensywności emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych,
uwalnianych w trakcie procesu amplifikacji. Sondy składają się z oligonukleotydów swoistych dla
HBV i standardu HBV QS, znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. w teście
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, sondy dla HBV i standardu HBV QS są
oznakowane różnymi fluorescencyjnymi barwnikami reporterowymi. Gdy sondy są nienaruszone,
fluorescencja barwnika reporterowego jest tłumiona bliskością wygaszacza, na zasadzie efektu
przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sonda ulega hybrydyzacji z sekwencją
docelową, a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez termostabilną polimerazę
DNA Z05 aktywności 5' → 3' nukleazy. Od chwili uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza
nie zachodzi już zjawisko wygaszania, a aktywność fluorescencyjna barwnika reporterowego nasila
się. Amplifikację DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS mierzy się niezależnie od siebie,
wykorzystując różne długości fal. Proces ten powtarza się przez określoną liczbę cykli, w każdym zaś
cyklu następuje efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych barwników
reporterowych, co umożliwia niezależną identyfikację DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV
QS. Cykl PCR, w którym krzywa wzrostu rozpoczyna wzrost wykładniczy, zależy od ilości materiału
startowego na początku reakcji PCR.
Podstawy oceny ilościowej w teście COBAS® TaqMan®
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, zapewnia dokładność wyników oznaczeń
ilościowych w bardzo szerokim zakresie dynamiki, ponieważ monitorowanie amplikonu
przeprowadza się w trakcie wykładniczej fazy amplifikacji. Im wyższe jest miano HBV w badanej
próbce, tym wcześniej fluorescencja barwnika reporterowego sondy HBV wzrasta powyżej
wyjściowego poziomu fluorescencji (patrz rysunek 1). Ponieważ ilość DNA standardu HBV QS jest
stała we wszystkich próbkach, fluorescencja barwnika reporterowego sondy HBV QS powinna
pojawiać się w każdej próbce w tym samym cyklu (patrz rysunek 2). w próbkach, w których
fluorescencja standardu QS jest nieprawidłowa, stężenie jest poddawane odpowiedniej modyfikacji.
Pojawienie się swoistych sygnałów fluorescencyjnych jest rejestrowane jako krytyczna wartość
progowa (Ct). Wartość Ct definiuje się jako liczbę cykli, po której fluorescencja barwnika
reporterowego przekracza ustaloną wcześniej wartość progową (ustalony poziom fluorescencji)
i zapoczątkowuje fazę wykładniczego wzrostu siły sygnału (patrz rysunek 3). Większa wartość Ct
wskazuje na niższe miano początkowe docelowego wirusa HBV. 2-krotny wzrost miana koreluje ze
zmniejszeniem wartości Ct docelowego DNA wirusa HBV o 1, natomiast 10-krotny wzrost miana
koreluje ze zmniejszeniem Ct o 3,3.
05909813001-11PL
4
Doc Rev. 12.0
Rysunek 1 przedstawia krzywe wzrostu sekwencji docelowej w serii rozcieńczeń, obejmującej
przedział 5-krotnej wartości log10. w miarę wzrostu stężenia wirusów krzywe wzrostu przesuwają się
w kierunku wcześniejszych cykli. Zatem krzywa wzrostu leżąca najdalej na lewo odzwierciedla
najwyższy poziom miana wirusa, a krzywa wzrostu leżąca najdalej na prawo oznacza najniższy
poziom miana wirusa.
Rysunek 1
Krzywe wzrostu sekwencji docelowej w serii rozcieńczeń wirusa
obejmującej zakres 5-krotnej wartości log10
9,00
Normalizowana fluorescencja
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
Miano najwyższe
3,00
2,00
1,00
Miano najniższe
0,00
-1,00
0
10
20
30
40
50
Liczba cykli
Rysunek 2 przedstawia krzywe wzrostu dla standardu Quantitation Standard w próbkach z serią
rozcieńczeń wirusa, obejmującą zakres 5-krotnej wartości log10. Ilość dodanego do każdej próbki
preparatu Quantitation Standard jest stała dla każdej reakcji. Wartość Ct dla preparatu Quantitation
Standard jest podobna, niezależnie od miana wirusa.
Rysunek 2
Krzywe wzrostu standardu oznaczenia w serii rozcieńczeń wirusa
obejmującej zakres 5-krotnej wartości log10
35,00
30,00
Miano najniższe
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
Miano najwyższe
0,00
-5,00
0
10
20
30
40
50
Liczba cykli
05909813001-11PL
5
Doc Rev. 12.0
Rysunek 3 przedstawia na przykładzie, w jaki sposób wartości fluorescencji w każdym cyklu są
normalizowane dla każdej krzywej wzrostu. Liczbę cykli cząstkowych (Ct) oblicza się w chwili, gdy
sygnał fluorescencyjny przekracza ustalony poziom fluorescencji.
Rysunek 3
Wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla każdej krzywej wzrostu
1
0,9
0,8
Wartość Ct = 27,1
Ustalony poziom
fluorescencji
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
-0,2
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
Liczba cykli
Ocena ilościowa stężenia DNA wirusa HBV
®
®
®
Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, służy do ilościowego oznaczania stężenia
DNA wirusa HBV, z wykorzystaniem drugiej sekwencji docelowej (preparat HBV Quantitation
Standard), którą w znanym stężeniu dodaje się do każdej próbki testowej. Standard HBV QS jest
niezakaźnym konstruktem DNA, zawierającym fragmenty sekwencji HBV z obszarami wiązania
primerów, które są identyczne z obszarami wiązania na docelowej sekwencji HBV. Standard HBV
QS zawiera miejsca wiązania primerów HBV i daje produkt amplifikacji o takiej samej długości
i składzie zasad jak w docelowym DNA wirusa HBV. Obszar wiązania sondy detekcyjnej w obrębie
standardu HBV QS został zmodyfikowany, aby umożliwić odróżnienie amplikonu HBV QS od
amplikonu docelowego wirusa HBV.
Podczas fazy hybrydyzacji reakcji PCR w analizatorze COBAS® TaqMan® lub analizatorze COBAS®
TaqMan® 48 próbki zostają oświetlone i wzbudzone światłem przefiltrowanym, a następnie rejestruje
się wyniki emisji przefiltrowanej fluorescencji każdej próbki. Odczyty dotyczące poszczególnych
próbek poddaje się korekcji w celu wyeliminowania zmienności wywołanej działaniem instrumentów.
Aparat wprowadza odczyty fluorescencji do programu AMPLILINK i zapisuje w bazie danych. Stosuje
się metodę odczytów wstępnych do określenia, czy DNA wirusa HBV oraz DNA standardu HBV QS
reprezentują zestawy, które można uznać za ważne; w sytuacji gdy dane nie mieszczą się
w ustalonych granicach, aparat opatruje je odpowiednimi oznaczeniami. Po ukończeniu i pomyślnej
ocenie wszystkich odczytów wstępnych odczyty fluorescencji są następnie przetwarzane w celu
obliczenia wartości Ct dla DNA wirusa HBV i DNA standardu HBV QS. Tablica swoistych dla danej
serii stałych kalibracji, dołączona do testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, jest
wykorzystywana do obliczania wartości miana próbek i kontroli na podstawie wartości Ct DNA wirusa
HBV oraz DNA standardu HBV QS. Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, jest
wystandaryzowany według międzynarodowego standardu WHO dla DNA wirusa zapalenia wątroby
typu B do oznaczeń opartych na technologii kwasów nukleinowych NAT (WHO International
Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology [NAT] Assays Testing)
(NIBSC 97/746)29, a wyniki miana są przedstawiane w jednostkach międzynarodowych (IU/ml).
05909813001-11PL
6
Doc Rev. 12.0
ODCZYNNIKI
®
®
®
(P/N: 04894570 190)
HBV V2.0
72 testy
HBV2 CS1
(Kaseta odczynników ze szklanymi cząsteczkami
magnetycznymi do oznaczeń HBV)
Szklane cząsteczki magnetyczne
93% izopropanol
1 x 72 testy
HBV2 CS2
(Kaseta odczynników lizujących do oznaczeń HBV)
Cytrynian sodu dwuwodny
42,5% tiocyjanian guanidyny
< 5% polidokanol
0,9% ditiotreitol
1 x 72 testy
1 x 78 ml
HBV2 CS3
Kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń HBV, zawierająca:
1 x 72 testy
1 x 7,0 ml
Pase
(Roztwór proteinazy)
Bufor Tris
< 0,05% EDTA
Chlorek wapnia
Octan wapnia
≤ 7,8% proteinaza
Glicerol
1 x 3,8 ml
EB, v2.0
(Bufor do elucji, v2.0)
Bufor Tris-base
0,2% metyloparaben
1 x 8,1 ml
HBV2 CS4
Kaseta odczynników swoistych dla testu do oznaczeń HBV, zawierająca:
HBV QS, v2.0
(Standard ilościowy HBV Quantitation Standard, v2.0)
Bufor Tris-HCl
EDTA
< 0,005% Poly rA RNA (syntetyczny)
< 0,001% niezakaźny, linearyzowany, dwuniciowy plazmid DNA,
zawierający wstawione sekwencje wiążące primer HBV
i unikatowy region wiążący sondę
0,05% azydek sodu
05909813001-11PL
7
1 x 72 testy
1 x 3,6 ml
Doc Rev. 12.0
HBV MMX, v2.0
(Odczynnik HBV Master Mix, v2.0)
Bufor Tricine
Octan potasu
Wodorotlenek potasu
0,09% azydek sodu
Glicerol
< 0,04% dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0,003% primery sensowne i antysensowne HBV
< 0,003% aptamer oligonukleotydowy
< 0,003% znakowane barwnikami fluorescencyjnymi sondy
oligonukleotydowe, swoiste dla HBV, oraz standard oznaczenia
HBV Quantitation Standard
< 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna)
< 0,1% enzym AmpErase (uracylo-N-glikozylaza) (bakteryjny)
2+
1 x 3,4 ml
1 x 19,8 ml
HBV Mn
(Roztwór manganu)
< 0,5% octan manganu
Kwas octowy lodowaty
0,09% azydek sodu
HBV H(+)C, v2.0
(Kontrola HBV wysoko dodatnia, v2.0)
< 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA zawierający
sekwencje HBV
Ujemne osocze ludzkie, niereaktywne w testach na obecność
przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2,
antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; RNA HIV-1, RNA HCV
i DNA HBV niewykrywalne przy użyciu metod PCR
®
0,1% substancja konserwująca ProClin 300
6 x 1,0 ml
HBV L(+)C, v2.0
(Kontrola HBV nisko dodatnia, v2.0)
< 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA zawierający
sekwencje HBV
®
0,1% substancja konserwująca ProClin 300
6 x 1,0 ml
CTM (–) C
[Kontrola ujemna COBAS® TaqMan® (osocze ludzkie)]
0,1% substancja konserwująca ProClin® 300
6 x 1,0 ml
HBV H(+)C, v2.0 Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV wysoko dodatniej, v2.0)
1 x 6 klipsy
HBV L(+)C, v2.0 Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV nisko dodatniej, v2.0)
1 x 6 klipsy
HBV (–) C Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV ujemnej)
1 x 6 klipsy
05909813001-11PL
8
Doc Rev. 12.0
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® Wash Reagent
Odczynnik płuczący COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
(P/N: 03587797 190)
PG WR
1 x 5,1 l
PG WR
®
®
®
(Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan )
Cytrynian sodu dwuwodny
< 0,1% N-metyloizotiazolon-HCl
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
A.
