Walidacja metod molekularnych przeznaczonych do laboratoryjnej

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2009 • Volume 45 • Number 2 • 163-165
Praca poglądowa • Review Article
Walidacja metod molekularnych przeznaczonych
do laboratoryjnej diagnostyki genetycznej
Łukasz Łaczmański1, Izabela Łaczmańska2
1
Katedra i Klinika Endokrynologii, Diabetologii i Leczenia Izotopami, 2 Katedra i Zakład Genetyki, Akademia Medyczna we Wrocławiu
Streszczenie
W ostatnich latach obserwowany jest ogromny rozwój technik biologii molekularnej. Wraz z pojawianiem się nowych metod
oraz ich wprowadzeniem do diagnostyki medycznej stworzono regulacje prawne określające warunki ich wykorzystania do
diagnostyki in vitro. Jednym z podstawowych elementów jest wymóg walidacji – metody jednoznacznie potwierdzającej wiarygodność stosowanego testu diagnostycznego.
Validation of diagnostic test in molecular genetics tests
Summary
Recently an intensive development of molecular biology methods has been observed. With the development of new technologies and their application in medical diagnostics some legal regulations were introduced. One of them is validation – the
method for confirming reliability of a diagnostic test.
Słowa kluczowe:walidacja, diagnostyka, metody molekularne
Key words:validation, diagnostics, molecular methods
Wstęp
W ciągu ostatnich lat metody biologii molekularnej stały się
jednym z głównych narzędzi laboratoryjnej diagnostyki genetycznej (badanie genomu człowieka) oraz mikrobiologicznej (identyfikacja mikroorganizmów, oznaczenia ilościowe).
Równocześnie z nowymi odkryciami naukowymi ulegają
poszerzeniu możliwości diagnostyczne, a co za tym idzie,
tworzone są nowe testy do badania określonych zmian lub
pojawiają się nowe nie stosowane wcześniej metody, które powinny spełniać odpowiednie warunki prawne. Według
obecnych uregulowań genetyczne laboratorium diagnostyczne podlega ustawie o diagnostyce laboratoryjnej oraz
wymogom rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 23. 03.
2006 r. w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych [8].
Jednym z wymagań opisanych w ww. rozporządzeniu jest
zastosowanie w diagnostyce in vitro testów o odpowiedniej jakości, oznaczonych znakiem CE (CE mark) – czyli
przeznaczonych do obrotu medycznego w krajach Wspólnoty Europejskiej. Rozporządzenie to dopuszcza jednak
używanie do diagnostyki testów przeznaczonych do badań
naukowych, tzw. research use only oraz testów opracowanych samodzielnie w danym laboratorium, pod warunkiem
przeprowadzenia ich pełnej walidacji. Walidacja jest również
podstawowym wymogiem spełnienia standardów opisanych
w normach europejskich: ISO 17025 i ISO 15189 [6, 7]. Według tych norm walidacja jest jedynym jednoznacznym potwierdzeniem jakości diagnostycznej stosowanego testu.
Opisane poniżej procedury zostały przygotowane według
wytycznych zawartych w podręczniku: Good Laboratory
Practice (GLP) [4] oraz w Clinical Laboratory Improvement
Amendments (CLIA) [3].
Jedną z podstawowych technik biologii molekularnej jest
PCR (Polymerase Chain Reaction), umożliwiająca specyficzne namnożenie badanego odcinka DNA. Jest to główna
reakcja wielu metod diagnostycznych (np. wykrywanie mutacji punktowych/polimorfizmów, badanie poziomu ekspresji
genów, analiza jakościowa i ilościowa mikroorganizmów)
oraz podstawa wielu technik molekularnych (Real-time PCR,
PCR-RFLP, MS-PCR) [5].
