NOVA Lite® Monkey Oesophagus/Jejunum IFA

NOVA Lite® Monkey Oesophagus/Jejunum IFA Slides
Do diagnostyki in vitro
Tylko na eksport. Nie na sprzedaż w Stanach Zjednoczonych.
Kod produktu:
504215, 504215.10
Złożoność CLIA: Wysoka
Przeznaczenie
Skrawki przełyku/jelita czczego są przeznaczone do używania jako substrat do wykrywania przeciwciał
śródmięśniowych w ludzkiej surowicy, jako pomoc w diagnozowaniu celiakii.
Podsumowanie i wyjaśnienie testu
Przeciwciała śródmięśniowe są kierowane przeciwko włóknom „pseudo-retikuliny” w tkance łącznej wokół
włókien mięśnia gładkiego w przewodzie pokarmowym naczelnych. Stwierdzono prawie 100% wrażliwość
i swoistość dla przeciwciał śródmięśniowych klasy IgA w aktywnej chorobie celiakii.1,2 Te przeciwciała są
wykrywane przez anty-ludzki koniugat fluoresceiny IgA. Stan przeciwciała IgG należy zbadać, jeśli u
pacjentów występuje selektywny niedobór IgA3, tak więc zalecane jest użycie koniugatu fluoresceiny małpy
anty-ludzkiego IgG (H i L). Immunoglobulina w surowicy pacjenta przyłącza się niespecyficznie do cytoplazmy
niektórych komórek w jelicie czczym i pomimo tego, że powoduje to bezpośredniego zablokowania tkanki
śródmięśniowej, to zabarwienie anty-śródmięśniowe można dostrzec łatwiej, jeśli próbki są rozcieńczane
w normalnej surowicy owczej zamiast PBS.
Skrawki przełyku małpy mogą być użyte do detekcji przeciwciał skóry, jednak zalecamy używanie preparatów
INOVA i zestawów przeznaczonych specjalnie do tego celu (704160, 704165, 504160 oraz 504160.10).
Zasada badania
Niebezpośrednia technika immunofluorescencyjna4 jest używana, gdy próbki pacjenta oraz odpowiednie
kontrole są inkubowane z preparatami substratu. Niezwiązane przeciwciała są wypłukiwane i podawane są
odpowiednie koniugaty znakowane fluoresceiną. Niezwiązany koniugat jest wypłukiwany i preparaty są
oglądane pod mikroskopem fluorescencyjnym. Pozytywne próbki wykazują jasnozielone zabarwienie
fluorescencyjne, które odpowiada obszarom skrawka, gdzie związało się autoprzeciwciało.
Odczynniki
Skrawki przełyku/jelita czczego małpy na 5-dołkowych preparatach zapakowane oddzielnie z osuszaczem.
Ostrzeżenia/środki ostrożności
Należy ustalić odpowiednie metody obsługi i utylizacji wszystkich potencjalnie infekcyjnych próbek badanych
przy użyciu tego produktu. Jedynie personel odpowiednio przeszkolony w zakresie tych metod powinien być
upoważniony do wykonywania tych badań.
Warunki przechowywania
Nieotwarte preparaty powinny być przechowywane w temperaturze 2–8°C i mogą być używane w trakcie
podanego terminu ważności. NIE ZAMRAŻAĆ. Gdy preparaty zostaną wyjęte z torebki foliowej, należy ich
natychmiast użyć.
Pobieranie próbek
Próbki krwi powinny być pobierane poprzez wkłucie dożylne, powinny w naturalny sposób skrzepnąć,
a surowica powinna zostać jak najszybciej oddzielona, aby nie dopuścić do hemolizy. Surowica przed analizą
może być przechowywana w temperaturze 2–8°C do 7 dni7 lub dłużej, jeśli zostanie podzielona i będzie
przechowywana w temperaturze -20°C lub niższej. NIE zamrażać i rozmrażać surowicy więcej niż jeden raz.
Unikać surowicy lipemicznej, hemolizowanej lub skażonej bakteryjnie, ponieważ może dojść do obniżenia
stężenia lub może wystąpić niewyraźne wybarwienie.
1
Badanie
Dostarczone materiały
1.
Przełyk/jelito czcze małpy 1 x 5-dołkowy preparat lub 10 x Przełyk/jelito czcze małpy 5-dołkowy
preparat (odpowiednio).