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
B.
Ten test służy do stosowania z ludzką surowicą lub osoczem ludzkim EDTA jako
antykoagulanta.
C.
Nie pipetować za pomocą ust.
D.
Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami
i odczynnikami z zestawów, stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz
odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami
testowymi.
E.
Przy pobieraniu materiałów z fiolek kontroli unikać skażenia odczynników bakteriami
lub rybonukleazą.
F.
Zaleca się używanie jałowych
niezawierających DNazy.
jednorazowych
pipet
oraz
końcówek
pipet
G.
Nie mieszać kontroli pochodzących z różnych serii lub różnych fiolek tej samej serii.
H.
Nie mieszać ze sobą kaset odczynników lub kontroli pochodzących z różnych zestawów.
I.
Nie otwierać kaset COBAS® AmpliPrep; nie wymieniać, nie mieszać, nie usuwać ani nie
dodawać butelek do kasety.
J.
Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
K.
Nie używać zestawu po upływie daty ważności.
L.
Karty charakterystyki (ang. Safety Data Sheet, SDS) są dostępne na żądanie w miejscowym
przedstawicielstwie firmy Roche.
M.
Z próbkami oraz kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując
bezpieczne procedury laboratoryjne, przedstawione w Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories35 oraz w CLSI Document M29-A336. Dokładnie oczyścić i odkazić
wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu
w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
Uwaga:
N.
Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn
sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku
1:10 pozwoli uzyskać 0,5% roztwór podchlorynu sodu.
PRZESTROGA: Odczynniki CTM (–) C, HBV L(+)C, v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0, zawierają
ludzkie osocze otrzymane z krwi ludzkiej. Materiał źródłowy został przebadany i uznany za
niereaktywny pod względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby
typu B (HBsAg), przeciwciał przeciwko HIV-1/2 oraz HCV, a także antygenu HIV p24. Badanie
ujemnego osocza ludzkiego (Negative Human Plasma) przy zastosowaniu metod PCR nie
05909813001-11PL
9
Doc Rev. 12.0
wykazało wykrywalnej obecności RNA wirusa HIV-1, RNA wirusa HCV ani DNA wirusa HBV.
Nie ma znanych metod testowych mogących zapewnić całkowitą pewność, że produkty
pochodzące z krwi ludzkiej nie przenoszą czynników zakaźnych. Dlatego każdy materiał
pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźny. z odczynnikami
CTM (–) C, HBV L(+)C, v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0, należy obchodzić się tak jak
z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne, takie jak przedstawione
35
w wytycznych Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories oraz w dokumencie
CLSI M29-A336. Dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie powierzchnie robocze świeżo
przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
O.
Odczynniki HBV QS, v2.0, HBV Mn2+ oraz HBV MMX, v2.0, zawierają azydek sodu. Azydek
sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi,
tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu przez
wylewanie ich do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody, aby zapobiec
gromadzeniu się azydków.
P.
Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy oraz fartuchów
laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą,
oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą ilością
wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. w razie rozlania
wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą.
Q.
Nie dopuszczać do kontaktu HBV2 CS2 i odpadów płynnych z aparatu COBAS® AmpliPrep,
zawierających tiocyjanian guanidyny, z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Takie
mieszaniny mogą spowodować powstanie silnie toksycznego gazu.
R.
®
Podczas utylizacji zużytych zestawów do przetwarzania próbek COBAS AmpliPrep Sample
Processing Units (SPU), zawierających tiocyjanian guanidyny, należy unikać ich kontaktu
z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Takie mieszaniny mogą spowodować
powstanie silnie toksycznego gazu.
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA
A.
Nie zamrażać odczynników ani kontroli.
B.
Odczynniki HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 oraz HBV2 CS4 przechowywać
w temperaturze 2–8°C. Nieużywane odczynniki zachowują stabilność do podanej daty
ważności. Po otwarciu odczynniki zachowują stabilność przez 63 dni w temperaturze 2–8°C
lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. Odczynniki HBV2 CS1,
HBV2 CS2, HBV2 CS3 oraz HBV2 CS4 można stosować maksymalnie przez łączny okres
64 godzin pracy w aparacie COBAS® AmpliPrep. Pomiędzy kolejnymi cyklami pracy
odczynniki należy przechowywać w temperaturze 2–8°C.
C.
Odczynniki HBV H(+)C, v2.0, HBV L(+)C, v2.0, oraz CTM (–) C należy przechowywać
w temperaturze 2–8°C. Kontrole te zachowują stabilność do upływu podanej daty ważności.
Po otwarciu opakowania niewykorzystane do badania odczynniki należy wyrzucić.
D.
Klipsy z kodem kreskowym [HBV H(+)C, v2.0 Clip, HBV L(+)C, v2.0 Clip oraz HBV (–) C
Clip] należy przechowywać w temperaturze 2–30°C.
E.
Odczynnik PG WR przechowywać w temperaturze 2–30°C. PG WR zachowuje stabilność do
upływu podanej daty ważności. Po otwarciu odczynnik zachowuje stabilność przez 28 dni
w temperaturze 2–30°C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej.
05909813001-11PL
10
Doc Rev. 12.0
MATERIAŁY DOSTARCZANE
A.
®
®
®
(P/N: 04894570 190)
HBV V2.0
HBV2 CS1
(Kaseta zawierająca szklane cząsteczki magnetyczne do oznaczeń HBV)
HBV2 CS2
(Kaseta odczynników lizujących do oznaczeń HBV)
HBV2 CS3
(Kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń HBV)
HBV2 CS4
(Kaseta odczynników swoistych dla testu do oznaczeń HBV)
HBV H(+)C, v2.0
(Kontrola HBV wysoko dodatnia, v2.0)
HBV L(+)C, v2.0
(Kontrola HBV nisko dodatnia, v2.0)
CTM (–) C
[Kontrola ujemna COBAS® TaqMan® (osocze ludzkie)]
HBV H(+)C, v2.0 Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV wysoko dodatniej, v2.0)
HBV L(+)C, v2.0 Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV nisko dodatniej, v2.0)
HBV (–) C Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli HBV ujemnej)
B.
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® Wash Reagent
Odczynnik płuczący COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
(P/N: 03587797 190)
PG WR
PG WR
(Odczynnik płuczący COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®)
05909813001-11PL
11
Doc Rev. 12.0
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
Aparatura i oprogramowanie
•
Aparat COBAS® AmpliPrep
•
Analizator COBAS® TaqMan® lub analizator COBAS® TaqMan® 48
•
Opcjonalnie: Stacja dokująca
•
Opcjonalnie: Aparat cobas p 630
•
Program AMPLILINK w wersji serii 3.2 lub serii 3.3
•
Stacja robocza z drukarką do programu AMPLILINK
•
Podręczniki programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 lub 3.3:
–
Instrukcja
obsługi
aparatu
COBAS®
AmpliPrep,
współpracującego
z analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48,
®
®
analizatorem COBAS AMPLICOR lub aparatem cobas p 630 oraz
programem AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3
–
Instrukcja obsługi analizatora COBAS® TaqMan® (z opcjonalną stacją dokującą)
do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3
–
Instrukcja obsługi analizatora COBAS® TaqMan® 48 do użytku z podręcznikiem
programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3
–
Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 do użytku z aparatem
COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48 i analizatorem COBAS® AMPLICOR®
–
Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem
COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48, analizatorem COBAS® AMPLICOR® i aparatem cobas p 630
–
Opcjonalnie: Podręcznik użytkownika aparatu cobas p 630, oprogramowanie
w wersji 2.2
lub
Materiały jednorazowe
•
Jednostki SPU (Sample Processing Unit)
•
Probówki wejściowe na próbki (ang. S-tube input) z klipsami z kodem kreskowym
•
Statywy z końcówkami K
•
Opakowanie zawierające probówki K 12 x 96
05909813001-11PL
12
Doc Rev. 12.0
INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
•
Statyw na próbki (statyw SK24)
•
Statyw na odczynnik
•
Statyw na SPU
•
Nośnik K
•
Transporter nośników K
•
Statyw na nośniki K
•
Pipetory z barierą aerozolową lub końcówkami
niezawierającymi DNazy (pojemność 1000 µl)*
•
Rękawice jednorazowe bezpudrowe
•
Mieszadło wibracyjne
dodatniego
wypierania
* Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. Tam gdzie jest to
wymagane, należy używać pozbawionych DNazy końcówek z barierą aerozolową lub końcówek
dodatniego wypierania w celu zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem.
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
Uwaga:
Ze wszystkimi próbkami i kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem
potencjalnie zakaźnym.
Uwaga:
Test ten został zatwierdzony do badania wyłącznie ludzkiej surowicy lub ludzkiego
osocza pobranego na EDTA jako antykoagulant. Badanie innych rodzajów próbek
może dawać nieprawidłowe wyniki.
A.
Pobieranie próbek
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, jest przeznaczony do stosowania
z próbkami osocza lub surowicy. Krew powinna być zbierana w probówkach do separacji surowicy
SST® lub w sterylnych probówkach z EDTA (lawendowa nakrętka) jako antykoagulantem.
Krew pełną należy przechowywać w temperaturze 2–25°C nie dłużej niż 24 godziny.
Oddzielić osocze lub surowicę od krwi pełnej w ciągu 24 godzin od pobrania, odwirowując próbkę
(800–1600 x g przez 20 minut) w temperaturze pokojowej (15–30°C). Przenieść osocze lub surowicę
do jałowej probówki polipropylenowej. Na rysunkach 4 i 5 przedstawiono dane dotyczące stabilności
próbek, pochodzące z badań nad stabilnością próbek, przeprowadzonych z użyciem testu COBAS®
®
®
AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0.
05909813001-11PL
13
Doc Rev. 12.0
Rysunek 4
Stabilność wirusa HBV we krwi pełnej
(przechowywanej w probówkach na osocze z dodatkiem EDTA)
Log10 miana (IU/ml)
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1
2
3
4
2-8°C <1 h
5
6
Próbka
25-30°C 24 h
7
8
9
10
2-8°C 24 h
Rysunek 5
Stabilność wirusa HBV we krwi pełnej
(przechowywanej w probówkach Serum Separator Tubes)
Log10 miana (IU/ml)
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1
2
3
4
2-8°C <1 h
B.
5
6
Próbka
25-30°C 24 h
7
8
9
10
2-8°C 24 h
Transport próbek
Transport krwi pełnej, osocza lub surowicy musi
federalnymi, państwowymi i lokalnymi dotyczącymi
pełną należy transportować w temperaturze 2–25°C
Osocze lub surowica mogą być transportowane
temperatury od –20°C do –80°C.
05909813001-11PL
14
przebiegać zgodnie z przepisami krajowymi,
transportu czynników etiologicznych37. Krew
i odwirować w ciągu 24 godzin od pobrania.
w temperaturze 2–8°C lub zamrożone do
Doc Rev. 12.0
C.
