Dako REAL™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit

Dako REAL™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse
Nr kat. K5001
Wydanie 6.
Do uŜytku z automatami firmy Dako do wykonywania odczynów immunohistochemicznych.
Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 500 testów.
(129662-001)
P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 1/9
(129662-001)
P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 2/9
Spis treści
Strona
Przeznaczenie .............................................................................................................................. 4
Streszczenie i informacje ogólne .................................................................................................. 4
Odczynniki.................................................................................................................................... 5
A. Dostarczane materiały ......................................................................................................... 5
B. Materiały wymagane, ale niedostarczane ............................................................................ 5
Środki ostroŜności ........................................................................................................................ 6
Przechowywanie........................................................................................................................... 7
Przygotowanie odczynników......................................................................................................... 7
Pobieranie i przygotowanie próbek ............................................................................................... 7
Procedura..................................................................................................................................... 7
Kontrola jakości ............................................................................................................................ 8
Interpretacja wyników ................................................................................................................... 9
Objaśnienie symboli ..................................................................................................................... 9
(129662-001)
P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 3/9
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
System Dako REAL Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse jest przeznaczony do
stosowania w immunohistochemii, w automatach firmy Dako do wykonywania odczynów
immunohistochemicznych. Zestaw działa w oparciu o metodę LSAB (znakowanie streptawidynąbiotyną) rozpisaną na trzy etapy. Pierwszym etapem jest inkubacja tkanki z optymalnie rozcieńczonymi
pierwotnymi przeciwciałami króliczymi lub mysimi, drugim etapem jest inkubacja z odczynnikiem
Dako REAL™ Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), a trzecim etapem jest inkubacja
z odczynnikiem Dako REAL™ Streptavidin Peroxidase (HRP). Reakcja obrazowana jest przy
pomocy chromogenu Dako REAL™ DAB+, równieŜ załączonego w zestawie. W celu uzyskania
prawidłowego odczynu zaleca się stosowanie zestawu łącznie z innymi zalecanymi odczynnikami,
wymienionymi w punkcie „Materiały wymagane, ale niedostarczane".
Streszczenie i informacje ogólne
Zestaw Dako REAL™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse opracowano z myślą
o optymalnym przebiegu barwienia w automatach Dako do wykonywania odczynów
immunohistochemicznych, gdy uŜywane są szablony/protokoły wymienione w niniejszej ulotce.
Przed przystąpieniem do wykonywania odczynu niektóre standardowo utrwalone i zatopione
w parafinie skrawki tkankowe muszą zostać poddane procedurze cieplnego odmaskowania epitopu
(HIER) przy uŜyciu roztworu do odmaskowania epitopu wskazanego w ulotce dołączonej do
opakowania przeciwciał pierwotnych. W przypadku niektórych pierwotnych przeciwciał zamiast
cieplnego odmaskowania epitopu naleŜy przeprowadzić trawienie enzymatyczne. NaleŜy pamiętać,
Ŝe odczynnik Dako REAL™ Proteinase K, nr kat. S2019, został opracowany z myślą o procedurach
z cieplnym odmaskowaniem epitopu w celu usprawnienia wsadowego przetwarzania preparatów.
Do blokowania aktywności endogennej peroksydazy naleŜy uŜywać odczynnika Dako REAL™
Peroxidase-Blocking Solution, nr kat. S2023, lub Dako Dual Endogenous Enzyme Block, nr kat.
S2003.
Z uwagi na zastosowanie wysoce skutecznej procedury płukania i obecność białek stabilizujących
w składzie odczynników Dako nie jest konieczne wykonywanie dodatkowych procedur blokujących
w celu osłabienia nieswoistego odczynu tła.
Zaleca się stosowanie buforu płuczącego Dako właściwego dla konkretnego aparatu Dako.
Zestaw nie zawiera przeciwciał pierwotnych. Zalecamy stosowanie przeciwciał z serii Dako N-Series
Ready-to-Use Primary Antibodies lub stęŜonych przeciwciał pierwotnych Dako.
