Anna Dzier ga-L cznar, Arkadiusz Orchel, Krystyna St pie Effects

&ARM0RZEGL.AUK †
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
%FEKTYPRZEDŒU˜ONEJEKSPOZYCJIKOMÌREKLINII0#†NA,†$/0!
%FFECTSOFPROLONGED,†$/0!TREATMENTON0#†CELLS
!NNA$ZIER˜ÃGA†,ÃCZNAR!RKADIUSZ/RCHEL+RYSTYNA3TÃPIEÊ
+ATEDRA!NALIZY)NSTRUMENTALNEJ+ATEDRAI:AKŒAD"IOFARMACJI
7YDZIAŒU&ARMACEUTYCZNEGOZ/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJW3OSNOWCU
gL’SKIEGO5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW+ATOWICACH
Streszczenie
Neuromelanina jest pigmentem zlokalizowanym w cytoplazmie dopaminergicznych neuronów istoty czarnej
mózgu człowieka, zaangażowanym prawdopodobnie
w przebieg procesów neurodegeneracyjnych w chorobie
Parkinsona. Jednym z szeroko wykorzystywanych modeli
neuronów dopaminergicznych do badań in vitro jest dostępna handlowo linia komórkowa PC-12, wyprowadzona
z guza chromochłonnego nadnerczy szczura. Możliwości
wykorzystania tej linii jako modelu istoty czarnej mózgu
człowieka są jednak ograniczone z uwagi na brak pigmentu melaninowego. W niniejszej pracy podjęto próbę
indukcji melanogenezy w komórkach linii PC-12 poprzez
przedłużoną ekspozycję hodowli na L-DOPA. Hodowlę
prowadzono nieprzerwanie przez 10 miesięcy. Morfologię
komórek oceniano z wykorzystaniem mikroskopu optycznego. Do oceny żywotności komórek i tempa ich proliferacji zastosowano test oparty na oznaczaniu aktywności
LDH. Wykazano, że długotrwała ekspozycja komórek
linii PC-12 na L-DOPA nie powoduje odkładania melaniny w ich cytoplazmie, natomiast uruchamia w komórkach
mechanizmy adaptacyjne prowadzące do wykształcenia
tolerancji na pierwotnie letalne stężenia L-DOPA oraz
zwiększa odporność komórek na uszkodzenia indukowane cytotoksycznymi dawkami nadtlenku wodoru.
Abstract
Neuromelanin is the pigment that is localized in the cytoplasm of dopaminergic neurons of the human brain substantia nigra, and probably involved in the course of neurodegenerative processess characteristic for Parkinson’s
disease. Rat pheochromocytoma derived PC-12 cell line
is one of the commonly used models for in vitro studies of
dopaminergic neurons. The possibility of its application
as the human substantia nigra model is limited, however,
due to the lack of melanin pigment. In this study, the attempt to induce melanogenesis in PC-12 cells was made
by prolonged culture exposition to L-DOPA. The cells
were cultured continously for 10 month. Cell morphology was evaluated with light microscopy. The LDH assay
test was used to determine cell viability and proliferation
rate. It was shown that prolonged L-DOPA treatment did
not induce melanization of PC-12 cells, but caused their
adaptation to lethal doses of L-DOPA, and enhanced cell
resistance against hydrogen peroxide-dependent oxidative
damages.
Key words: melanin; DOPA; PC-12 cell line; oxidative
stress; hydrogen peroxide
Słowa kluczowe: melanina; DOPA; linia komórkowa
PC-12; stres oksydacyjny; nadtlenek wodoru
Wstęp
Bezpośrednią przyczyną charakterystycznych dla choroby Parkinsona zaburzeń motorycznych (drżenie spoczynkowe, wzrost napięcia mięśniowego, spowolnienie ruchowe)
jest masowe obumieranie dopaminergicznych neuronów
istoty czarnej, prowadzące do niedoboru dopaminy w prążkowiu. Wśród prawdopodobnych czynników zaangażowanych w patomechanizm choroby wymienia się m. in. stres
oksydacyjny, patologiczne procesy zapalne oraz narażenie
na neurotoksyny środowiskowe. Charakterystyczną cechą
neuronów nigrostriatalnych człowieka jest ich upigmentowanie neuromelaniną, polimerycznym pigmentem powstającym w cytoplazmie komórek w wyniku oksydacyjnych
przekształceń dopaminy. Biologiczne znaczenie postępującej
z wiekiem melanizacji neuronów istoty czarnej nie zostało
dotychczas wyjaśnione. Jednak istotny związek pomiędzy
stopniem upigmentowania komórek a ich podatnością na
zmiany zwyrodnieniowe w przebiegu choroby Parkinsona
sugeruje aktywny udział neuromelaniny w procesach neurodegeneracyjnych. Kwestią otwartą pozostaje, czy obecność
neuromelaniny przyczynia się do nasilenia tych procesów,
czy też stanowi czynnik cytoprotekcyjny [1].
