Ćwiczenia X

Biochemia: Ćw. – Kwasy nukleinowe
KWASY NUKLEINOWE
Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:
amoniak
– C, N
azotan srebra
– C, N
błękit metylenowy
– Xn
chlorek żelaza
– Xn
difenyloamina
–T
etanol, 96%, 70%
–F
kwas azotowy(V),65% – C
kwas ortofosforowy
–C
kwas octowy, 96%
–C
kwas siarkowy, 95% – C
kwas solny
–C
wodorotlenek sodu
–C
siarczan dodecylu sodu – Xn
W komórkach organizmów eukariotycznych obecne są dwa typy kwasów nukleinowych:
- DNA (kwas deoksyrybonukleinowy, ang. deoxyribonucleic acid) zawiera cukier deoksyrybozę; przechowuje
informację genetyczną, występuje głównie w jądrze komórkowym, ponadto w mitochondriach i chloroplastach,
- RNA (kwas rybonukleinowy, ang. ribonucleic acid), w skład którego wchodzi ryboza; bierze udział w translacji
białek; obecny w cytoplazmie (rRNA – rybosomalny kwas rybonukleinowy, ang. ribosomal RNA i tRNA –
transportujący kwas rybonukleinowy, ang. transfer RNA) oraz mRNA (matrycowy/informacyjny kwas
rybonukleinowy, ang. messenger RNA) przenoszący informację o budowie białek z jądra do cytoplazmy.
Kwasy nukleinowe są biopolimerami nukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi w łańcuch
polinukleotydowy. Nukleotyd, stanowiący jednostkę monomeryczną DNA i RNA, składa się z cząsteczki cukru,
zasady azotowej (purynowej: adeniny, guaniny lub pirymidynowej: cytozyny, tyminy, uracylu) oraz reszty
fosforanowej (Rys. 1).
ortofosforan
zasada
azotowa
cukier
Rys. 1. Struktura rybonukleotydu.
Nukleotydy to monofosforany nukleozydów. W tabeli 1 zebrano nazwy nukleozydów i nukleotydów. W organizmie
człowieka nukleotydy są składnikami kwasów nukleinowych, jak również występują w postaci wolnej, pełniąc
szereg ważnych funkcji w przemianach metabolicznych.
Tab. 1. Nomenklatura nukleozydów i nukleotydów kwasów nukleinowych.
* tymidyna występuje wyłącznie w DNA, więc zwyczajowo nie dodaje się przedrostka deoksy
zasady azotowe
pirymidyny
puryny
nazwa
symbol
nukleotydy
nazwy nukleozydów
nazwa
symbol
adenina
A
(deoksy)adenozyna
(deoksy)adenozynomonofosforan
(d)AMP
guanina
G
(deoksy)guanozyna
(deoksy)guanozynomonofosforan
(d)GMP
cytozyna
C
(deoksy)cytydyna
(deoksy)cytydynomonofosforan
(d)CMP
tymina
T
tymidyna *
tymidynomonofosforan *
TMP *
uracyl
U
urydyna
urydynomonofosforan
UMP
1
Biochemia: Ćw. – Kwasy nukleinowe
1. BADANIE WŁAŚCIWOŚCI KWASÓW NUKLEINOWYCH
1.1. ROZPUSZCZALNOŚĆ KWASÓW NUKLEINOWYCH
Kwasy nukleinowe, dzięki zawartości reszt kwasu fosforowego, wykazują odczyn kwasowy. Rozpuszczają się
dobrze w środowisku zasadowym, trudniej w wodzie i rozcieńczonych kwasach. W roztworach wodnych tworzą
układy koloidalne, z których można je wytrącić za pomocą czynników odwadniających, np. etanolu, izopropanolu.
Wykonanie: Przygotować dwie szklane, krótkie probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.5% roztworu RNA
a następnie 2-3 krople 2 M HCl. Wytraca się biały osad RNA. Po dodaniu 200-300 l 10% roztworu NaOH osad
ulega rozpuszczeniu. Do drugiej probówki dodać 1 ml 1% RNA, 200 l 3M CH3COONa oraz 1 ml 96% etanolu
(temp. -20°C) – roztwór mętnieje, ponieważ wytrąca się osad RNA.
1.2. TWORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BARWNIKAMI
W środowisku kwaśnym kwasy nukleinowe wiążą barwniki zasadowe, tworząc połączenia typu soli, co
wykorzystuje się m.in. do wizualizacji jąder komórkowych w metodach histochemicznych.