System Dako REAL™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse działa w oparciu
o metodę pośredniego wykorzystania streptawidyny-biotyny. Wykazano, Ŝe metoda ta zapewnia
większą czułość niŜ inne analogiczne metody. Odczynnik będący biotynylowanym przeciwciałem
wtórnym reaguje tak samo zarówno z immunoglobulinami króliczymi, jak i mysimi, a zatem
z pierwotnymi przeciwciałami króliczymi i mysimi moŜna stosować ten sam odczynnik wtórny.
Przeciwciała wtórne zostały optymalnie oznakowane biotyną przy uŜyciu 7-atomowego „spacera”.
Pozwala to na wejście kaŜdego biotynylowanego przeciwciała w reakcję z kilkoma cząsteczkami
streptawidyny skoniugowanymi z peroksydazą, a tym samym poprawia czułość systemu
wykrywania. Wchodząca w skład zestawu streptawidyna skoniugowana z peroksydazą została
sporządzona ze streptawidyny wyizolowanej z Streptomyces avidinii oraz wysoce oczyszczonej
peroksydazy chrzanowej. Koniugacja przeprowadzana jest udoskonaloną dwustopniową metodą
glutaraldehydową. PoniewaŜ punkt izoelektryczny streptawidyny jest bliski pH obojętnemu, moŜliwe
jest uniknięcie nieswoistych interakcji jonowych ze składnikami badanego preparatu. Odczynnik
zawierający biotynylowane przeciwciała wtórne oraz streptawidyna skoniugowana z peroksydazą
dostarczane są w zestawie jako gotowe do uŜycia odczynniki w butelkach z zakraplaczem. Przed
uŜyciem naleŜy je wlać do odpowiednich zbiorników aparatu.
System substratu składa się z dwóch składników, DAB+ Chromogen, stęŜonego roztworu
diaminobenzydyny (DAB), oraz HRP Substrate Buffer zawierającego nadtlenek wodoru. Przed
uŜyciem DAB+ Chromogen naleŜy rozcieńczyć w buforze HRP Substrate Buffer. Produkt reakcji
(129662-001)
P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 4/9
systemu substratu ma kolor intensywnie brązowy i zlokalizowany jest w miejscu występowania
antygenu.
Zalecanymi barwnikami kontrastowymi są odczynniki Dako REAL™ Hematoxylin, nr kat. S2020, lub
Hematoxylin for the Dako Autostainer, nr kat. S3301, które zapewniają wyrazisty niebieski odczyn
jądrowy.
Wybarwione skrawki tkankowe moŜna zatopić w środku wodnym lub opartym na rozpuszczalniku
organicznym.
Odczynniki
A. Dostarczane materiały
Butelka A
Dako REAL™ Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2)
100 mL, gotowy do uŜycia
Biotynylowane kozie immunoglobuliny przeciwko antygenom
mysim i króliczym. W buforowanym roztworze zawierającym białko
stabilizujące i azydek sodu.
Odczynnik ten moŜe mieć róŜny kolor, od wyraźnie Ŝółtego do
bezbarwnego, nie ma to jednak wpływu na działanie zestawu.
Butelka B
Dako REAL™ Streptavidin Peroxidase (HRP)
100 mL, gotowy do uŜycia
Streptawidyna skoniugowana z peroksydazą chrzanową.
W buforowanym roztworze zawierającym białko stabilizujące i
środek konserwujący.
Butelka C
Dako REAL™ DAB+ Chromogen
5 mL, koncentrat 50x
Tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny w rozpuszczalniku
organicznym.
Odczynnik ten moŜe mieć róŜny kolor, od wyraźnie fioletowego do
bezbarwnego, nie ma to jednak wpływu na działanie zestawu.
Butelka D
Dako REAL™ HRP Substrate Buffer
250 mL, gotowy do uŜycia
Buforowany roztwór zawierający nadtlenek wodoru i środek
konserwujący.