Jednym z podstawowych warunków wykonywania testów
diagnostycznych wykorzystujących technikę PCR jest stosowanie kontroli pozytywnej i negatywnej. Powinna ona być
wykonywana dla każdej kolejnej partii oznaczeń. Kontrola
pozytywna daje informację o jakości stosowanych odczynników oraz poprawności przeprowadzonej reakcji. Jako
kontroli negatywnej powinno się używać systemu NTC (No
Template Control), czyli próbki pozbawionej materiału gene163
Walidacja metod molekularnych przeznaczonych do laboratoryjnej diagnostyki genetycznej
tycznego. Stosowanie kontroli negatywnej pozwala na weryfikację, czy nie doszło do kontaminacji odczynników obcym
materiałem genetycznym.
W przypadku metod kilkuetapowych, których typowym przykładem są metody molekularne, wymogiem jest przeprowadzenie procedury walidacyjnej oddzielnie do każdego z etapów (np. izolacji materiału, PCR, detekcji produktu reakcji).
Walidacja jakościowych metod molekularnych
Walidacja jakościowych metod molekularnych może być:
• pełna – walidacja nowych metod opracowanych w laboratorium;
• skrócona – walidacja polegająca na adaptacji komercyjnych, niecertyfikowanych testów diagnostycznych dostępnych na rynku.
Proces walidacyjny polega na określeniu szeregu parametrów opisujących jakość sprawdzanego testu. W przypadku
walidacji pełnej są to [2]:
• czułość,
• swoistość,
• powtarzalność,
• odtwarzalność,
• czułość analityczna,
• rzetelność.
Jako kontrolny materiał diagnostyczny powinny być stosowane tzw. próbki referencyjne (MR – Materiał Referencyjny).
Są to próbki zawierające DNA lub RNA pacjentów o znanych właściwościach genetycznych i o określonym stężeniu,
które posiadają badaną mutację/polimorfizm. Dostępne są
komercyjnie z oznaczeniem CE (do diagnostyki medycznej).
W przypadku niemożności zdobycia takich próbek dopuszcza się użycie jako MR materiału pochodzącego od pacjentów pod warunkiem określenia badanej cechy inną metodą
diagnostyczną.
Parametry walidacyjne mogą być określane w następujący
sposób:
1. Czułość (C) – określa prawdopodobieństwo wyniku pozytywnego dla badanej cechy (np. obecność danej mutacji),
wyrażone stosunkiem wyników prawdziwie dodatnich (PD)
do sumy wyników prawdziwie dodatnich i fałszywie ujemnych (FU):
PD
C = ––––––––––––
(PD+FU)
Otrzymane wartości mieszczą się w zakresie od 0 do 1, przy
czym 1 jest wartością najbardziej pożądaną. Test ten przeprowadza się, wykorzystując materiał referencyjny (MR),
czyli próbki posiadające badaną zmianę (np. mutację).
Przykład: Materiałem do badania jest DNA co najmniej 10
pacjentów z populacji z określoną zmianą (np. daną mutacją), zdiagnozowaną wcześniej (MR). Należy wykonać badanie dla tej populacji, po czym obliczyć C. Otrzymana wartość
określa prawdopodobieństwo uzyskania wyniku prawdziwie
dodatniego dla badanej zmiany (np. obecność mutacji) przy
użyciu tej metody.
164
2. Swoistość (S) – określa prawdopodobieństwo wyniku
negatywnego dla badanej cechy; wyrażona jest stosunkiem
wyników prawdziwie ujemnych (PU) do sumy wyników prawdziwie ujemnych i fałszywie dodatnich (FD):
PU
S = –––––––––––––
(PU + FD)
Otrzymane wartości mieszczą się w zakresie od 0 do 1, przy
czym 1 jest wartością najbardziej pożądaną. Test ten wykonuje się, wykorzystując materiał referencyjny (MR).