Zasadniczą przeszkodą w podejmowaniu prób wyjaśnienia fizjopatologicznej roli neuromelaniny jest brak odpowiednich układów modelowych niezbędnych do badań in
vitro. Istoty czarne zwierząt doświadczalnych wykorzystywanych rutynowo w badaniach patomechanizmu choroby
Parkinsona i testowaniu nowych strategii terapeutycznych
są pozbawione neuromelaniny. Nie zawierają jej także linie
komórkowe będące coraz powszechniej stosowaną alternatywą dla zwierzęcego modelu parkinsonizmu [2].
&ARM0RZEGL.AUK
Jednym z szeroko wykorzystywanych modeli neuronów
dopaminergicznych człowieka jest linia komórkowa PC-12
wyprowadzona dla celów hodowli z tkanki guza chromochłonnego nadnerczy szczura. Komórki linii PC-12 wytwarzają dopaminę i wykazują ekspresję transporterów dopaminowych, a w odpowiedzi na czynnik wzrostu neuronów
ulegają szybkiemu różnicowaniu ujawniając fenotyp neuronalny. Możliwości wykorzystania tej linii jako modelu istoty
czarnej mózgu człowieka są jednak ograniczone z uwagi na
brak pigmentu melaninowego [3].
W niniejszej pracy podjęto próbę indukcji melanogenezy w komórkach linii PC-12. Wykorzystano w tym celu
sugestie literaturowe, że długotrwała ekspozycja hodowli na
L-dihydroksyfenyloalaninę (L-DOPA) może prowadzić do
odkładania melaniny w cytoplazmie tych komórek [4].
Materiał i metody
Hodowla komórkowa
Ryc. 1. Cytotoksyczność L-DOPA w stosunku do komórek
linii PC-12. Komórki eksponowano na wskazane stężenia
L-DOPA przez 3 doby.
Linię komórkową PC-12 wyprowadzoną z tkanki guza
chromochłonnego nadnerczy szczura, zakupiono za pośrednictwem firmy Sigma w Europejskiej Kolekcji Hodowli
Komórkowych (ECACC, Wielka Brytania). Jako medium
hodowlane zastosowano RPMI 1640 wzbogacone w płodową surowicę bydlęcą (10%) oraz L-glutaminę (RPMI 1640
Ready Mix, PAA), z dodatkiem buforu HEPES (20 mM,
PAA), penicyliny(100 jednostek/ml, PAA) i streptomycyny (100 μg/ml, PAA). Hodowlę prowadzono nieprzerwanie
przez 10 miesięcy w standardowych warunkach (temp. 37oC,
atmosfera o składzie 5% CO2 i 95% powietrza, wilgotność
95%). Co 2-3 dni wymieniano 2/3 medium hodowlanego.
W miarę potrzeby rozrzedzano hodowlę tak, aby utrzymać
zalecane przez ECACC stężenie komórek w zawiesinie
(2-5 x 105 komórek/ml). Do mikroskopowej oceny hodowli
wykorzystano mikroskop optyczny z kontrastem fazowym
Nikon Eclipse TS-100/F.
Ekspozycja komórek linii PC-12 na L-DOPA
Hodowle eksperymentalne prowadzono przez 10 miesięcy
w sposób opisany powyżej z tym, że medium hodowlane suplementowano L-DOPA, początkowo o stężeniu 10 i 30 μM,
a następnie 100 μM. Bezpośrednio przed wymianą medium,
do jego świeżej porcji dodawano odpowiednie objętości roztworu podstawowego L-DOPA (100mM w 0,1N HCl) rozcieńczonego dziesięciokrotnie sterylną wodą dejonizowaną.
Cytotoksyczność L-DOPA w stosunku do komórek linii PC-12
sprawdzono wykorzystując test oparty na oznaczaniu aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w medium pobranym
znad hodowli oraz w lizacie komórkowym (TOX-7, Sigma).
Ocena podatności komórek linii PC-12 na stres oksydacyjny
Po 6 miesiącach nieprzerwanej hodowli w obecności
i nieobecności L-DOPA, komórki linii PC-12 wprowadzono do 96 dołkowej płytki testowej (10 000 komórek/dołek)
i poddano 48 godzinnej ekspozycji na nadtlenek wodoru
o stężeniu 1, 10, 25 i 50 μM, a następnie wykonano test LDH
zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.