Przechowywanie próbek
Próbki osocza lub surowicy można przechowywać w temperaturze 25–30°C do 3 dni,
w temperaturze 2–8°C do 7 dni lub zamrożone w temperaturze od –20°C do –80°C co najmniej przez
sześć tygodni. Zaleca się przechowywać próbki w porcjach 800–900 µl w sterylnych,
polipropylenowych, zakręcanych probówkach o pojemności 2,0 ml (np. Sarstedt 72.694.006). Na
rysunkach 6 i 7 przedstawiono dane dotyczące stabilności próbek, pochodzące z badań nad
®
®
przechowywaniem próbek, przeprowadzonych z użyciem testu COBAS AmpliPrep/COBAS
TaqMan® HBV, v2.0.
Rysunek 6
Stabilność wirusa HBV w osoczu z dodatkiem EDTA
Log10 miana (IU/ml)
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
11
12
2-8°C, 2 h
13
14
15
16
Próbka
25-30°C, 3 dni
2-8°C, 7 dni
17
18
-20°C, 6 tyg.
19
20
-70°C, 6 tyg.
Rysunek 7
Stabilność wirusa HBV w surowicy
Log10 miana (IU/ml)
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
11
2-8°C, 2 h
05909813001-11PL
12
13
14
15
16
Próbka
25-30°C, 3 dni
2-8°C, 7 dni
15
17
18
-20°C, 6 tyg.
19
20
-70°C, 6 tyg.
Doc Rev. 12.0
Próbki osocza i surowicy można zamrażać i rozmrażać do pięciu razy bez utraty DNA wirusa HBV.
Na rysunkach 8 i 9 przedstawiono dane pochodzące z badań nad zamrażaniem i rozmrażaniem
®
®
®
próbek, przeprowadzonych z użyciem testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0
Rysunek 8
Wyniki oznaczania wirusa HBV po zastosowaniu do pięciu cykli zamrażania i rozmrażania
(Z-R) próbki (osocze z dodatkiem EDTA)
Log10 miana (IU/ml)
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Próbka
0x Zamrażanie/rozmrażanie
Rysunek 9
Wyniki oznaczania wirusa HBV po zastosowaniu
do pięciu cykli zamrażania i rozmrażania (Z-R) próbki (surowica)
Log10 miana (IU/ml)
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
21
22
23
24
25
26
Próbka
27
28
29
30
05909813001-11PL
16
Doc Rev. 12.0
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
Uwaga:
Szczegółowe instrukcje obsługi, szczegółowy opis możliwych konfiguracji,
drukowanych wyników oraz interpretacji znaczników, komentarzy i komunikatów
®
AmpliPrep,
błędów można znaleźć w (1) Podręczniku aparatu COBAS
współpracującego z analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48, analizatorem COBAS® AMPLICOR® lub aparatem cobas p 630 oraz
programem AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3; (2) Podręczniku obsługi analizatora
COBAS® TaqMan® (z opcjonalną stacją dokującą) do użytku z Podręcznikiem
programu AMPLILINK w wersji serii 3.2 i 3.3; (3) Podręczniku analizatora COBAS®
TaqMan® 48 do użytku z Podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.2
i 3.3; (4) Podręczniku programu AMPLILINK w wersji serii 3.2, współpracującego
z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem
COBAS® TaqMan® 48 i analizatorem COBAS® AMPLICOR®, lub Podręczniku
programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS® AmpliPrep,
analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48, analizatorem
COBAS® AMPLICOR® i aparatem cobas p 630; (5) Opcjonalnie: Podręcznik
użytkownika aparatu cobas p 630, oprogramowanie w wersji 2.2.
Wielkość serii
Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające do 72 testów, które można przeprowadzać
w seriach liczących 12–24 testów. Każda seria musi obejmować co najmniej jedną kontrolę
[CTM (–) C, HBV L(+)C, v2.0 oraz HBV H(+)C, v2.0] (patrz rozdział „Kontrola jakości”).
Przebieg pracy
Przebieg pracy analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS® TaqMan® 48 należy
rozpocząć w ciągu 120 minut od zakończenia przygotowywania próbki i kontroli.
Uwaga:
Przetworzonych próbek i kontroli nie zamrażać ani nie przechowywać.
Przygotowanie próbki i kontroli
Uwaga:
W przypadku stosowania próbek zamrożonych należy je pozostawić
w temperaturze pokojowej (15–30°C) do całkowitego rozmrożenia i przed użyciem
wymieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3–5 sekund. Przed użyciem należy
wyjąć kontrole z miejsca przechowywania o temperaturze 2–8°C i pozostawić do
ogrzania się do temperatury pokojowej.
®
Przygotowanie aparatu COBAS AmpliPrep
Część A. Konserwacja i płukanie
A1.
Aparat COBAS® AmpliPrep w trybie oczekiwania (stnad by) jest gotowy do pracy.
A2.
Włącz stację roboczą programu AMPLILINK za pomocą przycisku ON. Przygotuj stację
roboczą do pracy w następujący sposób:
a.
Zaloguj się do systemu operacyjnego Windows® XP.
b.
Dwukrotnie kliknij ikonę programu AMPLILINK.
c.
Zaloguj się do programu AMPLILINK, wprowadzając przydzielony identyfikator
użytkownika i hasło.
A3.
Skontroluj stan odczynnika PG WR na ekranie Status i w razie potrzeby wymień go.
A4.
Wykonaj wszystkie czynności konserwacyjne wyszczególnione w zakładce Due. Aparat
®
COBAS AmpliPrep automatycznie przepłucze system.
05909813001-11PL
17
Doc Rev. 12.0
Część B. Ładowanie kaset odczynników
Uwaga:
Wszystkie kasety odczynników należy wyjąć z miejsca przechowywania
®
o temperaturze 2–8°C, natychmiast załadować do aparatu COBAS AmpliPrep
i pozostawić do ogrzania się do temperatury pokojowej wewnątrz aparatu co
najmniej przez 30 minut przed rozpoczęciem przetwarzania pierwszej próbki. Nie
dopuszczać do ogrzania się kaset z odczynnikami do temperatury pokojowej poza
aparatem ze względu na możliwość skraplania pary na etykietach z kodem
kreskowym. w przypadku pojawienia się skroplonej pary nie ścierać jej z etykiet
z kodem kreskowym.
B1.
Umieść kasetę HBV2 CS1 w statywie na odczynniki. Umieść kasety HBV2 CS2, HBV2 CS3
i HBV2 CS4 w osobnym statywie na odczynniki.
B2.
Włóż statyw na odczynniki zawierający HBV2 CS1 na pozycję A w aparacie COBAS®
AmpliPrep.
B3.
Włóż statyw na odczynniki zawierający HBV2 CS2, HBV2 CS3 i HBV2 CS4 na pozycję B, C,
®
D lub E w aparacie COBAS AmpliPrep. (Dodatkowe informacje zamieszczono w tabeli 1.)
Część C. Ładowanie materiałów jednorazowych
Uwaga:
Określ liczbę potrzebnych kaset odczynników COBAS® AmpliPrep, jednostek SPU,
probówek wejściowych próbki (S-tube), końcówek K oraz probówek K. Każda
próbka lub kontrola wymaga użycia jednej jednostki SPU, jednej probówki
wejściowej S, jednej końcówki K i jednej probówki K.
Aparat COBAS® AmpliPrep, współpracujący z analizatorem COBAS® TaqMan® lub analizatorem
COBAS® TaqMan® 48, charakteryzuje się wieloma możliwościami ustawień przebiegu pracy.
Szczegółowe informacje – patrz tabela 1, poniżej. w zależności od wybranego ustawienia przebiegu
pracy załaduj odpowiednią liczbę statywów z kasetami odczynników, statywów na próbki
z probówkami wejściowymi S, statywów z jednostkami SPU, statywów z końcówkami K, statywów
z probówkami K oraz nośników K w statywach na nośniki K na odpowiednie pozycje w aparacie
®
COBAS AmpliPrep (dodatkowe informacje, patrz tabela 1).
C1.
Umieść jednostkę(-tki) SPU w statywie(-ach) i załaduj statyw(-y) na odpowiednie pozycje J, K
lub L w aparacie COBAS® AmpliPrep.
C2.
W zależności od wybranego ustawienia przebiegu pracy włóż pełny(-e) statyw(-y) probówek K
na pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS® AmpliPrep.
C3.
Załaduj pełny(-e) statyw(-y) z końcówkami K na pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS®
AmpliPrep.
C4.
®
®
W przypadku wybranego przebiegu pracy nr 3 analizatora COBAS TaqMan 48 włóż nośniki K
do statywu(-ów) na nośniki K w miejsca M & N lub O & P w aparacie COBAS® AmpliPrep.
05909813001-11PL
18
Doc Rev. 12.0
Tabela 1
®
Możliwości ustawień przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep
®
z analizatorem COBAS TaqMan® lub analizatorem COBAS® TaqMan® 48
Przebieg pracy
1
2
3
Aparat COBAS®
AmpliPrep
plus
stacja dokująca
plus
analizator
COBAS®
TaqMan®
Aparat COBAS®
AmpliPrep
plus
analizator
COBAS®
TaqMan®
Aparat COBAS®
AmpliPrep
plus
analizator
(analizatory)
COBAS®
TaqMan® 48
05909813001-11PL
Sposób przeniesienia
do analizatora
COBAS® TaqMan® lub
analizatora COBAS®
TaqMan® 48
Automatyczne
przenoszenie
nośnika K
Ręczne
przenoszenie
probówek K
w statywie(-ach)
na próbki do
analizatora
COBAS® TaqMan®
Ręczne
przenoszenie
nośnika K
za pomocą
statywu(-ów)
na nośniki K do
analizatora
COBAS®
TaqMan® 48
19
Statywy, zasobniki i materiały
jednorazowe
Probówki K w pełnych
statywach na probówki K
Końcówki K w pełnych
statywach na końcówki K
Probówki wejściowe S
zawierające próbki oraz
kontrole w statywach
na próbki
Jednostki SPU w statywach
na zestawy SPU
Odczynnik CS1 w statywie
na kasety
Odczynniki CS2, CS3, CS4
w statywie na kasety
Probówki K w pełnych
statywach na probówki K
na próbki
na zestawy SPU
na kasety
Po zakończeniu
przetwarzania próbki:
Probówki K w statywach
na próbki (gotowe do
przeniesienia ręcznego)
Probówki K w statywach
na próbki
na próbki
na zestawy SPU
na kasety
Puste nośniki K z kodem
kreskowym w statywie
na nośniki K
Po zakończeniu
przetwarzania próbki:
Probówki K w nośniku K
w statywie na zasobniki
Pozycja
w aparacie
COBAS®
AmpliPrep
M–P
M–P
F–H
J–L
A
B–E
M–P
M–P
F–H
J–L
A
B–E
Jak powyżej
(F–H)
F–H
M–P
F–H
J–L
A
B–E
M–P
Jak powyżej
(M–P)
Doc Rev. 12.0
Część D. Tworzenie zleceń i ładowanie próbek
D1.