B. Materiały wymagane, ale niedostarczane
Automaty Dako do wykonywania odczynów immunohistochemicznych
Bufor płuczący Dako właściwy dla konkretnego aparatu Dako
Dako REAL™ Peroxidase-Blocking Solution, nr kat. S2023, lub Dual Endogenous Enzyme Block,
nr kat. S2003
Dako REAL™ Proteinase K, nr kat. S2019, rozcieńczony w Dako REAL™ Proteinase K Diluent,
nr kat. S2032, lub Proteinase K (Ready-to-Use), lub S3020 (w razie potrzeby)
Dako N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies lub inne stęŜone pierwotne przeciwciała królicze
lub mysie dostarczone przez firmę Dako
(129662-001)
P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 5/9
N-Series Ready-to-Use Rabbit or Mouse Universal Negative Control lub inny stosowny odczynnik
kontroli ujemnej dla przeciwciał pierwotnych
Dako REAL™ Antibody Diluent, nr kat. S2022 (do rozcieńczania stęŜonych przeciwciał)
Dako REAL™ Hematoxylin, nr kat. S2020 lub Hematoxylin for the Dako Autostainer, nr kat. S3301
Roztwór do odmaskowania antygenu. Zob. ulotka dołączona do opakowania przeciwciał
pierwotnych.
Dako REAL™ Incubation Container, nr kat. S2030 (opcjonalnie)
Dako REAL™ Slide Holder, nr kat. S2029 (opcjonalnie)
Przybory do aparatu Dako
Szkiełka mikroskopowe
Odczynniki laboratoryjne ogólnego zastosowania do usuwania wosku z preparatów zatopionych
w parafinie
Środek do zatapiania (wodny lub oparty na rozpuszczalniku organicznym) i szkiełka nakrywkowe
Środki ostroŜności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
2. Butelka A, Dako REAL™ Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), zawiera materiał
pochodzący od ssaków. Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego
z materiału biologicznego, naleŜy stosować odpowiednie procedury postępowania.
3. Butelka A, Dako REAL™ Link, Biotinylated Secondary Antibodies (AB2), zawiera silnie
toksyczny związek — czysty azydek sodu (NaN3). StęŜenie NaN3 występujące w produkcie nie
jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub miedzią,
wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki
metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do przepłukiwania, aby
uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
4. Nie wystawiać butelki C, Dako REAL™ DAB+ Chromogen ani roztworu roboczego substratów
(CHROM) na działanie intensywnego światła.
5. Butelka C, Dako REAL™ DAB+ Chromogen, zawiera ≥5-<10% biphenyl-3,3',4,4'tetrayltetraammonium tetrachloride i jest oznaczona:
Niebezpieczeństwo
MoŜe powodować raka.
Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne.
Przed uŜyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŜności.
Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę
twarzy. Stosować odzieŜ ochronną.
P308 + P313
W PRZYPADKU naraŜenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc
lekarską.
P405
Przechowywać pod zamknięciem.
P501
Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi,
krajowymi i międzynarodowymi przepisami.
Jako zasadę naleŜy przyjąć zakaz pracy z produktem osobom w wieku poniŜej 18 lat.
UŜytkowników naleŜy starannie poinstruować co do właściwych procedur pracy,
niebezpiecznych własności produktu i środków ostroŜności. Dodatkowe informacje zawiera
Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej.
6. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem
odczynnika ze skórą bądź oczami.
7. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi
i krajowymi.
H350
H341
P201
P280
(129662-001)
P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 6/9
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na
opakowaniu. Nie łączyć elementów zestawów z róŜnych partii. JeŜeli odczynniki są przechowywane
w warunkach innych niŜ podane w ulotce dołączonej do opakowania, UŜytkownik powinien je
zweryfikować. Przygotowany bufor roboczy substratów (CHROM) powinien być przechowywany
w ciemności, w temperaturze 2–8 °C, i zuŜyty w ciągu 5 dni. W wypadku nieoczekiwanego wyniku
odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się
problem z produktem, naleŜy się skontaktować z naszym działem wsparcia technicznego.
Przygotowanie odczynników
Roztwór roboczy substratów (CHROM)
Roztwór roboczy substratów (CHROM) zawierający DAB przygotowuje się, dokładnie mieszając
20 µL odczynnika DAB+ Chromogen (butelka C) z 1 mL buforu HRP Substrate Buffer (butelka D).
Przygotować tylko objętość wymaganą dla liczby barwionych próbek. Roztwór CHROM naleŜy
zuŜyć w ciągu 5 dni (przechowywać w ciemności, w temperaturze 2–8 °C).
Instrukcje przygotowywania odczynników niewchodzących w skład zestawu podano w dokumentacji
dołączonej do tych odczynników.