Ryc. 2. Wpływ długotrwałej ekspozycji komórek linii PC12 na L-DOPA na cytotoksyczność nadtlenku wodoru.
Komórki hodowane w nieobecności i obecności L-DOPA
(30 μM przez 2 miesiące, 100 μM przez kolejne 4 miesiące)
poddano 48 godzinnej ekspozycji na H2O2.
Wyniki i dyskusja
Próby indukcji melanogenezy poprzedzono oceną potencjalnej toksyczności L-DOPA w stosunku do hodowanej
linii PC-12, wykorzystując w tym celu test LDH. Dehydrogenaza mleczanowa jest enzymem cytoplazmatycznym, dlatego oznaczanie jej aktywności w medium pobranym znad
hodowli może być wskaźnikiem względnej żywotności komórek, jak również miarą integralności ich błon komórkowych np. w warunkach narażenia na związek potencjalnie
cytotoksyczny. Natomiast oznaczanie całkowitej aktywności enzymu po uprzednim poddaniu komórek lizie pozwala
na ocenę wpływu testowanego czynnika na tempo podziałów komórkowych w hodowli. Na podstawie obu strategii
pomiarowych ustalono, że bezpieczne dla prowadzonej
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Ryc.3. Komórki linii PC-12 hodowane przez 8 miesięcy
w nieobecności (A) i obecności (B) L-DOPA (30 MM przez
2 miesiące, 100 MM przez kolejne 6 miesięcy). Mikroskop
optyczny, pow. 400x, kontrast fazowy.
hodowli stężenie L-DOPA wynosi 10 μM (Ryc.1). Stężenie trzykrotnie wyższe powodowało wyraźne zahamowanie
proliferacji i naruszenie integralności błon komórkowych,
natomiast proponowane w literaturze stężenie 100 μM okazało się silnie cytotoksyczne. Do dalszych eksperymentów
wybrano zatem stężenia L-DOPA wynoszące10 i 30 μM.
Po pewnym czasie zaobserwowano, że narażenie na subtoksyczne stężenie L-DOPA (30 μM) uruchamia w komórkach linii PC-12 mechanizmy adaptacyjne prowadzące do
wykształcenia tolerancji na dawkę pierwotnie letalną. Dlatego, po 2 miesiącach nieprzerwanej ekspozycji, stężenie
L-DOPA w medium hodowlanym zwiększono z 30 do 100
μM, co pozostało praktycznie bez wpływu na tempo proliferacji i żywotność komórek. Podobne zjawiska adaptacyjne
zostały opisane w literaturze dla komórek PC-12 narażonych
na subletalne stężenia nadtlenku wodoru [5]. Wykazano, że
taka ekspozycja znacząco zwiększa tolerancję letalnych
dawek H2O2, prawdopodobnie na drodze zwiększenia aktywności wewnątrzkomórkowej katalazy i peroksydazy
glutationowej, a także poprzez hamowanie lub blokowanie różnych wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych
aktywowanych przez wysokie stężenia nadtlenku wodoru,
a odpowiedzialnych za uszkodzenia oksydacyjne i śmierć
komórek [6].
Jak wynika z ryciny 2, długotrwała ekspozycja komórek
linii PC-12 na 100 μM L-DOPA zmniejszyła ich podatność na
uszkodzenia spowodowane stresem oksydacyjnym. Wykazana
w teście LDH cytotoksyczność nadtlenku wodoru w stosunku
do tych komórek, począwszy od stężenia 10 μM była wyraźnie
niższa w porównaniu do hodowli kontrolnej. Cuhna-Oliveira
i wsp. [7] zaobserwowali podobny efekt w przypadku przewlekłej ekspozycji komórek PC-12 na subtoksyczne dawki kokainy
i zasugerowali, że chroniczne narażenie na kokainę może
aktywować wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe odpowiedzialne za adaptację komórek do toksycznych stężeń H2O2. Być może narażenie na L-DOPA uruchamia
w komórkach PC-12 analogiczne mechanizmy. Wydaje się
jednak, że obserwowany efekt można tłumaczyć także bezpośrednim oddziaływaniem L-DOPA ze składnikami stosowanego medium hodowlanego. Wykazano, że takie oddziaływanie prowadzi do szybkiego utleniania L-DOPA, czemu
towarzyszy wydzielanie nadtlenku wodoru w stężeniach
wystarczających do wykształcenia tolerancji komórek na toksyczne dawki H2O2 [8].