Przygotuj statywy na próbki w sposób opisany poniżej. Do każdej pozycji statywu na próbki,
gdzie zostanie umieszczony materiał próbki (probówka S), przymocuj klips opatrzony etykietą
z kodem kreskowym. Do każdej pozycji statywu na próbki, gdzie zostanie umieszczony
materiał kontroli (probówka S), przymocuj odpowiedni klips opatrzony etykietą z kodem
kreskowym dla danej kontroli [CTM (–) C, HBV L(+)C, v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0]. CTM (–) C
należy umieścić w statywie na próbki za ostatnią próbką kliniczną lub kontrolą dodatnią
[HBV L(+)C, v2.0 lub HBV H(+)C, v2.0] w każdej serii 12–24 testów. Klipsy z kodami
kreskowymi dla kontroli powinny mieć takie same numery serii jak numery serii fiolek kontroli
w zestawie. Zwróć uwagę, aby odpowiednie kontrole umieścić na pozycjach z odpowiednim
klipsem z kodem kreskowym kontroli. Na każdej pozycji oznaczonej klipsem z kodem
kreskowym umieść jedną probówkę wejściową S.
D2.
Utwórz zlecenia dla poszczególnych próbek i kontroli przy pomocy programu AMPLILINK
w oknie Orders w zakładce Sample. Wybierz odpowiedni plik definicji testu i zakończ
procedurę poprzez zapisanie.
D3.
W oknie Orders w zakładce Sample Rack przypisz zlecenia dla próbek i kontroli do pozycji
statywów na próbki. Należy wprowadzić numer statywu na próbki dla statywu przygotowanego
w punkcie D1.
D4.
Wydrukuj raport Sample Rack Order, który będzie służyć jako arkusz roboczy.
D5.
Przygotuj statywy na próbki i kontrole w miejscu pracy wyznaczonym do dodawania próbek
i kontroli, jak opisano poniżej. Zworteksuj każdą próbkę i kontrolę [CTM (–) C, HBV L(+)C,
v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0] przez 3–5 sekund. Unikaj zanieczyszczenia rękawic podczas
manipulacji próbkami i kontrolami.
D6.
Przenieś 650 µl każdej próbki i kontroli [CTM (–) C, HBV L(+)C, v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0]
do odpowiedniej, oznaczonej kodem kreskowym probówki wejściowej S-tube za pomocą
mikropipetora z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnych od
DNazy. Unikaj przenoszenia cząstek stałych i/lub skrzepów fibrynowych z oryginalnej
próbki do probówki wejściowej S. Próbki i kontrole należy przenieść na pozycje probówek
zgodnie z przygotowanym i zapisanym w punkcie D4 arkuszem roboczym. Klipsy z kodami
kreskowymi dla kontroli powinny mieć takie same numery serii jak numery serii fiolek kontroli
w zestawie. Przypisz odpowiednie kontrole do właściwych pozycji z odpowiednim klipsem
z kodem kreskowym kontroli. Unikaj zanieczyszczenia górnej części probówek
S materiałem próbki lub kontroli.
D7.
W przypadku używania aparatu cobas p 630 informacje na temat przygotowywania próbek
można znaleźć w Podręczniku użytkownika aparatu cobas p 630.
D8.
W przypadku przebiegów pracy 1 i 2 (tab. 1) statyw(-y) na próbki, wypełnione probówkami
®
wejściowymi S, umieść na pozycjach F, G lub H w aparacie COBAS AmpliPrep.
D9.
W przypadku przebiegu pracy 3 (tab. 1) z użyciem analizatora COBAS® TaqMan® 48
statyw(-y) na próbki z probówkami wejściowymi S oraz probówkami K (po jednej dla każdej
z probówek wejściowych S, umieszczonej w odpowiedniej pozycji, sąsiadującej z probówkami
wejściowymi S) umieść na pozycjach F, G lub H w aparacie COBAS® AmpliPrep.
®
Część E. Rozpoczęcie przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep
E1.
Przy użyciu programu AMPLILINK uruchom aparat COBAS® AmpliPrep.
05909813001-11PL
20
Doc Rev. 12.0
®
Część F. Zakończenie przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep i transfer do analizatora
COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS® TaqMan® 48 (dotyczy wyłącznie
przebiegu pracy nr 2 i 3)
F1.
Sprawdź, czy nie pojawiły się oflagowania lub komunikaty o błędzie.
F2.
Usuń z aparatu COBAS® AmpliPrep przetworzone próbki i kontrole, znajdujące się
w statywach na próbki (w przypadku analizatora COBAS® TaqMan® bez stacji dokującej) lub
w statywach na nośniki K (w przypadku analizatora COBAS® TaqMan® 48), w zależności od
ustawienia przebiegu pracy (szczegółowe informacje przedstawiono w części G).
F3.
®
Usuń odpady z aparatu COBAS AmpliPrep.
Uwaga:
Przetworzonych próbek i kontroli po zakończeniu ich przygotowywania nie należy
wystawiać na działanie światła.
Amplifikacja i detekcja
Konfiguracja analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS® TaqMan® 48
Przebieg pracy analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS® TaqMan® 48 należy
rozpocząć w ciągu 120 minut od zakończenia przygotowywania próbki i kontroli w aparacie COBAS
AmpliPrep.
Uwaga:
Przetworzonych próbek i kontroli nie zamrażać ani nie przechowywać.
Część G. Ładowanie przetworzonych próbek
G1.
W zależności od wybranej konfiguracji przebiegu pracy aparatu wykonaj odpowiednie
czynności w celu przeniesienia probówek K do analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora
COBAS® TaqMan® 48.
Przebieg pracy 1:
Automatyczne przenoszenie nośnika K przez stację dokującą do
analizatora COBAS® TaqMan®. Interwencja ręczna jest niepotrzebna.
Przebieg pracy 2:
Ręczne przenoszenie probówek K w statywie(-ach) na próbki do
®
®
analizatora COBAS TaqMan .
Przebieg pracy 3:
Ręczne przenoszenie nośnika K w statywie(-ach) na nośniki K do
analizatora COBAS® TaqMan® 48. Ręczne przenoszenie nośników
K do analizatora COBAS® TaqMan® 48 przy użyciu transportera
nośników K.
Część H. Rozpoczęcie przebiegu pracy analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora
COBAS® TaqMan® 48
H1.
Uruchom analizator COBAS® TaqMan® lub analizator COBAS® TaqMan® 48 przy użyciu
jednej z poniższych opcji, zależnie od wybranych konfiguracji przebiegu pracy.
Przebieg pracy 1:
Nie ma potrzeby przeprowadzania żadnych operacji.
Przebieg pracy 2:
Automatyczny start pracy analizatora COBAS® TaqMan® po
załadowaniu statywu(-ów) na próbki.
Przebieg pracy 3:
Jeśli w nośniku K jest mniej niż 6 probówek K, wypełnij nośnik
pustymi probówkami K. Wypełnianiem steruje oprogramowanie
AMPLILINK. Otwórz pokrywę termocyklera, załaduj nośnik K
i zamknij pokrywę. Rozpocznij przebieg pracy analizatora COBAS®
TaqMan® 48.
05909813001-11PL
21
Doc Rev. 12.0
Część I.
®
Zakończenie przebiegu pracy analizatora COBAS
COBAS® TaqMan® 48
TaqMan® lub analizatora
I1.
Po zakończeniu przebiegu pracy analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS®
TaqMan® 48 wydrukuj raport wyników. Sprawdź, czy w raporcie wyników nie pojawiły się
oznaczenia lub komunikaty o błędzie. Próbki oflagowane i opatrzone komentarzami należy
interpretować zgodnie z opisem podanym w części „Wyniki”. Po zatwierdzeniu dane ulegają
archiwizacji.
I2.
Usuń zużyte probówki K z analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS®
TaqMan® 48.
WYNIKI
Analizatory COBAS® TaqMan® i COBAS® TaqMan® 48 automatycznie oznaczają stężenie DNA
wirusa HBV w próbkach i kontrolach. Stężenie DNA wirusa HBV wyraża się w IU/ml.
Współczynnik konwersji pomiędzy stężeniem HBV w kopiach/ml i stężeniem HBV w IU/ml
wynosi 5,82 kopii/IU wg międzynarodowego standardu WHO dla DNA wirusa zapalenia
wątroby typu B do oznaczeń opartych na technologii kwasów nukleinowych NAT
(WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology [NAT]
Assays Testing) (NIBSC 97/746)29.
W razie potrzeby wyniki można ręcznie przeliczać na kopie/ml, korzystając ze współczynnika
konwersji, w następujący sposób:
Stężenie DNA HBV w IU/ml x 5,82 kopii/IU = stężenie DNA HBV w kopiach/ml
Przykład: 1,23E+04 IU/ml x 5,82 kopii/IU = 7,16E+04 kopii/ml
Uwaga:
Zakres pomiaru analitycznego wartości oznaczanego parametru, który można
zmierzyć bezpośrednio za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
HBV, v2.0, bez jakiegokolwiek rozcieńczenia, wynosi od 20 do 1,7E+08 IU/ml.
Uwaga:
Klinicznie raportowany zakres wartości oznaczanego parametru, które można
zmierzyć bezpośrednio za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
HBV, v2.0, w próbce o maksymalnym rozcieńczeniu w stosunku jeden do dziesięciu,
wynosi od 20 do 1,7E+09 IU/ml.
Oprogramowanie AMPLILINK:
•
Określa wartość progową ilości cykli (Ct) dla DNA wirusa HBV oraz DNA standardu
HBV QS.
•
Określa stężenie DNA wirusa HBV na podstawie wartości Ct dla DNA HBV i DNA
standardu HBV QS oraz swoistych dla danej serii współczynników kalibracji zapisanych
w kodach kreskowych kasety.
•
Określa, czy obliczone i wyrażone w IU/ml wartości dla kontroli HBV L(+)C, v2.0, oraz
HBV H(+)C, v2.0, mieszczą się w określonych zakresach.
Walidacja serii testowej – program AMPLILINK w wersji serii 3.2
Sprawdź okno wyników programu AMPLILINK lub wydruk w poszukiwaniu oflagowań i komentarzy,
aby się upewnić, że dana seria testowa jest ważna. w przypadku zleceń dla kontroli sprawdza się
wartość IU/ml w celu określenia, czy mieści się ona w określonym zakresie. Jeśli wartość IU/ml dla
kontroli nie mieści się w odpowiednim zakresie, generowane jest OFLAGOWANIE sygnalizujące
nieprawidłowy wynik kontroli.
Seria testowa jest uważana za ważną, jeśli żadna z kontroli [HBV L(+)C, v2.0, HBV H(+)C, v2.0,
oraz CTM (–) C] nie została oflagowana.
05909813001-11PL
22
Doc Rev. 12.0
Seria testowa jest nieważna, jeżeli kontrole testu HBV zostały opatrzone którymkolwiek z poniższych
oflagowań.