Pobieranie i przygotowanie próbek
Zestaw moŜe być uŜywany do wykonywania odczynów na standardowo utrwalonych, zatopionych
w parafinie skrawkach tkankowych i skrawkach mroŜakowych.
Do konserwacji próbek moŜna uŜyć róŜnych utrwalaczy. Próbek nie naleŜy utrwalać w obojętnej
zbuforowanej formalinie przez czas przekraczający 24 godziny, a w miarę moŜliwości czas
utrwalania powinien być jak najkrótszy.
Optymalna grubość skrawków zatopionych w parafinie wynosi około 4 µm.
Optymalna grubość skrawków mroŜakowych wynosi 4–6 µm.
Próbki naleŜy zatapiać na szkiełkach mikroskopowych. Próbki powinny być umieszczone na
szkiełkach maksymalnie płasko i bez fałdowania. Zbyt duŜe pofałdowanie będzie miało wpływ na
wynik odczynu.
UWAGA: NaleŜy uŜywać szkiełek mikroskopowych o szerokości odpowiedniej dla aparatu Dako.
Informacje na temat wymaganych parametrów szkiełek mikroskopowych moŜna znaleźć w instrukcji
obsługi uŜywanego aparatu Dako.
Skrawki parafinowe naleŜy zatapiać z podgrzanej łaźni wodnej z wodą destylowaną lub dejonizowaną.
Łaźnia wodna nie powinna zawierać Ŝadnych dodatków (takich jak Ŝelatyna, poli-L-lizyna itp.). Skrawki
powinny być suszone przez ogrzewanie, zasadniczo w temperaturze nieprzekraczającej 60 °C przez
co najmniej 60 minut (np. przez noc). Aby zapewnić właściwe przyleganie skrawków do szkiełek,
waŜne jest osuszenie wody spod skrawków przed rozpoczęciem suszenia.
Procedura
W automatach Dako do wykonywania odczynów immunohistochemicznych stosowane są róŜne
techniki umoŜliwiające uzyskanie optymalnych wyników barwienia. Przed uŜyciem wybranego
protokołu w automatach Dako naleŜy dokładnie zapoznać się z instrukcją obsługi odpowiedniego
automatu Dako.
Po odparafinowaniu i nawodnieniu buforem (wodą) większość skrawków tkankowych wymagać
będzie cieplnego odmaskowania epitopu. Zaleca się przyjęcie i stosowanie standardowej procedury
cieplnego odmaskowania epitopu, tak aby dawała ona powtarzalne wyniki. Zaleca się zapełnianie
zawsze wszystkich pozycji podajnika na szkiełka, nawet jeśli tylko na jednym szkiełku znajduje się
preparat; dzięki temu w kaŜdej serii odczynów skrawki będą tak samo ogrzewane, a tym samym
obróbka wstępna będzie przebiegała zawsze w tych samych warunkach. Po zakończeniu etapu
odmaskowania epitopu skrawki naleŜy pozostawić w buforze na co najmniej 20 minut w
(129662-001)
P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 7/9
temperaturze pokojowej. W tym czasie, przeznaczonym na schłodzenie, automat Dako do
wykonywania odczynów immunohistochemicznych moŜna przygotować do serii odczynów. Niektóre,
nieliczne epitopy nie są odporne na cieplne odmaskowanie. Odpowiednie instrukcje obróbki
wstępnej moŜna znaleźć w ulotce dołączonej do opakowania uŜywanych przeciwciał pierwotnych
Dako.
Inkubacja z przeciwciałami pierwotnymi
Przeciwciała pierwotne Dako N-series, Ready-to-Use Primary Antibodies mogą być uŜywane
z systemem Dako REAL™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse do skrawków
utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie.
W ulotkach dołączanych do opakowań poszczególnych stęŜonych przeciwciał pierwotnych Dako
podane są wytyczne dotyczące rozcieńczania stęŜonych przeciwciał Dako i obróbki wstępnej
proteinazą K, gdy przeciwciała te uŜywane są razem z systemem Dako REAL™ Detection System,
Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse do skrawków utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie.
StęŜone przeciwciała pierwotne moŜna rozcieńczać w odczynniku Dako REAL™ Antibody Diluent,
nr kat. S2022.
