Przygotowanie krzywej standardowej

Nazwisko i imię
grupa
data
I. Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białka całkowitego metodą biuretową.
1. Przygotowanie roztworów wzorcowych do krzywej standardowej.
Do 6 probówek pipetuj odpowiednie roztwory wzorca białka i soli fizjologicznej.
1
Objętość 1%
r-ru wzorca
[ml]
-
Objętość
0.9% NaCl
[ml]
1.0
Stężenie
białka
[mg/ml]
-
2
0.2
0.8
2
3
0.4
0.6
4
4
0.6
0.4
6
5
0.8
0.2
8
6
1.0
-
10
Nr
probówki
A540nm
0,0
Próba ślepa odczynnikowa
2. Przygotowanie próby badanej.
Do 2 probówek pipetuj odpowiednio roztwory badanej próby i soli fizjologicznej.
Nr
probówki
Objętość
próby
[l]
Objętość
0.9% NaCl
[l]
Rozcieńczenie
7
50
950
20x
8
100
900
10x
A540nm
Stężenie
białka
z krzywej
[mg/ml]
Stężenie białka
w próbie badanej
[mg/ml]
3. Reakcja barwna
Do każdej probówki (próba ślepa, wzorce, próby badane) dodaj 4 ml odczynnika miedziowego.
Starannie zmieszaj i pozostaw na 10 min. w temp. pokojowej.
4. Zmierz absorbację przy długości fali 540 nm i zapisz wyniki w tabelach.
5. Na papierze milimetrowym sporządź wykres zależności absorbancji od stężenia wzorca. Narysuj
krzywą wzorcową i odczytaj stężenie białka w próbie badanej.
6. Oblicz rzeczywiste stężenie białka w próbie z uwzględnieniem rozcieńczenia. Sprawdź wynik u
asystenta.
7. Narysuj schemat kompleksu miedzi z azotami wiązania peptydowego. Określ rodzaje wiązań.
II. Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia białka w obecności kwasów nukleinowych
1. Przygotowanie próby badanej do pomiaru absorbancji UV.
Do probówki pipetuj odpowiednio roztwór soli fizjologicznej i badanej próby. Dokładnie wymieszaj.
Objętość
0.9% NaCl
Objętość próby
3 ml
30 μl
Rozcieńczenie
A280
A260
Stężenie białka
w próbie badanej
[mg/ml]
2. Zmierz absorbację przy obu długościach fal w spektrofotometrze UV i zapisz wyniki w tabeli.
3. Oblicz rzeczywiste stężenie białka w próbie z uwzględnieniem rozcieńczenia.
c [mg/ml] = 1,55 A280 – 0,76 A260
Wynik porównaj z uzyskanym w metodzie kolorymetrycznej. Sprawdź wynik u asystenta.
III. Odpowiedz na pytania i rozwiąż zadania.
1. Zgodnie z prawem Lamberta-Beera absorbancja jest …….
Napisz wzór i opisz jego składowe.
2. Czy białka mogą absorbować promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie widzialnym?
3. Jakie ugrupowania chemiczne odpowiadają za absorpcję promieniowania ultrafioletowego przez
białka? Jakie jest max tej absorpcji?
4. Jakie ugrupowania chemiczne absorbują promieniowanie UV w kwasach nukleinowych?
Jakie jest max tej absorpcji?
5. A280 dla 1% roztworu albuminy surowicy bydlęcej wynosi 6.6. Jaka będzie absorbancja roztworu
o stężeniu 2.5 mg/ml (kuweta 1 cm)?
6. Pobrano 0.3 ml surowicy pacjenta i rozcieńczono, dodając 2.7 ml roztworu soli fizjologicznej.
Wykonano reakcję biuretową; odczytana absorbancja wynosiła 0.4. Absorbancja roztworu wzorca o
stężeniu 5.0 mg/ml wynosi 0.25. Podaj stężenie białka w surowicy pacjenta w g/100 ml i g/l.
7. Surowicę rozcieńczono 20×. Oznaczono białko metodą biuretową. Wartość absorbancji
rozcieńczonej próby wyniosła 0.3. Wykorzystując krzywą standardową zamieszczoną poniżej, oblicz
stężenie białka w surowicy w g/100 ml i g/l.
8. Współczynnik absorpcji (k280) dla 1% roztworu trypsyny wynosi 14.3 w 1 cm kuwecie. Jakie jest
stężenie roztworu tego enzymu, jeśli A280=1.5 w kuwecie o grubości 0.5 cm?