Kontrola ujemna
Oflagowanie
_N_NC_INVALID
Wynik
Invalid
Interpretacja
Wynik nieważny albo „ważny”, lecz nie ujemny
pod względem obecności docelowego HBV
Kontrola HBV nisko dodatnia, v2.0
Oflagowanie
Wynik
Interpretacja
_L_LPCINVALID
<2.00E+01 IU/mL
Wynik kontroli poniżej zakresu wartości
_L_LPCINVALID
Target Not Detected
_L_LPCINVALID
Miano liczbowe
X.XXE+XX IU/mL
Wynik kontroli poza zakresem wartości
_L_LPCINVALID
> 1.70E+08 IU/mL
Wynik kontroli powyżej zakresu wartości
_L_LPCINVALID
Invalid
Wynik nieważny
Kontrola HBV wysoko dodatnia, v2.0
Oflagowanie
Wynik
Interpretacja
_H_HPCINVALID
<2.00E+01 IU/mL
_H_HPCINVALID
Target Not Detected
_H_HPCINVALID
Miano liczbowe
X.XXE+XX IU/mL
Wynik kontroli poza zakresem wartości
_H_HPCINVALID
> 1.70E+08 IU/mL
Wynik kontroli powyżej zakresu wartości
_H_HPCINVALID
Invalid
Wynik nieważny
Jeśli seria testowa jest nieważna, należy ją w całości powtórzyć, łącznie z przygotowaniem próbek
i kontroli oraz amplifikacją i detekcją.
Walidacja serii testowej– program AMPLILINK w wersji serii 3.3
Sprawdź okno wyników programu AMPLILINK lub wydruk w poszukiwaniu oznaczeń i komentarzy,
aby się upewnić, że dana seria testowa jest ważna. w przypadku zleceń dla próbek kontroli
przeprowadzana jest kontrola w celu określenia, czy wartość podana w IU/ml mieści się
w określonym przedziale. Jeśli wartość podana w IU/ml dla próbki kontroli nie mieści się
w odpowiednim przedziale, generowany jest ZNACZNIK sygnalizujący błąd kontroli.
Seria testowa jest uważana za ważną, jeśli żadna z kontroli [HBV L(+)C, v2.0; HBV H(+)C, v2.0
i CTM (–) C] nie została opatrzona znacznikiem błędu.
Seria testowa jest nieważna, jeżeli kontrole dla testu HBV zostały opatrzone którymkolwiek
z poniższych oznaczeń:
05909813001-11PL
23
Doc Rev. 12.0
Kontrola ujemna:
Oznaczenie
NC_INVALID
Wynik
Invalid
Interpretacja
Wynik nieważny albo „ważny”, lecz nie ujemny
pod względem obecności docelowego HBV
Próbka kontroli słabo dodatnia dla HBV, v2.0:
Oznaczenie
LPCINVALID
Wynik
Invalid
Interpretacja
Wynik nieważny lub kontrola poza zakresem
wartości
Próbka kontroli silnie dodatnia dla HBV, v2.0:
Oznaczenie
HPCINVALID
Wynik
Invalid
Interpretacja
Wynik nieważny lub kontrola poza zakresem
wartości
Jeśli seria testowa jest nieważna, należy ją w całości powtórzyć, łącznie z przygotowaniem próbek
i kontroli oraz amplifikacją i detekcją.
Interpretacja wyników
Jeśli seria testowa jest ważna, należy sprawdzić poszczególne próbki na wydruku z wynikami
w poszukiwaniu oflagowań lub komentarzy. Wyniki zinterpretuj następująco:
•
Ważna seria testowa może zawierać zarówno ważne, jak i nieważne próbki, zależnie
od tego, czy poszczególne próbki zostały opatrzone oznaczeniami i/lub komentarzami.
Wyniki badania próbek interpretuje się w następujący sposób:
Wynik (miano)
Interpretacja
Target Not Detected
Podać wynik: „Nie wykryto DNA wirusa HBV”.
<2.00E+01 IU/mL
Obliczone wartości IU/ml są poniżej granicy wykrywalności testu.
Podać wyniki: „Wykryto DNA wirusa HBV, stężenie mniejsze niż
20 IU DNA HBV/ml”.
≥ 2.00E+01 IU/mL
oraz ≤ 1.70E+08 IU/mL
Obliczone wyniki o wartości 20 IU/ml lub wyższej albo o wartości
1,70E+08 IU/ml lub niższej mieszczą się w zakresie liniowym testu.
> 1.70E+08 IU/mL
Obliczona wartość IU/ml przewyższa zakres testu. Podać wyniki:
„Powyżej 1,70E+08 IU DNA HBV/ml”. Jeśli pożądane są wyniki
ilościowe, oryginalną próbkę należy rozcieńczyć HBV-ujemną ludzką
surowicą lub osoczem z dodatkiem EDTA, w zależności od matrycy
oryginalnej, a następnie powtórzyć test. Otrzymany wynik należy
pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
Uwaga:
Próbki o wynikach powyżej zakresu wartości testu, dające wynik nieważny,
opatrzony oznaczeniem „QS_INVALID”, także nie powinny być opisywane jako
> 1,70E +08 IU/ml. Oryginalną próbkę należy rozcieńczyć HBV-ujemnym ludzkim
osoczem z dodatkiem EDTA, a następnie powtórzyć test. Otrzymany wynik należy
pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
Uwaga:
Wynik miana „Failed”. Interpretacja: w przypadku przygotowania próbki w aparacie
COBAS® AmpliPrep próbka nie jest przetwarzana właściwie.
Uwaga:
Wynik miana „Invalid”. Interpretacja: Wynik nieważny.
05909813001-11PL
24
Doc Rev. 12.0
KONTROLA JAKOŚCI
Każda seria testowa musi zawierać jedną kontrolę CTM (–) C, jedną kontrolę HBV L(+)C, v2.0 oraz
jedną kontrolę HBV H(+)C, v2.0. Seria jest ważna, jeśli żadna z kontroli: [HBV L(+)C, v2.0,
HBV H(+)C, v2.0 oraz CTM (–) C] nie została opatrzona znacznikiem błędu.
Nie ma wymagań dotyczących położenia kontroli dodatnich [HBV L(+)C, v2.0 i HBV H(+)C, v2.0]
w statywie na próbki. Natomiast CTM (–) C należy umieścić w statywie na próbki za ostatnią próbką
kliniczną lub kontrolą dodatnią [HBV L(+)C, v2.0 lub HBV H(+)C, v2.0] w każdej serii 12–24 testów.
Sprawdź, czy na wydruku znajdują się oznaczenia i komentarze, aby sie upewnić, że seria jest
ważna.
Kontrola ujemna
Kontrola CTM (–) C musi dawać wynik „Target Not Detected”. Jeśli kontrola CTM (–) C jest
oznaczona jako nieważna, to cała seria testowa jest także nieważna. Powtórz cały proces
(przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeśli wyniki kontroli CTM (–) C
w powtarzanych seriach są stale nieważne, skontaktuj się z miejscowym przedstawicielstwem firmy
Roche celem uzyskania pomocy technicznej.
Kontrole dodatnie
Stałe zakresy wartości miana kontroli HBV L(+)C, v2.0, oraz HBV H(+)C, v2.0, są zapisane
®
®
®
w kodach kreskowych kasety odczynników testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0.
Stężenia DNA wirusa HBV wyrażone w IU/ml w kontrolach HBV L(+)C, v2.0, i HBV H(+)C, v2.0,
powinny mieścić się w określonych zakresach wartości miana. Jeśli jedna lub obie kontrole dodatnie
są oznaczone jako nieważne, to cała seria testowa jest także nieważna. Powtórz cały proces
(przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeżeli miano DNA wirusa HBV dla jednej
lub obu kontroli dodatnich stale wykracza poza zakres wartości w powtarzanych seriach, skontaktuj
się z regionalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY
Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe
znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
OGRANICZENIA METODY
1.
Test ten został zatwierdzony do badania ludzkiej surowicy lub ludzkiego osocza pobranego na
EDTA jako antykoagulant. Badanie innych rodzajów próbek może dawać nieprawidłowe
wyniki.
2.
Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od właściwego pobrania próbki, transportu,
przechowywania oraz procedur przetwarzania.
3.
Obecność enzymu AmpErase w odczynniku COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV
Master Mix, v2.0 zmniejsza ryzyko skażenia amplikonu. Jednak zanieczyszczenia materiałem
pochodzącym z HBV-dodatnich kontroli i próbek klinicznych można uniknąć jedynie dzięki
stosowaniu zasad dobrej praktyki laboratoryjnej i uważnemu wykonywaniu procedur
opisanych w niniejszej ulotce, dołączonej do opakowania zestawu.
4.
Tego produktu powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach PCR.
5.
Produkt jest przeznaczony wyłącznie do użytku w aparacie COBAS® AmpliPrep oraz
analizatorze COBAS® TaqMan® lub analizatorze COBAS® TaqMan® 48.
05909813001-11PL
25
Doc Rev. 12.0
6.
Mutacje w obrębie wysoko konserwatywnego regionu genomu wirusa, z którym wiążą się
®
®
®
primery i/lub sonda, używane w teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0,
chociaż występują rzadko, mogą spowodować zaniżenie wyniku oznaczenia ilościowego
wirusa lub jego niewykrycie.
7.
Detekcja DNA HBV zależy od liczby obecnych w próbce cząstek wirusa, na którą wpływać
mogą metody pobierania próbek oraz czynniki związane z pacjentem (tj. wiek, obecność
objawów i/lub faza zakażenia).
8.
Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod
użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu
określenia ilościowych różnic występujących pomiędzy nimi.
SUBSTANCJE WPŁYWAJĄCE NA WYNIK TESTU
Udowodniono, że podwyższone poziomy triglicerydów, bilirubiny i albumin w próbkach nie zakłócają
oznaczenia ilościowego DNA HBV za pomocą tego testu. Wykazano, że podwyższone poziomy
hemoglobiny w próbkach do wartości stężenia 250 mg/dl nie zakłócają oznaczenia ilościowego DNA
HBV za pomocą tego testu.
Wykazano, że następujące związki lecznicze, przebadane przy 3-krotnym maksymalnym stężeniu
w osoczu (Cmax), nie zakłócają oznaczenia ilościowego DNA HBV za pomocą testu COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0:
Nukleotydowe inhibitory polimerazy DNA
Tenofowir
Dipiwoksyl adefowiru
Telbiwudyna
Nukleozydowe inhibitory odwrotnej
transkryptazy i polimerazy DNA
Lamiwudyna
Zidowudyna
Stawudyna
Abakawir
Didanozyna
Entekawir
Inhibitory proteazy HIV
Indinawir
Sakwinawir
Ritonawir
Amprenawir
Lopinawir/Ritonawir
Nienukleozydowe inhibitory odwrotnej
transkryptazy HIV
Newirapina
Efawirenz
Immunomodulatory
Interferon alfa-2a
Rybawiryna
Interferon alfa-2b
Peginterferon alfa-2a
Peginterferon alfa-2a + Rybawiryna
Interferon alfa-2b + Rybawiryna
Peginterferon alfa-2b
Leki przeciwdepresyjne
Chlorowodorek paroksetyny
Fluoksetyna
Sertralina
05909813001-11PL
Inhibitory fuzji HIV
Enfuwirtyd
Preparaty do leczenia zakażeń wirusami
opryszczki (Herpes)
Gancyklowir
Chlorowodorek walgancyklowiru
Acyklowir
26
Doc Rev. 12.0
OCENA SKUTECZNOŚCI W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
A.
