FLEX Monoclonal Mouse Anti-Epstein-Barr Virus, LMP

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Epstein-Barr Virus, LMP
Klony CS. 1-4
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR753
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti Epstein-Barr Virus, LMP, Klony CS 1-4, Ready-to-Use (Link), jest
przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciało znakuje komórki
zakaŜone wirusem Epstein-Barr, w których zachodzi ekspresja późnego białka błonowego (LMP-1) i stanowi przydatne
narzędzie w identyfikacji komórek nowotworowych w związanej z wirusem Epstein-Barra chorobie Hodgkina (1-3) oraz
raka nosogardzieli (4). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania
morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego
patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Wirus Epstein-barr (EBV) to ludzki wirus opryszczki, normalnie występujący w postaci szeroko rozpowszechnionej
infekcji bezobjawowej u >95% dorosłej ludności świata, będących przez całe Ŝycie nosicielami wirusa. Genom wirusa
składa się z dwułańcuchowej cząsteczki DNA o długości około 172 par zasad, kodującego przynajmniej 80 białek.
Istnieją dwie linie wirusa EBV, choć większość genomu wydaje się być identyczna (5, 6). Komórki zainfekowane EBV
oraz zmiany nowotworowe zasadniczo wykazują jeden z trzech wzorów ekspresji genów wirusowych związanych z
utajeniem. W utajeniu typu I ekspresji ulega tylko zakodowany antygen jądrowy EBV 1 (EBNA-1), wraz z dwoma małymi
poliadenylowanymi jądrowymi RNA (EBER 1 i 2), obserwowanymi w chłoniaku Burkitta. W utajeniu typu II obserwuje się
dodatkową ekspresję trzech późnych białek błonowych, LMP-1, LMP-2A i LMP-2B, występujących w chorobie Hodgkina
oraz raku nosogardzieli. Utajenie typu III obserwowane jest w chorobach limfoproliferacyjnych rozwijających się u osób
z obniŜoną odpornością oraz transformowaną przez EBV linią komórek limfoblastoidalnych. W grupie tej ekspresji ulega
wszystkie sześć genów EBNA (EBNA-1/2/3A/3B/3C/LP), wszystkie trzy geny LMP oraz dwa geny EBER (6).
Integralne białko błonowe, LMP-1, kodowane jest przez gen BNRF1 i zawiera 386 aminokwasów, o łącznej masie
cząsteczkowej 63 kDa. Białko to uwaŜa się za onkogenne i bierze ono udział w czterech szlakach transkrypcyjnych
czynników sygnalizacyjnych, oraz indukuje ekspresję licznych markerów powierzchniowych komórek oraz komórkowych
molekuł adhezyjnych (4, 5). EBV związany jest z pewnymi nowotworami pochodzenia chłonnego i nabłonkowego, w tym
chłoniakiem Burkitta, chłoniakiem immunoblastycznym, chłoniakiem z komórek T, chorobą Hodgkina, rakiem
nosogardzieli oraz rakiem Ŝołądka (5, 6).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części
instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowa do uŜyci mieszanina czterech monoklonalnych mysich przeciwciał w postaci ciekłej jako nadsącz hodowli
tkankowej dializowany wobec buforu Tris/HCl o stęŜeniu 0,05 mol/L, o pH 7,2, zawierającego NaN3 w stęŜeniu
0,015 mol/L.
Klon: CS 1, CS 2, CS 3 i CS 4 Izotyp: IgG1, kappa.
Immunogen
Rekombinowane białko fuzyjne zawierające sekwencje bakteryjnej beta-galaktozydazy oraz karboksylową połowę
LMP kodowanego przez EBV (7).
Swoistość
W badaniu techniką Western blot lizatów przekształconych przez EBV linii komórek limfoblastycznych przeciwciało
znakuje duŜe pasmo 57–66 kDa, w zaleŜności od izolatu wirusa, czasem wraz z mniejszym pasmem 50–55 kDa
odpowiadającym pełnej długości i skróconej formie LMP. Przeciwciało rozpoznaje 20 odległych geograficznie izolatów
EBV (7). Przeciwciało reaguje krzyŜowo z posiadającym masę 43–44 kDa dubletem niescharakteryzowanych
prawidłowych białek komórkowych w ekstraktach komórkowych, włącznie z tymi z linii komórkowej kontroli ujemnej
pozbawionej EBV (7).
Przeciwciało znakuje prawidłowe linie komórek limfoblastycznych EBV-dodatnich wyprowadzonych przez zainfekowanie
prawidłowych spoczynkowych komórek B wirusem B95.8, podczas gdy linia komórkowa BL2, wyprowadzona z
rzadkich, EBV-ujemnych pacjentów BL, oraz inne niezwiązane izolaty komórkowe, włącznie z migdałkowymi komórkami
B i T, wątrobą i grasicą płodową, hodowlami fibroblastów płodowych, liniami ludzkich komórek białaczki HSB2 i K562
oraz 7 liniami EBV-ujemnych komórek B nie wykazują znakowania oprócz komórkowego dubletu białkowego (7).
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
(118010-002)
Dako Denmark A/S
IR753/PL/MNI/2009.12.04 str. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, oraz gdy podejrzewa się
problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x) (nr kat. K8000/K8004).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone
zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania.