Wykonanie: Do szklanej krótkiej probówki dodać 0.5 ml 0.5% RNA a następnie 150 µl 1 M CH3COOH oraz 2-3
kropli 0.1% błękitu metylenowego (używając pipety do 100 l). Zawartość szklanej probówki przenieść do
probówki o pojemności 1.5 ml i zwirować. Po wirowaniu widoczny jest niebieski osad kompleksów RNA z błękitem
metylenowym.
1.3. TWORZENIE KOMPLEKSÓW KWASÓW NUKLEINOWYCH Z BIAŁKAMI
Kwasy nukleinowe tworzą z białkami zasadowymi oraz niektórymi białkami obojętnymi połączenia kompleksowe.
Do oddzielenia białka od kwasu nukleinowego stosuje się nasycone roztwory NaCl.
Wykonanie: Do szklanej krótkiej probówki dodać 1 ml 0.5% RNA oraz 300 l 1 M CH3COOH a następnie 100 l
3% BSA. Wytrąca się osad kompleksowego połączenia białka z RNA. W celu rozpuszczenia osadu dodać 1 ml
nasyconego roztworu NaCl.
2. IZOLACJA I HYDROLIZA KWASÓW NUKLEINOWYCH
Każda ze znanych metod izolacji kwasów nukleinowych wymaga zniszczenia błon lipidowych, prowadzącego do
lizy komórki oraz oddzielania izolowanej cząsteczki kwasu od pozostałych składników komórki. Ważnym
elementem preparatyki jest inaktywacja nukleaz – enzymów odpowiedzialnych za degradację kwasów
nukleinowych. W celu rozbicia błon biologicznych oraz jednocześnie denaturacji białek (w tym nukleaz) stosuje
się detergenty, np. silny anionowy detergent siarczan dodecylu sodu (SDS). Inaktywująco na nukleazy działa
również
wersenian
dwusodowy
(EDTA),
cytrynian
sodu
oraz
fluorek
sodu.
Pozostałości
komórek
i wytrącone białka usuwa się przez wirowanie. W kolejnym etapie uwolniony do roztworu kwas nukleinowy
zagęszcza się przez precypitację schłodzonym etanolem lub izopropanolem. Kolejne wirowanie pozwala na
pozbycie się dużej objętości rozpuszczalnika i zwiększenia stężenia izolowanego kwasu nukleinowego przez
rozpuszczenie w mniejszej objętości.
Analiza poszczególnych komponentów cząsteczki kwasu nukleinowego wymaga jego hydrolizy, czyli rozerwania
wszystkich wiązań obecnych w tej makrocząsteczce. W przypadku DNA pierwszym etapem jest zniszczenie
wiązań wodorowych łączących komplementarne zasady. Zniszczeniu podczas hydrolizy ulegają również wiązania
fosfodiestrowe łączące nukleotydy oraz glikozydowe pomiędzy zasadą azotową a cukrem. Kwasy nukleinowe
podczas gotowania (100ºC) z kwasami mineralnymi (np. 1 M HCl, 10% H2SO4, 60% HClO4) ulegają stopniowej
hydrolizie do nukleotydów a przy wystarczająco długo prowadzonym ogrzewaniu w hydrolizacie uzyskujemy
wolne zasady azotowe, pentozy i kwas fosforowy.
2
Biochemia: Ćw. – Kwasy nukleinowe
2.1. IZOLACJA RNA Z DROŻDŻY
Opisana poniżej metoda izolowania RNA polega na rozbiciu komórek drożdży, usunięciu z roztworu białek i DNA
za pomocą detergentu SDS a następnie zagęszczeniu RNA przez wytrącenie z użyciem etanolu.
Wykonanie: W probówce wirowniczej o poj. 15 ml ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej 5 ml 5% roztworu SDS.
Dodać 1 g dokładnie rozdrobnionych drożdży piekarskich i ogrzewać przez 10 min mieszając bagietką. Probówkę
ochłodzić w lodzie a następnie zwirować (3000 RCF*, 10 min). Nadsącz zebrać do schłodzonej w lodzie probówki
wirowniczej o poj. 15 ml i dodać 96% etanolu (temp. -20ºC) w stosunku 1:1. Po piętnastominutowej precypitacji w
lodzie roztwór zwirować (3000 RCF, 10 min). A następnie usunąć dokładnie supernatant (do pojemnika do
utylizacji), natomiast osad wytraconego RNA rozpuścić w 5 ml wody destylowanej.