Przykład: Materiałem do badania jest DNA co najmniej 10
pacjentów z populacji bez określonej zmiany (np. bez danej
mutacji), co zdiagnozowano wcześniej (MR). Należy wykonać badanie dla tej populacji, po czym obliczyć S. Otrzymana wartość określa prawdopodobieństwo uzyskania wyniku
prawdziwie ujemnego dla badanej zmiany (np. brak mutacji)
przy użyciu tej metody.
3. Powtarzalność (P) – określa powtarzalność wyników dla
tej samej próbki w obrębie jednej serii pomiarów przeprowadzanych w jednym dniu przez jednego pracownika; przeprowadza się ten test poprzez wielokrotne (minimum 10-krotne)
badanie materiału pochodzącego od tego samego pacjenta.
Przykład: Materiałem do badania jest co najmniej 10 próbek DNA jednego pacjenta 1) bez badanej zmiany (wild type
- „wt”) – homozygota; 2) z badaną zmianą w obu allelach
(mutacja/polimorfizm) – homozygota; 3) z badaną zmianą
w jednym z alleli – heterozygota; i ewentualnie 4) z badaną
zmianą w jedynym allelu (hemizygota) – co zdiagnozowano
wcześniej (MR). Należy wykonać badanie kolejno dla tych
populacji w jednym czasie, na danym sprzęcie, po czym obliczyć P. Badanie musi wykonać jeden pracownik. Otrzymana wartość określa powtarzalność wyników przy użyciu tej
metody [2].
4. Odtwarzalność (O) – określa powtarzalność wyników
otrzymywanych dla tej samej próbki w obrębie kilku serii pomiarów przeprowadzanych w różnych dniach, przez różnych
pracowników, z wykorzystaniem sprzętu od różnych producentów; badanie przeprowadza się w kilku seriach po minimum 10 testów dla próbki pochodzącej od tego samego pacjenta.
5. Rzetelność testu (RZ) – określa czułość testu na zmiany środowiska reakcji; mogą one dotyczyć użycia różnego
sprzętu, odczynników pochodzących od różnych producentów, warunków zewnętrznych itp.; wyznacza się tę wartość
poprzez określenie odtwarzalności w różnych warunkach
reakcji. Rzetelność pozwala określić, czy istnieją różnice
w wynikach badań otrzymanych daną metodą, w zależności od warunków zewnętrznych, niewynikających z zasady
metody.
6. Czułość analityczna (CA) – określa najmniejsze stężenie badanego materiału (np. DNA pacjenta), który daje jednoznaczny wynik stosowanej metody; wyznacza się tę wartość poprzez przeprowadzenie szeregu reakcji z użyciem
rozcieńczeń badanego materiału.
Walidację pełną należy zastosować dla testów/metod opra-
Ł. Łaczmański i I. Łaczmańska
cowanych własnoręcznie oraz takich, które zostały opisane
w literaturze.
W przypadku, gdy test diagnostyczny jest dostępny komercyjnie, posiada walidację, ale nie ma certyfikacji (oznaczenia
CE), należy przeprowadzić tzw. walidację skróconą. Pomija
ona oznaczenia czułości i specyficzności, natomiast obejmuje testy powtarzalności, odtwarzalności, rzetelności i czułości analitycznej według metod opisanych powyżej.
W przypadku, gdy zestaw diagnostyczny posiada oznaczenie CE walidacja nie jest potrzebna. Warunkiem zaniechania walidacji (certyfikat CE) lub przeprowadzenia walidacji
skróconej jest dokładne postępowanie według instrukcji dołączonej do testu i używania sprzętu zalecanego przez producenta zestawu. Jeżeli z powodów technicznych musi nastąpić zmiana procedury diagnostycznej (np. użycie sprzętu
innego producenta), należy przeprowadzić pełną walidację
metody.