Szkiełka umieszczane są w aparacie Dako i barwione przy uŜyciu szablonu/protokołu
przeznaczonego specjalnie dla systemu Dako REAL™ Detection System, Peroxidase/DAB+,
Rabbit/Mouse, nr kat. K5001. Jeśli odpowiedni szablon/protokół nie jest zdefiniowany w uŜywanym
aparacie Dako, naleŜy skontaktować się z naszym działem wsparcia technicznego.
Przed pierwszym uŜyciem systemu detekcji Dako REAL™ Detection System, Peroxidase/DAB+,
Rabbit/Mouse w aparacie Dako Autostainer naleŜy dodać odczynniki wymienione w tabeli 1 do listy
odczynników aparatu.
Tabela 1. Konieczne uzupełnienia listy odczynników i optymalne czasy inkubacji
Odczynnik
Nr kat.
Sugerowana nazwa
skrócona
Etap szablonu
Czas
HP Block
Blokada enzymów
endogennych
5 minut
Pro K
Obróbka wstępna
przed
zastosowaniem
przeciwciała
10 minut
Przeciwciało
10*–25 minut
inkubacji
Dako REAL™ Peroxidase-Blocking Solution
lub
Dual Endogenous Enzyme Block
Dako REAL™ Proteinase K Solution
lub
Dako Proteinase K
S2023
lub
S2003
S2019 + S2032
Przeciwciała pierwotne
Indywidualne
Dako REAL™ Detection System
K5001
K5001LIN
Drugi odczynnik
15 minut
K5001
K5001HRP
Trzeci odczynnik
15 minut
K5001
K5001DAB
Substrat
3 minuty (2 razy)
Pomocniczy
1–2 minut
Pomocniczy
1–5 minut
5 minut
S2030
-
Link, Biotinylated Secondary Antibodies
(AB2)
Dako REAL™ Detection System,
Streptavidin Peroxidase (HRP)
Dako REAL™ Detection System (DAB+)
Dako REAL™ Hematoxylin
S2020
lub
Dako Hematoxylin for the Dako Autostainer
S3301
Blueing Buffer (= bufor automatu Autostainer) S3006
-
* N-Series Ready-to-Use Primary Antibodies
W przypadku pozostałych aparatów Dako nazwy odczynników i czasy inkubacji są wstępnie
zaprogramowane w szablonach/protokołach.
Kontrola jakości
W kaŜdej serii odczynów naleŜy uwzględnić jedną dodatnią próbkę kontrolną, co pozwoli
potwierdzić prawidłowe działanie wszystkich zastosowanych odczynników. JeŜeli za pomocą kontroli
(129662-001)
P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 8/9
dodatniej nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu, naleŜy uznać, Ŝe wyniki preparatów
badanych są niewaŜne.
Do kaŜdej próbki naleŜy zastosować odczynnik kontroli ujemnej w celu wykrycia ewentualnego
odczynu nieswoistego. Jeśli nie jest moŜliwe jednoznaczne odróŜnienie odczynu nieswoistego od
swoistego, naleŜy uznać, Ŝe wyniki preparatów badanych są niewaŜne.
Zalecane odczynniki do kontroli ujemnej to Negative Control for N-Series Rabbit Primary Antibodies,
nr kat. N1699, lub Negative Control for N-Series Mouse Primary Antibodies, nr kat. N1698.
Interpretacja wyników
Roztwór roboczy substratów (CHROM) zawierający diaminobenzydynę powoduje brązowe
zabarwienie w miejscach występowania antygenów rozpoznawanych przez przeciwciała pierwotne.
Brązowe zabarwienie powinno być widoczne w dodatniej próbce kontrolnej w oczekiwanych
miejscach występowania antygenu.
Jeśli dojdzie do powstania odczynu nieswoistego, moŜna będzie go rozpoznać jako rozmyte,
brązowe odczyny na szkiełkach poddanych działaniu odczynnika kontroli ujemnej. Jądra
komórkowe w barwieniu kontrastowym hematoksyliną barwią się na niebiesko.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Zawartość wystarcza na <n>
testów
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
Harmful (środek szkodliwy)
Producent:
Dako Denmark A/S
Produktionsvej 42
DK-2600 Glostrup
Dania
Tel. +45 44 85 95 00
Faks+45 44 85 95 95
(129662-001)
P04097PL_01_K500111-2/2015.10 str. 9/9