Po 10 miesiącach hodowli w obecności L-DOPA, nie
udało się zebrać jednoznacznych dowodów na melanizację
cytoplazmy komórek linii PC-12. Ocena mikroskopowa nie
ujawniła znaczących różnic w morfologii i wewnętrznej
architekturze komórek w porównaniu do hodowli kontrolnej (Ryc. 3). Komórki linii PC-12 należą do słaboadherentnych. W standardowych naczyniach hodowlanych rosną
w postaci zawiesiny, tworząc niewielkie skupiska złożone z komórek o kulistym kształcie. Komórki przyczepione
do podłoża przybierają formę neuronalnych fibroblastów
o zróżnicowanej liczbie wypustek. W cytoplazmie takich
komórek obserwowanych w kontraście fazowym widoczne
są liczne brązowe ziarnistości odpowiadające pęcherzykom
magazynującym dopaminę [9]. Nie udało się natomiast
stwierdzić obecności ziarnistości, które można by przypisać
pigmentowi melaninowemu [4]. Niezależnie od obecności
L-DOPA w medium hodowlanym, w miarę upływu czasu
obserwowano nasilenie tendencji hodowanych komórek do
adhezji, a także, począwszy od 9 miesiąca, stopniowy wzrost
liczby komórek w różnych stadiach nekrozy bądź apoptozy,
co - jako wyznacznik starzenia się hodowli – stało się przesłanką do jej zakończenia w 10 miesiącu eksperymentu.
Ponieważ w ocenie makroskopowej osad komórek eksponowanych na L-DOPA był wyraźnie ciemniejszy niż
w kontroli, podjęto próbę wyizolowania ewentualnego pigmentu z przeznaczeniem do badań strukturalnych. Jednakże
zastosowana w tym celu rutynowa procedura polegająca na
naruszeniu struktury komórek (2,5 x 108) metodą cyklicznego
rozmrażania i zamrażania, trawieniu za pomocą Tritonu X-100
i inkubacji z 5% SDS [10] zakończyła się niepowodzeniem.
Wnioski
Długotrwała ekspozycja dopaminergicznych komórek
linii PC-12 na 100 μM L-DOPA nie powoduje odkładania
melaniny w ich cytoplazmie, natomiast zwiększa odporność
komórek na uszkodzenia indukowane cytotoksycznymi
dawkami nadtlenku wodoru.
Badania finansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach (grant nr KNW-2-084/08).
&ARM0RZEGL.AUK
Piśmiennictwo
1. Stępień K, Dzierżęga-Lęcznar A, Tam I. Rola neuromelaniny w chorobie Parkinsona: nowe koncepcje. Wiad
Lek 2007; 60 (11-12): 563-569.
2. Falkenburger B H, Schulz J B. Limitations of cellular
models in Parkinson’s disease research. J Neural Transm
2006; Suppl 70: 261-268.
3. Green L A, Tischler A S. PC12 pheochromocytoma cultures in neurobiological research. Adv Cell Neurobiol
1982; 3: 373-414.
4. Sulzer D i wsp. Neuromelanin is driven by excess cytosolic catecholamines not accumulated by synaptic vesicles. Proc Natl Acad Sci 2000; 97 (22): 11869-11874.
5. Zhi-Hua C i wsp. Adaptation to hydrogen peroxide enhances PC12 cell tolerance against oxidative damage.
Neurosci Lett 2005; 383: 256-259.
data otrzymania pracy: 09.11.2009 r.
data akceptacji do druku: 26.01.2010 r.
Adres do korespondencji:
dr n. biol. Anna Dzierżęga-Lęcznar
tel: + 48 32 364 10 54
e-mail: [email protected]
6. Kim D K i wsp. Adaptive concentrations of hydrogen peroxide suppress cell death by blocking the activation of
SAPK/JNK pathway. J Cell Sci 2001; 114: 4329-4334.
7. Cuhna-Oliveira T i wsp. Differential cytotoxic responses
of PC12 cells chronically exposed to psychostimulants
or to hydrogen peroxide. Toxicology 2006; 217: 54-62.
8. Clement M-V i wsp.The cytotoxicity of dopamine may
be an artefact of cell culture. J Neurochem 2002; 81:
414-421.
9. Westerink R H S, Ewing A G. The PC12 cell as model
for neurosecretion. Acta Physiol 2008; 192: 273-285.
10. Stępień K i wsp. Melanin from epidermal human melanocytes: study by pyrolytic GC/MS. J Am Soc Mass
Spectrom 2009; 20: 464-468.