Walidacja ilościowych metod molekularnych
W przypadku metod ilościowych procedura walidacyjna jest
podobna do opisanej powyżej dla metod jakościowych. Polega ona również na wyznaczeniu podstawowych parametrów: czułości, swoistości, powtarzalności, odtwarzalności,
czułości analitycznej, rzetelności oraz dwóch dodatkowych:
zakresu pomiaru oraz precyzji. W przypadku oznaczania
powtarzalności i odtwarzalności należy zastosować przynajmniej pięciokrotne powtórzenie 3 próbek o różnym stężeniu.
Stężenia powinny być dobrane tak, by mieściły się w środku
zakresu pomiaru [2]. Do walidacji należy używać materiału
referencyjnego (MR) o określonej wielkości badanej cechy
(np. liczba kopii DNA wirusa/ml krwi pacjenta).
Aby wyznaczyć precyzję testu należy wyliczyć odchylenie
standardowe lub współczynnik wariancji dla serii pomiarów
wykonanych dla różnych stężeń badanej próbki i określić,
które stężenie jest optymalne. Należy wybrać takie stężenie
badanej próbki, dla którego precyzja jest największa.
Zakres pomiaru oznacza się dla pewnej założonej wartości precyzji. Parametr ten określa minimalne i maksymalne
stężenie materiału, dla którego można wykonać oznaczenie
z założoną precyzją.
Podobnie jak w przypadku metod jakościowych, zestawy do
badań ilościowych oznaczone znakiem CE nie wymagają
walidacji pod warunkiem dokładnego przestrzegania załączonej do nich instrukcji. Zestawy komercyjne posiadające
walidację, ale nieposiadające oznaczenia CE można stoso-
wać do diagnostyki pod warunkiem postępowania zgodnie
z instrukcją oraz przeprowadzenia walidacji skróconej (oznaczenia: powtarzalności, odtwarzalności, precyzji i zakresu
pomiaru) [2].
Według obowiązującego w Polsce prawa walidacja metod
m.in. biologii molekularnej stosowanych w diagnostyce in
vitro jest obligatoryjna. Warto ją także przeprowadzać dla
badań naukowych, ponieważ jest to jedyna metoda bezpośrednio potwierdzająca wiarygodność używanego testu.
Z dniem 1 kwietna 2009 została wprowadzona zmiana rozporządzenia Ministra Zdrowia projekt z dnia 21.07.2008
dotycząca wymogów, które musi spełniać genetyczne laboratorium diagnostyczne. Na mocy tego rozporządzenia
został wprowadzony bezwzględny wymóg walidacji metod
biologii molekularnej wykorzystywanych do celów diagnostycznych [1].
Podziękowania.
Autorzy pragną podziękować Karolinie A. Pesz za cenne
uwagi dotyczące niniejszej pracy.
Piśmiennictwo
1. http://www.mz.gov.pl/wwwmz/index?mr=m491&ms=0&ml=pl&mi=56&mx=0&mt=&my=131&ma=011192
2. http://www.uhkt.cz/files/nrl-dna/blp/anal_validation.pdf
3. http://wwwn.cdc.gov/clia/
4. Jiang W. Good Laboratory Practice in Analytical Laboratory.
Journal of American Science 2005; 1: 93-94.
5. Łaczmańska Ł, Pesz K, Łaczmański Ł. Application of Selected
Methods Based on the Polymerase Chain Reaction in Medical
Molecular Diagnostics. Adv Clin Exp Med 2009; 18, 1: 85-92.
6. PN/EN ISO 15189
7. PN/EN ISO 17025
8. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 23 marca 2006 r.
w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów
diagnostycznych i mikrobiologicznych, Dz.U.06.61.435, http://
www.mz.gov.pl/wwwmz/index?mr=q101&ms=1&ml=pl&mi=436&mx=0&mt=&my=436&ma=05925
Adres Autorów:
Katedra i Klinika Endokrynologii,
Diabetologii i Leczenia Izotopami
Akademia Medyczna we Wrocławiu
ul. Pasteura 4
50-367 Wrocław
[email protected]
(Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-02-12)
(Praca przekazana do opublikowania: 2009-05-08)
165