Wymagane materiały nie dołączone do zestawu
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Bufor PBS do płukania i rozcieńczania próbek
Naczynie do buforu PBS
Mikropipety i jednorazowe końcówki do przenoszenia próbek pobranych od pacjentów
Komora wilgotna do czynności związanych z inkubacją
Mikroskop fluorescencyjny z filtrem wzbudzającym 495 nm i filtrem barierowym 515 nm
Plastikowa gruszka laboratoryjna do wstępnego płukania w buforze PBS
Dodatkowe elementy można zakupić w firmie INOVA Diagnostics: PBS (508002), system kontroli negatywnej
IFA (508186) (508186), śródmięśniowa kontrola pozytywna (504050), FITC (H+L), koniugat małpy (504011,
504071), anty-ludzkie IgA (łańcuch α) AFF FITC (504023, 504045), koniugat FITC IgA (małpy) nr EB
(504015), błękit Evansa 1% (504049) i środek do osadzania preparatu (508001, 508005, 508006).
Procedura badania
Kontrola jakości
Przy każdym badaniu próbek powinna być stosowana kontrola pozytywna i negatywna.
1.
Środek do osadzania preparatu: Wyjąć środek do osadzania preparatu z chłodziarki, aby przed
użyciem osiągnął temperaturę pokojową (18–28°C).
2.
Rozcieńczyć próbki pobrane od pacjenta: Rozcieńczyć próbki pochodzące od pacjenta w stosunku
1/10, dodając 20 µl surowicy do 180 µl surowicy owczej PBS.
3.
Preparaty substratu. Preparaty substratu przed wyjęciem z woreczka muszą osiągnąć temperaturę
pokojową (18–28°C).
Odpowiednio oznaczyć preparaty, umieścić w komorze wilgotnej i dodać kontrolę pozytywną oraz
negatywną do odpowiednich dołków. Do pozostałych dołków dodać 50 µl rozcieńczonych próbek
pochodzących od pacjenta.
4.
Inkubacja preparatu. Inkubować preparaty przez 30 minut w komorze wilgotnej w temperaturze
pokojowej (18–28°C).
5.
Płukanie PBS. Wyjąć preparaty z komory wilgotnej i krótko przepłukać PBS posługując się gruszką
laboratoryjną. Nie kierować strumienia bezpośrednio na dołki. Umieścić preparaty w statywie,
zanurzyć w buforze PBS i wstrząsać lub mieszać przez 5–10 minut.
6.
Dodanie fluorescencyjnego koniugatu. Strząsnąć nadmiar buforu PBS i osuszyć przestrzeń wokół
dołków. Umieścić preparaty ponownie w komorze wilgotnej i natychmiast przykryć każdy dołek kroplą
fluorescencyjnego koniugatu. NIE POZOSTAWIAĆ ODKRYTYCH DOŁKÓW NA CZAS DŁUŻSZY
NIŻ 15 SEKUND. Wyschnięcie substratu w poważnym stopniu wpływa na wyniki. Użycie koniugatu
małpy w znacznym stopniu poprawi wyniki (np. 504011).
7.
Inkubacja preparatu. Inkubować preparaty przez 30 minut w komorze wilgotnej w ciemności,
w temperaturze pokojowej (18–28°C).
8.
Płukanie PBS. Wykonać ponownie płukanie, zgodnie z punktem 5. OPCJONALNE BARWIENIE
KONTRASTOWE. Przed zanurzeniem preparatu dodać 2–3 krople błękitu Evansa 1% na 100 ml
buforu PBS.
9.
Osadzanie ze szkiełkiem nakrywkowym. Wyjąć po kolei preparaty z płukanki PBS. Osuszyć szybko
obszar wokół dołków i do każdego dołka dodać kroplę środka do osadzania preparatu. Opuścić
ostrożnie preparat na szkiełko nakrywkowe. Należy starać się nie dopuścić do powstania
pęcherzyków powietrza, ale jeśli występują, nie należy ich usuwać. Zetrzeć nadmiar środka do
osadzania wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego.
10.
Obejrzeć preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym. Preparaty mogą być przechowywane do
3 dni w temperaturze 2–8°C, w ciemności, bez istotnej utraty fluorescencji.
2
Wyniki
Kontrola jakości
Śródmięśniowa kontrola pozytywna IgA, używana z koniugatem anty-IgA, powinna wykazać jasnozielone
zabarwienie włókien „pseudo-retikuliny” w tkance łącznej wokół mięśnia gładkiego. Podobne zabarwienie
powinno być również widoczne, gdy używana jest kontrola śródmięśniowa IgG z koniugatem małpy anty-IgG
(H i L). Kontrola negatywna powinna wykazać zgniłozielone zabarwienie we wszystkich tkankach, bez
dostrzegalnej fluorescencji. Jeśli powyżej opisane kontrole nie zostaną uzyskane, badanie jest nieprawidłowe
i należy je powtórzyć.