*RCF (ang. relative centrifugal force) – względna siła odśrodkowa wyrażająca wartość przyśpieszenia stosowaną do wirowania
próbek
2.2. HYDROLIZA KWASOWA RNA
Wykonanie: Do roztworu RNA wyizolowanego z drożdży dodać 10% H2SO4 w stosunku 1:1. Po wymieszaniu
podzielić roztwór do dwóch szklanych probówek (tak, by podczas hydrolizy poziom roztworów był na wysokości
wody w łaźni) i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 30 min. Po ostudzeniu w zlewce z zimną wodą hydrolizat
RNA przefiltrować a następnie przeprowadzić na nim reakcje pozwalające na identyfikację poszczególnych
składników (pkt. 2.3).
2.3. WYKRYWANIE SKŁADNIKÓW HYDROLIZATU RNA
2.3.1. WYKRYWANIE PENTOZY
W obecności stężonych kwasów mineralnych z pentozy powstaje z furfural (patrz: instrukcja do ćw. "Cukry proste
i złożone"), który kondensując z floroglucyną (fenol) tworzy związek barwiący roztwór na czerwono. Reakcja
z floroglucyną, podobnie jak próba Taubera, wykorzystywana jest do odróżniania pentoz od heksoz.
Wykonanie: Przygotować dwie długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml hydrolizatu RNA a do drugiej
1 ml 1% roztworu glukozy. Następnie do obydwu po 1 ml stężonego HCl i kilka kryształków floroglucyny.
Roztwory ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej. Hydrolizat RNA zawierający pentozy zabarwia się na czerwono
a roztwór glukozy na żółtobrunatno.
2.3.2. WYKRYWANIE RESZTY FOSFORANOWEJ
Obecny w hydrolizacie RNA kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecności HNO 3, co prowadzi do
powstania żółtego osadu fosfomolibdenianu amonu.
Wykonanie: Przygotować dwie krótkie szklane probówki. Do pierwszej dodać 0.5 ml hydrolizatu RNA i zobojętnić
go dodając 200 l amoniaku. Następnie dodać 0.5 ml stężonego HNO3 oraz 2 ml 2.5% molibdenianu
amonowego. Zawartość probówki ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej. Powstający fosfomolibdenian amonowy
wytrąca się przy większym stężeniu w postaci żółtego osadu. Równocześnie wykonać kontrolę z 5% kwasem
ortofosforowym.
2.3.3. WYKRYWANIE ZASAD AZOTOWYCH
Zasady obecne w kwasach nukleinowych są heterocyklicznymi związkami pierścieniowymi zawierającymi atomy
azotu. Reagują z jonami srebra i miedzi tworząc nierozpuszczalne sole kompleksowe.
Wykonanie: Przygotować dwie krótkie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml hydrolizatu RNA oraz 400 ul
stężonego amoniaku (do uzyskania słabo alkalicznego odczynu). Następnie dodać 0.5 ml 1% AgNO3. Wytrąca
3
Biochemia: Ćw. – Kwasy nukleinowe
się delikatny osad nierozpuszczalnych soli srebrowych puryn (oglądać w świetle lampki). Równocześnie wykonać
kontrolę z 0.1% roztworem adeniny (z pominięciem alkalizacji roztworu).
Identyfikację składników hydrolizatu RNA wykonujemy na gotowych hydrolizatach. Po przygotowaniu własnego
hydrolizatu należy wykonać jedną z powyższych reakcji weryfikującą skuteczność preparatyki i hydrolizy RNA.
3. ODRÓŻNIANIE RNA OD DNA
Opisane poniżej reakcje pozwalające zidentyfikować i odróżnić roztwór RNA od DNA bazują na obecności
różnych cukrów w cząsteczkach tych kwasów nukleinowych. Ryboza obecna w cząsteczce RNA w odróżnieniu
od deoksyrybozy, występującej w DNA, zawiera grupę hydroksylową przy węglu C2.
3.1. METODA ORCYNOWA – PRÓBA BIALA
Próba Biala jest reakcją kondensacyjną, w której pentozy (wolne oraz związane w nukleozydach purynowych)
ogrzewane ze stężonym HCl ulegają cyklizacji do furfuralu (patrz: instrukcja do ćw. "Cukry proste i złożone").
Furfural w obecności jonów Fe
3+
kondensuje z orcyną, tworząc związek barwy zielonej. Deoksyryboza również
reaguje z oryną, ale 10-krotnie słabiej, dlatego przyjmuje się, że DNA w próbie Biala daje wynik ujemny.