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków
parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000). W systemie Autostainer Link
wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana objętość uŜytego odczynika to 1 x 200 µL lub
2 x 150 µL na preparat. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników
przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym
systemie Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury
inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
Optymalne warunki mogą zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny być
określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. JeŜeli patolog oceniający preparat Ŝyczy sobie wybarwienia innym
natęŜeniu, czasy inkubacji oraz uŜycie szablonów wizualizacji EnVision FLEX/EnVision FLEX+ mogą zostać
zmienione. W celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu, naleŜy skontaktować się z
działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest
prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (nr kat. K8008).
Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować EBV-dodatnie
chłoniaki Burkitta i Hodgkina, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać
odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to
FLEX Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja
wybarwienia
Komórki znakowane przeciwciałem wykazują odczyn cytoplazmatyczny i błonowy.
Charakterystyka
działania
Tkanki normalne: Przeciwciało nie znakuje ani prawidłowej błony śluzowej nosogardzieli, ani nacieczonego limfocytami,
desmoplastycznego zrębu i prawidłowego nabłonka okrywającego w pierwotnych preparatach nosogardzieli (4).
Przeciwciało nie wykazuje znakowania w obrębie jelita grubego, wyrostka robaczkowego oraz trzustki (8) Silne
znakowanie prawidłowych wczesnych prekursorowych komórek mieloidalnych i erytroidalnych moŜna zaobserwować
pomimo stwierdzonego metodą PCR całkowitego braku dowodów obecności EBV (9).
Tkanki patologiczne: Przeciwciało znakowało 22/46 zatopione w parafinie tkanki przypadków choroby Hodgkina z 1/12
przewagą limfocytów, 12/24 stwardnień guzowatych, 6/7 typem mieszanokomórkowym oraz 3/3 podtypy z nadmierną
utratą limfocytów (2). W innych badaniach obejmujących 47 chłoniaków Hodgkina 32/47 zostały wyznakowane
przeciwciałem, w tym 28/42 przypadki podtypu stwardnień guzowatych oraz 4/5 podtypu mieszanokomórkowego (3).
Wśród 51 raków nosogardzieli przeciwciało znakowało 40/51, w tym 8/10 raków płaskonabłonkowych rogowaciejących,
7/12 raków płaskonabłonkowych nierogowaciejących oraz 25/29 raków niezróŜnicowanych (4).
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
(118010-002)
Dako Denmark A/S
Pallesen G, Hamilton-Dutoit SJ, Rowe M, Young LS. Expression of Epstein-Barr virus latent gene products in
tumour cells of Hodgkin’s disease. Lancet 1991;337:320-2.
Murray PG, Young LS, Rowe M, Crocker J. Immunohistochemical demonstration of the Epstein-Barr virusencoded latent membrane protein (LMP-1) in paraffin sections of Hodgkin’s disease. J Pathol 1992;166:1-5
Engel M, Essop MF, Close P, Hartley P, Pallesen G, Sinclair-Smith C. Improved prognosis of Epstein-Barr virus
associated childhood Hodgkin’s lymphoma: study of 47 South African cases. J Clin Pathol 2000;53:182-6.
Vera-Sempere FJ, Burgos JS, Botella MS, Cordoba J, Gobernado M. Immunohistochemical expression of
Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein (LMP-1) in paraffin sections of EBV-associated
nasopharyngeal carcinoma in Spanish patients. Oral Oncol, Eur J Cancer 1996;32B:163-8.
Baumforth KRN, Young LS, Flavell KJ, Constandinou C, Murray PG. The Epstein-Barr virus and its association
with human cancers [review]. J Clin Pathol: Mod Pathol 1999;52:307-22.
Cruchley AT, Williams DM, Niedobitek G, Young LS. Epstein-Barr virus: biology and disease [review]. Oral
Diseases 1997;3 Suppl 1: S156-63.
IR753/PL/MNI/2009.12.04 str. 2/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
7.
8.
9.
Rowe M, Evans HS, Young LS, Hennessy K, Kieff E, Rickinson AB. Monoclonal antibodies to the latent
membrane protein of Epstein-Barr virus reveal heterogeneity of the protein and inducible expression in virustransformed cells. J Gen Virol 1987;68:1575-86.
Jiwa NM, Oudejans JJ, Dukers DF, Vos W, Horstman A, van der Valk P, et al. Immunohistochemical
demonstration of different latent membrane protein -1 epitopes of the Epstein-Barr virus in lymphoproliferarive
diseases. J Clin Pathol 1995;48:438-42.
Leong ASY, Cooper K, Leong FJWM, Manual of diagnostic antibodies for immunhistology. Oxford University
Press; 199 p. 162.
Obja śnienie s ym boli
Nume r kata lo go wy
Temp era tu ra p rzec ho wywa ni a
Zu Ŝyć p rzed
Wyr ób me dycz ny d o
d ia gn ostyki i n vi tro
Zawa rtość wystarcz a na <n >
te stów
Prod uce nt
Sp ra wdz ić w i nstru kcji
sto sow an ia
Nu mer se rii
(118010-002)
Dako Denmark A/S
IR753/PL/MNI/2009.12.04 str. 3/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17