Granica wykrywalności na podstawie międzynarodowego standardu WHO
®
®
®
Granicę wykrywalności testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, podczas
oznaczania DNA wirusa HBV określono przy użyciu rozcieńczeń wykonywanych według
międzynarodowego standardu WHO dla DNA wirusa zapalenia wątroby typu B do oznaczeń
opartych na technologii kwasów nukleinowych NAT (WHO International Standard for Hepatitis B
Virus DNA for Nucleic Acid Technology [NAT] Assays Testing) (NIBSC 97/746)29, w których
zastosowano genotyp A wirusa, rozpuszczony w HBV-ujemnym osoczu ludzkim z dodatkiem EDTA
albo w surowicy. w przypadku każdej z matrycy analizie poddano po trzy serie rozcieńczeń. Ogółem
przeprowadzono 72 równoległe oznaczenia na każde stężenie dla każdego typu matrycy.
Stężenie DNA wirusa HBV w osoczu z dodatkiem EDTA, jakie można oznaczyć z odsetkiem
wyników dodatnich powyżej 95%, określonym na podstawie analizy PROBITOWEJ, wynosi 9 IU/ml
(patrz tabela 2), w surowicy – 19 IU/ml (patrz tabela 3).
Tabela 2
®
®
®
Granica wykrywalności testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0 w osoczu
z dodatkiem EDTA na podstawie międzynarodowego standardu WHO
Nominalne stężenie
wyjściowe
(DNA HBV IU/ml)
30
20
10
5
2,5
PROBIT 95%
odsetka trafień
Liczba
powtórzeń
72
71
72
72
72
Liczba wyników
dodatnich
Odsetek wyników
dodatnich
72
71
68
63
38
9 IU/ml
(95% przedział ufności: 6,8–12,1 IU/ml)
100%
100%
94%
88%
53%
Tabela 3
Granica wykrywalności testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
w surowicy na podstawie międzynarodowego standardu WHO
Nominalne stężenie
wyjściowe
(DNA HBV IU/ml)
30
20
10
5
2,5
PROBIT 95%
odsetka trafień
05909813001-11PL
Liczba
powtórzeń
72
72
72
72
72
Liczba wyników
dodatnich
Odsetek wyników
dodatnich
72
100%
70
97%
58
81%
29
40%
24
33%
19 IU/ml
(95% przedział ufności: 11,0–107,1 IU/ml)
27
Doc Rev. 12.0
B.
Granica wykrywalności wszystkich genotypów wirusa w próbkach pochodzenia
klinicznego
®
Dodatkowo analizie z wykorzystaniem dwóch serii zestawów odczynników testu COBAS
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0 poddano rozcieńczenia próbek klinicznych w HBVujemnym ludzkim osoczu lub surowicy z dodatkiem EDTA o genotypach A–F i H oraz dwa
oznaczone ilościowo i oczyszczone DNA plazmidów – jeden dla genotypu G i jeden dla wirusa
z mutacją w regionie poprzedzającym gen kodujący białko rdzeniowe. Zbadano dwadzieścia cztery
powtórzenia dla każdego stężenia, genotypu, matrycy i serii zestawu.
Stężenie HBV DNA, które może zostać wykryte z odsetkiem trafień powyżej 95%, jak wskazuje
analiza PROBITOWA, łącznie z obydwoma matrycami, wynosi 16,4 IU/ml (patrz tabela 4).
Tabela 4
Granica wykrywalności testu
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0 przy użyciu
genotypów wirusa A–H oraz wirusa z mutacją w regionie poprzedzającym gen kodujący białko
rdzeniowe w osoczu z dodatkiem EDTA i w surowicy
Genotyp
A
B
C
D
E
F
G
H
Wirus
z mutacją
w regionie
poprzedzającym
gen kodujący
białko
rdzeniowe
*
Osocze
Stężenie dla
95% odsetka
trafień analizy
PROBITOWEJ,
seria 1
10,6
Stężenie dla
95% odsetka
trafień analizy
PROBITOWEJ,
seria 2
<5*
Surowica
Osocze
Surowica
Osocze
10,4
5,6
5,8
5,8
5,5
5,3
16,4
5,8
Surowica
Osocze
Surowica
Osocze
14,8
5,9
5,6
13,1
10,9
10,4
9,8
6,1
Surowica
Osocze
6,3
4,9
15,7
5,8
Surowica
Osocze
6,0
12,3
5,9
5,9
Surowica
Osocze
5,8
9,8
11,6
5,5
Surowica
Osocze
11,6
10,4
11,2
11,2
Matryca
Surowica
5,8
Stężenie dla
95% odsetka
trafień analizy
PROBITOWEJ
(maks.)
95% przedział
ufności
analizy
PROBITOWEJ
10,6
4,6–37,7
16,4
12,0–28,6
14,8
10,4–28,7
10,4
7,0–24,1
15,7
10,7–33,4
6,0
**
12,3
8,6–24,3
11,6
6,9–30,3
12,2
9,1–22,2
12,2
Ze względu na 100% odsetek trafień dla wszystkich poziomów stężeń nie można wykonać analizy
PROBITOWEJ i określić 95% przedziału ufności w serii 2.
** Ze względu na 100% odsetek trafień dla wszystkich poziomów rozcieńczenia nie można obliczyć
95% przedziału ufności na podstawie analizy PROBITOWEJ.
05909813001-11PL
28
Doc Rev. 12.0
Uwaga: Stężenia roztworu podstawowego dla wszystkich testowanych próbek określono za
®
pomocą bracketingu kalibratora (ISO 11095:1996) z użyciem testu COBAS
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0.
W celu uniknięcia możliwych błędów stężenia próbek klinicznych o genotypach A–F i H
zweryfikowano za pomocą jednego lub kilku z poniższych testów: test Abbott RealTime
HBV, test Siemens VERSANT HBV DNA 3.0 oraz test COBAS® TaqMan® HBV do
stosowania w systemie o wysokiej czystości. Obserwowane miana przedstawiono pod
postacią maksymalnego odchylenia oznaczenia ilościowego ≤ 0,3 log10. Stężenia dla
dwóch plazmidów obejmujących regiony docelowe dla genotypu G i wirusa z mutacją
w regionie poprzedzającym gen kodujący białko rdzeniowe zweryfikowano za pomocą
metody PicoGreen®, a dokładność przypisanej wartości miana przedstawiono
w specjalnym badaniu porównawczym.
C.
Dokładność
Dokładność testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, określono na podstawie analizy
seryjnych rozcieńczeń próbek pochodzenia klinicznego zawierających HBV (genotyp A),
sporządzonych przy użyciu HBV-ujemnego osocza ludzkiego z dodatkiem EDTA oraz surowicy.
Oznaczenie miana próbek pochodzenia klinicznego (stężeń roztworu podstawowego)
przeprowadzono metodą gwarantującą zgodność z międzynarodowym standardem WHO dla DNA
wirusa zapalenia wątroby typu B do oznaczeń opartych na technologii kwasów nukleinowych NAT
(WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology [NAT] Assays
Testing) (NIBSC 97/746)29. Wykonano 15 przebiegów testowych na każdej matrycy, przy czym każdy
obejmował 6 poziomów rozcieńczeń i 3 powtórzenia na każdym poziomie. Każda próbka
®
®
®
przechodziła przez całą procedurę testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0,
obejmującą przygotowanie próbki, amplifikację i detekcję. Dlatego podana dokładność odzwierciedla
wszystkie aspekty procedury badawczej. Badanie przeprowadzono przy użyciu trzech serii
odczynników testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0. Wyniki przedstawiono
w tabeli 5 (osocze z dodatkiem EDTA) oraz tabeli 6 (surowica).
Tabela 5
Dokładność testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
(próbki osocza z dodatkiem EDTA)
Miano
(IU/ml)
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
Seria nr 1
Seria nr 2
Seria nr 3
Całkowite
Całkowite
Całkowite
Całkowity
odchylenie Całkowity % odchylenie Całkowity % odchylenie
%
standardowe współczynnik standardowe współczynnik standardowe
współczynnik
wariancji
(SD)
wariancji
(SD)
(SD)
wariancji
w skali
(CV)
w skali
(CV)
w skali
(CV)
logarytmicznej
logarytmicznej
logarytmicznej
26
0,12
28
0,13
25
0,11
17
0,07
17
0,07
20
0,09
12
0,05
11
0,05
14
0,06
8
0,04
8
0,04
13
0,06
11
0,05
11
0,05
12
0,05
14
0,06
12
0,06
18
0,08
05909813001-11PL
29
Doc Rev. 12.0
Tabela 6
®
®
®
Dokładność testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0
(próbki surowicy)
Seria nr 1
Seria nr 2
Seria nr 3
Całkowite
Całkowite
Całkowite
Całkowity
Całkowity
Całkowity
odchylenie
odchylenie
odchylenie
%
%
%
standardowe
standardowe
standardowe
współczynnik
współczynnik
współczynnik
(SD)
(SD)
(SD)
wariancji
wariancji
wariancji
w skali
w skali
w skali
(CV)
(CV)
(CV)
logarytmicznej
logarytmicznej
logarytmicznej
27
0,13
22
0,11
28
0,13
13
0,06
15
0,06
17
0,08
11
0,05
10
0,04
14
0,06
10
0,04
12
0,05
11
0,05
11
0,05
12
0,05
11
0,05
15
0,07
15
0,07
13
0,06
Miano
(IU/ml)
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
D.
Zakres liniowości
®
®
Jak przedstawiono na rysunku 10 i rysunku 11, stwierdzono, że test COBAS AmpliPrep/COBAS
TaqMan® HBV, v2.0, wykazuje liniowość w zakresie stężenia od 20 (Log10 = 1,30) IU DNA HBV/ml
do 1,7E+08 (Log10 = 8,23) IU DNA HBV/ml, zarówno w osoczu z dodatkiem EDTA, jak i w surowicy.
Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi CLSI Guideline EP6-A, z użyciem dwóch
serii odczynników testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, oraz seryjnych
rozcieńczeń dodatniej próbki osocza z dodatkiem EDTA lub surowicy o wysokiej wartości miana DNA
HBV. Zbadano trzynaście poziomów stężeń w osoczu z dodatkiem EDTA i dwanaście poziomów
w surowicy przy 10 powtórzeniach na każdy poziom.
Rysunek 10
Liniowość testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0,
przy badaniu próbek osocza z dodatkiem EDTA
Wyniki testu
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Log10 (HBV DNA IU/ml)
10
9
8
7
6
5
Średnia
4
3
2
y = 1,0183x - 0,0182
1
2
R = 0,9987
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Stężenie nominalne
05909813001-11PL
30
Doc Rev. 12.0
Wyniki testu
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
Rysunek 11
®
®
®
Liniowość testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0,
przy badaniu próbek surowicy
9
8
7
6
5
Średnia
4
3
2
y = 1,0202x - 0,1142
1
2
R = 0,9987
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
E.