Wykonanie: Bezpośrednio przed użyciem zmieszać: 0.4 ml roztworu A (6% orcyna w 96% etanolu) oraz 5.6 ml
roztworu B (10% FeCl3 w stężonym HCl) w celu przygotowania odczynnika orcynowego. Uzyskujemy objętość
wystarczającą do przeprowadzenia 6 reakcji (dla 3 podgrup). Następnie przygotować dwie, długie szklane
probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.1% RNA, do drugiej 1 ml 0.1% DNA oraz po 1 ml odczynnika orcynowego
do każdej. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Roztwór RNA barwi się na oliwkowozielono.
3.2. METODA Z DIFENYLOAMINĄ – PRÓBA DISCHEGO
Deoksyryboza (wolna i związana w nukleotydach purynowych) w środowisku kwaśnym tworzy z difenyloaminą
związek barwny. RNA zawierający rybozę oraz deoksyryboza związana w nukleotydach pirymidynowych dają
wynik ujemny w tej reakcji.
Wykonanie: Przygotować dwie długie szklane probówki. Do pierwszej dodać 1 ml 0.1% RNA, do drugiej – 1 ml
0.1 % DNA, a następnie do każdej po 1 ml 1% odczynnika difenyloaminowego (1% difenyloamina w roztworze
lodowatego CH3COOH zawierającym stężony H2SO4) i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.
Roztwór DNA barwi się na niebiesko.
4. WIDMA ABSORPCYJNE ZASAD AZOTOWYCH I NUKLEOTYDÓW
Kwasy nukleinowe absorbują światło z zakresu ultrafioletu dzięki obecności w ich cząsteczkach heterocyklicznych
zasad azotowych zawierających sprzężone wiązania podwójne. Każda z zasad posiada charakterystyczne dla
siebie widmo z maksimum absorbancji przypadającym przy danej długości fali. Długość fali, przy której dana
zasada absorbuje najmocniej UV zmienia się w zależności od pH roztworu. Maksimum absorbancji dla kwasów
nukleinowych (260 nm) jest wypadkową absorbancji budujących go zasad azotowych. Zdolność absorpcji
ultrafioletu przez kwasy nukleinowe wykorzystywana jest do wyznaczania ich stężenia oraz czystości metodą
spektrofotometryczną.
Wykonanie: Dokonać pomiarów absorbancji roztworów adeniny, tyminy oraz adenozyno-5'-trifosforanu (ATP)
w 0.1 M HCl względem rozpuszczalnika w zakresie widma 230-290 nm zmieniając długość fali co 5 nm.
Następnie zmierzyć OD roztworu adeniny w 0.1 M NaOH względem rozpuszczalnika. Pomiary wykonać
w spektrofotometrze przeznaczonym do mikroobjętości Thermo Scientific Nano-Drop 2000 umieszczając 2 l
4
Biochemia: Ćw. – Kwasy nukleinowe
roztworów na statywie pomiarowym pomiędzy dwoma włóknami światłowodowymi. Wyniki wprowadzić do
tabeli 2.
Tab. 2. Dane pomiarowe do wykreślenia widm absorpcyjnych zasad azotowych i nukleotydu.
LP
 [nm]
1.
230
2.
235
3.
240
4.
245
5.
250
6.
255
7.
260
8.
265
9.
270
10.
275
11.
280
12.
285
13.
290
adenina w
0.1 M HCl
0.1 M NaOH
tymina w
0.1 M HCl
ATP w
0.1 M HCl
Na wspólnym wykresie narysować krzywe absorbancji adeniny (w różnym pH roztworu), tyminy i ATP. Porównać
kształt wykreślonych widm, intensywność pochłaniania UV oraz maksima absorbancji między:
- zasadą purynową i pirymidynową,
- zasadą azotową wolną i w postaci nukleotydu,
- adeniną w roztworze kwaśnym i zasadowym.
Zalecana literatura:
"Biochemia" J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, PWN, W-wa 2005; rozdział pt. "DNA, RNA i przepływ informacji
genetycznej"
"Biochemia Harpera" R.J. Murray, D.K. Granner, V.W. Rodwell, PZWL, W-wa 2008; rozdział dot. nukleotydów
oraz struktury i funkcji kwasów nukleinowych
"Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej" T. Kędryna, M. Gałka-Walczak, B. Ostrowska, Wydawnictwo UJ,
K-ów 2001; rozdział pt. „Chemiczne właściwości DNA i RNA”
5