pobierz plik - Wydział Biologii UW

Autoreferat rozprawy doktorskiej mgr Karoliny Drążkowskiej
„Degradacja RNA przez kompleks egzosomu”
Promotorzy:
dr hab., prof. UW Andrzej Dziembowski (Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii,
Uniwersytet Warszawski)
dr Rafał Tomecki (Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet
Warszawski) – promotor pomocniczy
Recenzenci:
prof. dr hab. Włodzimierz Krzyżosiak (Instytut Chemii Bioorganicznej, Polska Akademia
Nauk)
dr hab., prof. UAM Krzysztof Sobczak (Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii, Wydział
Biologii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu)
Praca doktorska wykonana w Instytucie Genetyki i Biotechnologii Wydziału Biologii
Uniwersytetu Warszawskiego oraz Instytucie Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk.
Jednym z głównych enzymów odpowiedzialnych za obróbkę i degradację RNA
w komórce jest egzosom. Ten wielopodjednostkowy silnie zachowany w ewolucji kompleks
białkowy pełni liczne funkcje w wielu procesach metabolizmu RNA różnych klas. Egzosom
składa się z 6-białkowej podstawy i czapeczki uformowanej przez trzy elementy, które razem
tworzą
pierścień
niewykazujący
aktywności
enzymatycznej
oraz
z
podjednostek
katalitycznych odpowiedzialnych za właściwości katalityczne całego kompleksu. Egzosom
zlokalizowany jest zarówno w jądrze komórkowym, jaki i cytoplazmie. Kompleks
hydrolitycznie degraduje RNA od końca 3’ do 5’ (udział domeny RNB), ale trawi RNA również
endonukleolitycznie (rola domeny PIN).
Egzosom zaangażowany jest w wiele kluczowych szlaków metabolizmu RNA.
W jądrze odpowiada za przycinanie prekursora cząsteczki 5.8S rRNA, bierze również udział
w dojrzewaniu innych stabilnych RNA jak snRNA i snoRNA. Ponadto, uczestniczy
w degradacji produktów ubocznych powstających podczas obróbki RNA, na przykład
intronów czy 5’ ETS, oraz usuwaniu niepoprawnie zsyntetyzowanych pre-mRNA, tRNA czy
rRNA. W cytoplazmie egzosom degraduje wadliwe cząsteczki mRNA, które w sekwencji
zawierają przedwczesny kodon stop, nie zawierają go wcale lub posiadają błędy
uniemożliwiające swobodną translokację rybosomów. Kompleks hydrolizuje również
prawidłowo zsyntetyzowane transkrypty w momencie, kiedy nie są już komórce potrzebne.
Aktywność enzymatyczna egzosomu oraz jego specyficzność substratowa zostały
dość dobrze poznane, natomiast na temat funkcji nieaktywnego katalitycznie pierścienia nie
było wiadomo wiele. Pojawiły się dane pochodzące z badań przeprowadzonych jedynie
in vitro sugerujące, że substraty RNA, które docierają do domeny katalitycznej RNB białka
Dis3 przechodzą przez kanał pierścienia. Wykazano, że zmiana zachowanych w ewolucji
aminokwasów w białku Rrp41 współtworzącym pierścień, potencjalnie odpowiedzialnych za
oddziaływanie z RNA, powoduje zablokowanie kanału i uniemożliwia substratowi dotarcie do
centrum aktywnego domeny RNB białka Dis3, hamując tym samym jego egzonukleolityczną
degradację.
Celem niniejszej pracy było poznanie roli pierścienia drożdżowego egzosomu na
podstawie analiz przeprowadzonych in vivo. Osiągnięto to przez wprowadzenie do drożdży
mutacji blokujących kanał pierścienia i zbadanie ich wpływu na metabolizm RNA w komórce.
Przygotowany został szereg szczepów drożdżowych, w których zablokowano kanał
i dodatkowo wprowadzono mutację katalityczną egzo- lub ednonukleolitycznej domeny
odpowiednio RNB lub PIN, białka Dis3. Przeprowadzono analizę fenotypów wzrostowych
i molekularnych uzyskanych szczepów.
Stwierdzono, że zablokowanie kanału pierścienia egzosomu przez zamianę czterech
silnie zachowanych w ewolucji aminokwasów zasadowych na kwaśne w białku Rrp41
skutkuje kumulacją jądrowych substratów egzosomu oraz znacznym spowolnieniem
cytoplazmatycznej degradacji prawidłowo zsyntetyzowanych oraz wadliwych transkryptów.
Kanał pierścienia egzosomu pełni zatem funkcję w przewodzeniu RNA docierającego do
domeny RNB białka Dis3 również in vivo. Wydaje się także, że uczestniczy on w regulacji
endonukleolitycznego trawienia substratów, katalizowanego przez domenę PIN.
Dodatkowo,
wprowadzono
mutacje
trzech
silnie
zachowanych
w
ewolucji
aminokwasów w białku Rrp4 będącym podjednostką czapeczki pierścienia egzosomu.
Zmiana tych aminokwasów, które prawdopodobnie odpowiedzialne są za oddziaływanie
z substratami RNA wchodzącymi do kanału, powoduje letalność drożdży oraz molekularne
fenotypy charakterystyczne dla deplecji Rrp4. Uzyskane wyniki świadczą wyraźnie o istotnej
roli, jaką odgrywają te ewolucyjnie zachowane aminokwasy w funkcjonowaniu egzosomu
w komórce.
Wyniki przeprowadzonych doświadczeń pozwoliły na wnioskowanie o istotnej roli,
jaką odgrywa kanał pierścienia kompleksu w doprowadzaniu substratów do obu centrów
katalitycznych obecnych w białku Dis3: zarówno w domenie RNB, związanego z aktywnością
egzorybonukleolityczną,
endorybonukleolityczną.
jak
i
w
domenie
PIN,
odpowiedzialnego
za
aktywność
W skład rozprawy doktorskiej wchodzą następujące publikacje:
1. The RNA exosome complex central channel controls both exonuclease and
endonuclease Dis3 activities in vivo and in vitro, NAR (2013)
Drazkowska K, Tomecki R, Stodus K, Kowalska K, Czarnocki-Cieciura M,
Dziembowski A
2. The human core exosome interacts with differentially localized processive RNases:
hDIS3 and Hdis3l, EMBO J (2010)
Tomecki R, Kristiansen M, Lykke-Andersen S, Chlebowski A, Larsen K, Szczesny R,
Drazkowska K, Pastula A, Andersen J, Stepien P, Dziembowski A, Jensen T
3. RNA channelling by the eukaryotic exosome, EMBO Rep (2010)
Malet H, Topf M, Clare D, Ebert J, Bonneau F, Basquin J, Drazkowska K, Tomecki
R, Dziembowski A, Conti E, Saibil H, Lorentzen E
4. Mechanisms of RNA degradation by the eukaryotic exosome, Chembiochem (2010)
Tomecki R, Drazkowska K, Dziembowski A