Ocena ilościowa miana poszczególnych genotypów
Do chwili obecnej zaproponowano osiem kategorii genotypu wirusa HBV na podstawie dywergencji
nukleotydów w obrębie genomu przekraczającej 8%38,39,40. Genotypy te zostały oznaczone wielkimi
literami alfabetu od A do H. Genotypy wirusa HBV wykazują charakterystyczną dystrybucję
geograficzną41.
Skuteczność testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, w ocenie genotypów wirusa
HBV zbadano na podstawie analizy 25 oczyszczonych, linearyzowanych, oznaczonych ilościowo
plazmidów DNA zawierających reprezentatywne sekwencje wstawkowe genotypów HBV od A do H
oraz najczęstszą mutację przedrdzeniową (patrz tabela 7). Oznaczenie nominalnych stężeń
roztworów podstawowych plazmidów przeprowadzono metodą PicoGreen. Każdy plazmid DNA
został rozcieńczony do uzyskania stężeń nominalnych o wartościach wynoszących w przybliżeniu
3,00E+03, 3,00E+05 i 3,00E+07 kopii PicoGreen/ml, zarówno w osoczu z dodatkiem EDTA, jak
i w surowicy. Następnie ustalono stężenia (IU/ml) za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
TaqMan® HBV, v2.0, z użyciem dwóch serii odczynników i porównano wyniki oznaczania wszystkich
badanych plazmidów.
Badanie wszystkich 25 plazmidów analizowanych za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
TaqMan® HBV, v2.0, wykazuje równoważne wyniki oznaczania ilościowego wszystkich plazmidów
i genotypów, zarówno w osoczu z dodatkiem EDTA, jak i w surowicy.
05909813001-11PL
31
Doc Rev. 12.0
Tabela 7
Badanie reprezentatywności przy użyciu testu
®
COBAS AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
– badanie typowanych plazmidów DNA
Oznaczenie plazmidu
p8423-c1
p1115-c1
p3952-c1
p4199-c2
p1764-c1
p1767-c1
p3958-c1
p830-c1
p3982-c1
p1786-c1
p11549-1
p3872-c1
p1103-c1
p3953-c2
p18-c1
p30893-5
p4244-c1
p3217-c1
p3963-c2
p9203-c1
p479-c1
p1009-c1
p00042975-4
pEFHBV20
pITmut1896
Genotyp
A
B
C
D
E
F
G
H
Mutacja przedrdzeniowa
Pochodzenie próbki źródłowej
Indie
Burundi
Kamerun
Norwegia
Chiny
Chiny
Wschodnia Azja
Wyspy Towarzystwa
Wietnam
Chiny
Bangladesz
Iran
Tunezja
Północna Afryka
Szwecja
Szwecja
Dania
Senegal
Nigeria
Kolumbia
Wenezuela
Hiszpania
Stany Zjednoczone
Nikaragua
Włochy
Ponadto wykazano reprezentatywność w całym zakresie liniowym w przypadku ośmiu
z wymienionych plazmidów, reprezentujących wszystkie genotypy (rysunki 12 i 13). w przypadku
każdego plazmidu zbadano trzy poziomy stężeń w osoczu z dodatkiem EDTA i w surowicy przy
10 powtórzeniach na każdy poziom.
05909813001-11PL
32
Doc Rev. 12.0
Rysunek 12
®
®
®
Skuteczność testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0,
przy badaniu genotypów wirusa HBV od A do H w próbkach osocza z dodatkiem EDTA
0,4
0,3
Genotyp A
Odchylenie
0,2
Genotyp B
0,1
Genotyp C
Genotyp D
Genotyp E
Genotyp F
Genotyp G
Genotyp H
+/- 0,3 log
0,0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
2,5
3,5
4,5
5,5
6,5
7,5
Rysunek 13
Skuteczność testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0,
przy badaniu genotypów wirusa HBV od A do H w próbkach surowicy
0,4
0,3
Genotyp A
Odchylenie
0,2
Genotyp B
0,1
Genotyp C
Genotyp D
Genotyp E
Genotyp F
Genotyp G
Genotyp H
+/- 0,3 log
0,0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
2,5
3,5
4,5
5,5
6,5
7,5
05909813001-11PL
33
Doc Rev. 12.0
F.
Swoistość kliniczna
®
®
®
Swoistość testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, określono na podstawie analizy
HBV-ujemnych próbek osocza z dodatkiem EDTA oraz surowicy, pobranych od krwiodawców.
Łącznie zbadano 647 poszczególnych próbek osocza z dodatkiem EDTA oraz 649 próbek surowicy.
Wszystkie próbki wykazały ujemny wynik testu w kierunku DNA wirusa HBV. Na podstawie tych
wyników swoistość testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, wynosi 100% z granicą
przedziału ufności na poziomie 99,54%.
G.
Reaktywność krzyżowa
Swoistość analityczną testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, zbadano przez
dodanie hodowanych mikroorganizmów (wirusów, bakterii, drożdżaków) lub DNA (HTLV-2,
2,5E+07 kopii/PCR) do HBV-ujemnego osocza z dodatkiem EDTA (patrz tabela 8).
Żaden z badanych mikroorganizmów innych niż wirus HBV nie wykazywał dodatniego wyniku testu
w kierunku DNA HBV.
Tabela 8
Próbki użyte do oceny swoistości analitycznej
Wirus
Adenowirus typ 5
Wirus cytomegalii
Wirus Epsteina-Barr
Ludzki wirus opryszczki typu 6
Wirus opryszczki zwykłej typu 1
Wirus opryszczki zwykłej typu 2
Ludzki wirus T-limfotropowy typu 1
Ludzki wirus T-limfotropowy typu 2
Wirus grypy typu A
Wirus zapalenia wątroby typu A
Wirus zapalenia wątroby typu C
Ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1)
05909813001-11PL
34
Bakteria
Staphylococcus aureus
Propionibacterium acnes
Drożdżak
Candida albicans
Doc Rev. 12.0
H.
Korelacja wyników badania osocza z dodatkiem EDTA i surowicy
®
®
®
Korelację wyników oznaczania za pomocą testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0,
zbadano na podstawie analizy HBV-dodatnich, dobranych próbek osocza z dodatkiem EDTA oraz
surowicy; były to próbki pochodzenia klinicznego. Analizie poddano 279 dobranych zestawów próbek
pochodzących od pacjentów zakażonych wirusem HBV. Wyniki oznaczeń za pomocą testu COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, w próbkach osocza z dodatkiem EDTA oraz surowicy
wykazały wysoki stopień korelacji (rysunek 14).
Rysunek 14
Korelacja wyników oznaczeń za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/
COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, w próbkach osocza z dodatkiem EDTA i surowicy,
pobranych od pacjentów zakażonych wirusem HBV (n=279)
9
8
Próbka surowicy (Log10 miana)
7
y = 0,9834x + 0,0073
R2 = 0,9915
6
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Próbka osocza z EDTA (Log10 miana)
05909813001-11PL
35
Doc Rev. 12.0
9
I.
®
®
®
Skuteczność testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, w porównaniu
z testem COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV
Skuteczność testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0, porównano z testem COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV30 na podstawie analizy HBV-dodatnich (≥ 54 IU/ml) próbek
pochodzenia klinicznego. Próbki osocza z dodatkiem EDTA, pozostałe po przeprowadzeniu
rutynowej diagnostyki, przeanalizowano w dwóch zewnętrznych ośrodkach. Wartości miana
w próbkach były rozłożone w całym zakresie dynamicznym testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
TaqMan® HBV, v2.0. Analizę regresji liniowej przeprowadzono na 275 ważnych próbkach
(143 zbadano w pierwszym ośrodku, a 132 – w drugim) (rysunek 15).
Rysunek 15
Korelacja wyników oznaczeń za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0,
oraz testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV w próbkach osocza z dodatkiem EDTA,
Log10 miana DNA HBV
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0
9,00
8,00
7,00
6,00
y = 0,9958x + 0,0443
R 2 = 0,9743
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Log10 miana DNA HBV
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV
05909813001-11PL
36
Doc Rev. 12.0
J.
Korelacja metody
®
®
®
®
Skuteczność testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0, porównano z testem COBAS
TaqMan® HBV do użytku z zestawem High Pure System (HPS HBV, rysunki 16 i 17), testem
®
®
®
®
COBAS AMPLICOR HBV MONITOR (COBAS AMPLICOR HBV, rysunki 18 i 19) oraz testem
VERSANT HBV DNA 3.0 Assay (rysunki 20 i 21) metodą analizy regresji z użyciem
nierozcieńczonych próbek o znanym charakterze klinicznym, pobranych od pacjentów zakażonych
wirusem HBV. Próbki uzyskano od firmy Teragenix (Fort Lauderdale, FL, USA). Analizę regresji
przeprowadzono dla próbek surowicy i osocza z dodatkiem EDTA, których wyniki oznaczania
mieściły się w zakresie liniowym.
Rysunek 16
Korelacja wyników oznaczeń za pomocą testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HBV, v2.0,
oraz testu COBAS® TaqMan® HBV do użytku z zestawem High Pure System w próbkach
osocza z dodatkiem EDTA, pobranych od pacjentów zakażonych wirusem HBV (n=146)
Próbka osocza (Log10 miana)
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
Y = 0,974 * X + 0,107
2
R = 0,964
1,0
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
High Pure System HBV
05909813001-11PL
37
Doc Rev. 12.0
Rysunek 17
®
®
®
Korelacja wyników oznaczeń za pomocą testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV, v2.0,
®
®
oraz testu COBAS TaqMan HBV do użytku z zestawem High Pure System w próbkach
surowicy, pobranych od pacjentów zakażonych wirusem HBV (n=142)
10
9
8
7
6
5
4
3
2
Y = 0,983 * X + 0,046
r2 = 0,972
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
High Pure System
Próbka surowicy (log10 miana)
05909813001-11PL
38
Doc Rev. 12.0
Rysunek 18
®
®
®
®
®
oraz testu COBAS AMPLICOR HBV MONITOR w próbkach osocza z dodatkiem EDTA,
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
Y = 0,899 * X + 0,546
R 2 = 0,872
0,5
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
COBAS® AMPLICOR® HBV
05909813001-11PL
39
Doc Rev. 12.0
Rysunek 19
®
®
®
®
®
oraz testu COBAS AMPLICOR HBV MONITOR w próbkach surowicy, pobranych od
pacjentów zakażonych wirusem HBV (n=154)
6
5
4
3
2
1
Y = 0,911 * X + 0,461
2
R = 0,821
0
0
1
2
3
4
5
6
COBAS® AMPLICOR® HBV
05909813001-11PL
40
Doc Rev. 12.0
Rysunek 20
®
®
®
oraz testu VERSANT HBV DNA 3.0 Assay w próbkach osocza z dodatkiem EDTA, pobranych
od pacjentów zakażonych wirusem HBV (n=138)
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
Y = 0,892 * X + 0,260
R 2 = 0,810
1,0
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
VERSANT HBV DNA 3.0 Assay
05909813001-11PL
41
Doc Rev. 12.0
Rysunek 21
®
®
®
oraz testu VERSANT HBV DNA 3.0 Assay w próbkach surowicy, pobranych od pacjentów
zakażonych wirusem HBV (n=138)
8
7
6
5
4
3
2
Y = 0,913 * X + 0,125
R 2 = 0,837
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
VERSANT HBV DNA 3.0 Assay
05909813001-11PL
42
Doc Rev. 12.0
PIŚMIENNICTWO
1.