Interpretacja wyników
Kolorowy przykład fotograficzny tego wzoru można znaleźć w punkcie ref. 3 i 5. Wyniki są raportowane jako
pozytywne lub negatywne.
Uwaga: Każde laboratorium powinno ustalić, na którym etapie wynik pozytywny jest traktowany jako klinicznie
istotny.
Ograniczenia badania
1.
2.
3.
4.
Test ten, gdy przeprowadza się go jako jedyny, nie powinien być rozpatrywany jako diagnostyczny.
Muszą zostać uwzględnione wszystkie inne czynniki, w tym historia kliniczna pacjentów oraz inne
wyniki serologiczne lub wyniki badań biopsyjnych.
Może wystąpić reaktywność krzyżowa na skutek obecności przeciwciał grupy krwi anty-A i anty-B,
ponieważ śluzówka przełyku może zawierać substancje grupy krwi.6 U niektórych pacjentów wzór
zabarwienia może przypominać przeciwciała pęcherzycy, pomimo tego, że przeciwciała grupy krwi
również będą barwić kapilary umięśnienia przełyku.
Źródło światła, filtry i przyrządy optyczne różnych producentów mikroskopów fluorescencyjnych
wpływają na wrażliwość badania. Działanie mikroskopu jest w dużym stopniu uzależnione od
prawidłowej obsługi/serwisowania. Szczególnie dotyczy to wycentrowania lampy rtęciowej oraz jej
wymiany, zgodnie z zaleceniami serwisowymi.
Przydatność do stosowania z odczynnikami IFA innych producentów nie została sprawdzona, ale
stosowanie z takimi odczynnikami nie koniecznie musi być wykluczone.
Podsumowanie badania
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Doprowadzić środek do osadzania preparatu do temperatury pokojowej.
Rozcieńczyć bufor PBS wodą destylowaną lub dejonizowana.
Rozcieńczyć surowicę pacjenta surowicą owczą lub PBS w stosunku 1/10.
Doprowadzić preparaty substratu do temperatury pokojowej (18–28°C).
Do odpowiednich dołków wlać 50µl grupy kontrolnej pozytywnej i negatywnej oraz rozcieńczoną
surowicę pacjenta.
Inkubować w komorze wilgotnej przez 30 minut.
Płukać przez 5–10 minut w buforze PBS.
Osuszyć obszar wokół każdego dołka i natychmiast pokryć każdy dołek kroplą koniugatu.
Inkubować zgodnie z punktem 6.
Przepłukać zgodnie z punktem 7.
Zamontować.
Obejrzeć preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym.
3
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Sacchetti L., Ferrajolo A. et al (1996): Diagnostic value of various serum antibodies detected by diverse
methods in childhood coeliac disease. Clinical Chemistry 42: 11: 1838 – 1842.
Sategna-Guidetti C. et al (1995): Comparison of serum anti-gliadin, anti-endomysium and anti-jejunum
antibodies, in adult coeliac sprue. J. Clin. Gastroenterol. 20 (1) 17 – 21.
Bradwell A. R., Stokes R. P. and Mead G. P. (1999): Advanced atlas of autoantibody patterns. Pub: The Binding
Site Ltd., Birmingham UK.
Weller, T. H. Coons, A. H. (1954): Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster
propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789-794.
Bradwell A. R. et al (1997): Atlas of autoantibody patterns on tissues. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham
UK.
Szulman A. E. (1962): The histological distribution of blood group substances A and B in man. J. Exp. Med. 115:
977
rd
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3 Edition) 2004. Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU
Publications, Sheffield
NOVA Lite jest zastrzeżonym znakiem handlowym firmy INOVA Diagnostics, Inc.
Copyright 2013. Wszelkie prawa zastrzeżone©
Wyprodukowano przez:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
Stany Zjednoczone Ameryki
Pomoc techniczna (poza terenem Stanów Zjednoczonych): 00+ 1 858-805-7950
[email protected]
Autoryzowani przedstawiciele na terenie Unii Europejskiej:
Medical Technology Promedt Consulting GmbH
Altenhofstrasse 80
D-66386 St. Ingbert, Niemcy
Tel.: +49-6894-581020
Faks.: +49-6894-581021
www.mt-procons.com
624215POL
Listopad 2013
Wersja 1
4