Lee, W. 1997. Hepatitis B Virus Infection. New England Journal of Medicine. 337:1733-1745.
2.
http://www.who.int/csr/disease/hepatitis/HepatitisB_whocdscsrlyo2002_2.pdf.
3.
Beasley, R.P. 1988. Hepatitis B virus - the major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer.
61:1942-1956.
4.
Wong, D.H.K., Cheung, A.M., O'Rourke, K., et al. 1993. Effect of alpha-interferon treatment in
patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis. Annals of
Internal Medicine. 119:312-323.
5.
Zuckerman, A.J. and Lavanchy, D. 1999. Treatment options for chronic hepatitis: antivirals
look promising. British Medical Journal. 319:799-800.
6.
McMahon, B.J. 1998. Chronic carriers of Hepatitis B Virus who clear hepatitis B surface
antigen: Are they really "off the hook"? Hepatology. 28:265-267.
7.
Huo, T., Wu, J., Lee, P. et al. 1998. Sero-clearance of hepatitis b surface antigen in chronic
carriers does not necessarily imply a good prognosis. Hepatology 28:231-236.
8.
Niederau, C., Heintges, T., Lange, S. et al. 1996. Long-term follow-up of HBeAg-positive
patients treated with interferon alfa for chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine.
334:1422-1427.
9.
Fattovich, G., Giustina, G., Realdi, G. et al. 1997. Long term outcome of hepatitis B e antigenpositive patients with compensated cirrhosis treated with interferon alfa. Hepatology.
26:1338-1342.
10.
Brown, J.L., Carman, W.F. and Thomas, H.C. 1992. The clinical significance of molecular
variation within the hepatitis B virus genome. Hepatology. 15:144-148.
11.
Hoofnagle, J.H. 1990. Alfa-interferon therapy of chronic hepatitis B. Current status and
recommendations. Hepatology. 11:S100-S107.
12.
Krogsgaard, K., Kryger, P., Aldershvile, J. et al. 1985. Hepatitis B virus DNA in serum from
patients with acute hepatitis B. Hepatology. 5:10-13.
13.
Jardi, R., Buti, M., Rodriguez-Frias, F. et al. 1996. The value of quantitative detection of HBVDNA amplified by PCR in the study of hepatitis B infection. Journal of Hepatology. 24:680-685.
14.
Niitsuma, H., Ishii, M., Miura, M. et. al. 1997. Low-level hepatitis B viremia detected by
polymerase chain reaction accompanies the absence of HBe antigenemia and hepatitis in
hepatitis B virus carriers. American Journal of Gastroenterology. 92:119-123.
15.
Ranki, M., Schatzl, H.M., Zachoval, R. et al. 1995. Quantification of hepatitis B virus DNA over
a wide range from serum for studying viral replicative activity in response to treatment and in
recurrent infection. Hepatology. 21:1492-1499.
16.
Mason, A.L., Xu, L., Guo, L. et al. 1998. Molecular basis for persistent hepatitis B virus infection in
the liver after clearance of serum hepatitis B surface antigen. Hepatology. 27:1736-1742.
17.
Saito, T., Shinzawa, H., Uchida, T. et al. 1999. Quantitative DNA analysis of low-level hepatitis
B viremia in two patients with serologically negative chronic hepatitis B. Journal of Medical
Virology. 58:325-331.
18.
Brunetto, M.R., Oliveri, F., Rocca, G. et al. 1989. Natural course and response to interferon of
chronic hepatitis B accompanied by antibody to hepatitis B e antigen. Hepatology. 10:198-202.
19.
Saracco, G., Mazzella, G., Rosina, F. et al. 1989. A controlled trial of human lymphoblastoid
interferon in chronic hepatitis B in Italy. Hepatology. 10:336-341.
20.
Perrillo, R., Schiff, R., Davis, G. et al. 1990. A randomized controlled trial of interferon alpha2b alone and after prednisone withdrawal for the treatment of chronic hepatitis B. New
England Journal of Medicine. 323:295-301.
21.
Perez, V., Tanno, H., Villamil, F. et al. 1990. Recombinant interferon alfa-2b following
prednisone withdrawal in the treatment of chronic type B hepatitis. Hepatology. 11:S113-S117.
22.
Lai, C.-L., Ching, C.-K., Tung, S.K.-M. et al. 1997. Lamivudine is effective in suppressing
Hepatitis B Virus DNA in Chinese Hepatitis B surface antigen carriers: A placebo-controlled
trial. Hepatology. 25:241-244.
05909813001-11PL
43
Doc Rev. 12.0
23.
Nagata, I., Colucci, G., Gregorio, G.V. et al. 1999. The role of HBV DNA quantitative PCR in
monitoring the response to interferon treatment in chronic hepatitis B virus infection. Journal of
Hepatology. 30:965-969.
24.
Hadziyannis, S.J., Manesis, E.K., and Papakonstantinou, A. 1999. Oral ganciclovir treatment
in chronic hepatitis B virus infection: a pilot study. Journal of Hepatology. 31:210-214.
25.
Marcellin, P., Chang, T.-T., Lim, S.G. et al. 2003. Adefovir dipivoxil for the treatment of Hepatitis B
e antigen-positive chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 348:808-816.
26.
Puchhammer-Stockl, E., Mandl, C.W., Kletzmayr, J. et al. 2000. Monitoring the virus load can
predict the emergence of drug-resistant hepatitis B virus strains in renal transplant patients
during lamivudine therapy. Journal of Infectious Diseases. 181:2063-2066.
27.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and
detection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10:413-417.
28.
Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K., and Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR.
Genome Research 6:986-994.
29.
Saldanha, J., Gerlich, W., Lelie, N., Dawson, P., Heermann, K., Heath, A., and the WHO
Collaborative Study Group. 2001. An international collaborative study to establish a World
Health Organization international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification
techniques. Vox Sanguinis 80:63-71.
30.
Hochberger, S., Althof, D., Gallegos de Schrott, R., Nachbaur, N., Röck, H. and Leying, H.
2006. Fully automated quantitation of Hepatitis B virus (HBV) DNA in human plasma by the
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® System. Journal of Clinical Virology 35:373-380.
31.
Stuyver L, De Gendt S, Van Geyt C, Zoulim F, Fried M, Schinazi RF, Rossau R. 2000. A new
genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness. Journal of
General Virology 81:67-74.
32.
Smith, E.S., Li, A.K., Wang, A.M., Gelfand, D.H. and Myers, T.M. 2003. Amplification of RNA:
Hightemperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated
Thermostable DNA Polymerase. PCR Primer, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold
Spring Harbour Laboratory Press: Section 16.
33.
Meng, Q., Wong, C., Rangachari, A. et al. 2001. Automated Multiplex Assay System for
Simultaneous Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human
Immunodeficiency Virus Type 1 RNA. Journal of Clinical Microbiology. 39:2937-2945.
34.
Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control
carryover contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.
35.
Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
36.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers From
Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29A3 Wayne, PA:CLSI, 2005.
37.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000.
704 pp.
38.
Okamoto H, Tsuda F, Sakugawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, Mayumi M.
1988. Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface
antigen subtypes. Journal of General Virology 69:2575-2583.
39.
Norder H, Courouce AM, Coursaget P, Echevarria JM, Leef S-D, Mushahwar IK, Robertson
BH, Locarnini S, Magnius LO. 2004. Genetic Diversity of Hepatitis B Virus Strains Derived
Worldwide: Genotypes, Subgenotypes, and HBsAG Subtypes. Intervirology 47:289-309.
40.
Schaefer S. 2007. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J
Gastroenterol 13(1):14-21.
41.
Norder H, Hammas B, Lee SD, Bile K, Courouce AM, Mushahwar IK, Magnius LO. 1993. Genetic
relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the
primary structure of the surface antigen. Journal of General Virology 74: 1341-1348.
05909813001-11PL
44
Doc Rev. 12.0
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 11.0
06/2014
Usunięto symbol „Produkt niebezpieczny dla środowiska”.
Zaktualizowano opisy na stronie z ujednoliconymi symbolami, znajdującej się
na końcu ulotki dołączonej do opakowania.
Z oświadczenia dotyczącego znaków towarowych usunięto „ROCHE”.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z miejscowym
przedstawicielstwem firmy Roche.
Doc Rev. 12.0
03/2015
Z części ODCZYNNIKI usunięto symbole ostrzegające o niebezpieczeństwie,
hasła ostrzegawcze i kody.
Dodano symbol GTIN oraz jego opis na stronie z ujednoliconymi symbolami.
Zaktualizowano część dotyczącą znaków towarowych i patentów w celu
odzwierciedlenia tylko źródeł internetowych.
W razie jakichkolwiek pytań prosimy o kontakt z miejscowym
przedstawicielstwem firmy Roche.
05909813001-11PL
45
Doc Rev. 12.0
Roche Molecular Systems, Inc.
1080 US Highway 202 South
Branchburg, NJ 08876 USA
Distributed by
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Strasse 116
68305 Mannheim, Germany
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Roche Diagnostics, SL
Avda. Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877-273-3433)
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
Znaki towarowe i patenty
Patrz http://www.roche-diagnostics.us/patents
©2015 Roche Molecular Systems, Inc.
03/2015
Doc Rev. 12.0
05909813001-11PL
(05382874001-12ENGL)
05909813001-11
46
Doc Rev. 12.0
Na etykietach produktów diagnostycznych Roche PCR stosuje się obecnie
następujące oznaczenia.
Oprogramowanie pomocnicze
Wyrób do diagnostyki in vitro
Autoryzowany Przedstawiciel we
Wspólnocie Europejskiej
Dolna granica przypisanego
zakresu
Arkusz kodów kreskowych
Wytwórca
Kod partii
Przechowywać z dala od światła
SW
Zawartość wystarczająca na
Zagrożenie biologiczne
<n> testów
Numer katalogowy
Przestrzegać zakresu temperatury
Sprawdź w instrukcji obsługi
Plik definicji testów
TDF
Zawartość zestawu
Górna granica przypisanego
zakresu
Dystrybucja przez
Użyć przed
Wyłącznie do oceny działania
w badaniach IVD
Numer pozycji handlu globalnego
Ten produkt spełnia wymogi dyrektywy Wspólnoty Europejskiej 98/79/WE dotyczącej
diagnostycznych urządzeń medycznych do stosowania in vitro.
Linia pomocy technicznej dla klientów w Stanach Zjednoczonych 1-800-526-1247
05909813001-11PL
47
Doc Rev. 12.0

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0

Transkrypt

Podobne dokumenty

Zajęcia z zakresu profilaktyki zakażeń HBV i HCV

ISE Deproteinizer

Prace Polskiej Grupy Ekspertów HBV

Odcinek 42. Wirusowe zapalenie wątroby typu B – część I

Działalność Polskiej Grupy Ekspertów HBV

informacja dot programu wzw

KONTROLA WEWNĘTRZNA – RAPORT Pieczątka gabinetu DATA

Informacja o odczynnikach Analizatory, w których mogą być