Ćwiczenie nr 13

XIII. Staphylococcus, Micrococcus – ćwiczenia praktyczne
Ćwiczenie 1. Ocena wzrostu szczepów gronkowców na:
a. agarze z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi baraniej (AK)
typ hemolizy………………………………………………………
morfologia
kolonii………………………………………………..…
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………………………………………………...
b. podłożu Chapmana (Ch)
…………………….………………………………………………..…
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
………………………………………………………………………...
Ćwiczenie 2. Wykonanie preparatu mikroskopowego barwionego metodą Grama
Wykonanie ćwiczenia:
Opis wykonania ćwiczenia przy temacie IV. Budowa komórki bakteryjnej i metody barwienia
preparat bawiony metodą Grama
Opis preparatu:
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
Ćwiczenie 3. Oznaczanie cech biochemicznych gronkowców i mikrokoków - wykonanie
próby na katalazę
Wykonanie ćwiczenia:
Opis wykonania ćwiczenia przy temacie VI. Fizjologia bakterii
Szczep badany
………………………………..
…………………………………….
obserwowane wyniki
Wnioski ......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………………
………………………………………………………………………………………………….
Ćwiczenie 4. Różnicowanie gronkowców i mikrokoków za pomocą testu z furazolidonem
Zasada metody: Szczepy gronkowców są wrażliwe na furazolidon. Szczepy mikrokoków są
oporne na furazolidon.
Wykonanie oznaczenia:
1. Czystą hodowlę (pojedynczą kolonię) badanego szczepu, zidentyfikowanego jako
gronkowiec koagulazo-ujemny, o gęstości około 0,5 McFarlanda posiać na podłoże
Mullera-Hintona a następnie nałożyć krążek bibułowy nasycony 100 µg furazolidonu
(można wykonać identyfikację kilku szczepów równocześnie, posiewając badane
szczepy promieniście i nakładając krążek centralnie na płytkę).
2. Płytki z nałożonymi krążkami należy preinkubować przez 15 minut w temperaturze
pokojowej, następnie hodowlę inkubować 18-24 godzin, w temperaturze 35° C, w
atmosferze tlenowej.
3. Odczytać wielkość strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z furazolidonem.
Wielkość ≥ 15 mm świadczy o wrażliwości na furazolidon.
Micrococcus spp.
furazolidon 100µg
Staphylococcus spp.
Wnioski:
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………….
Ćwiczenie 5. Różnicowanie gronkowców koagulazododatich i koagulazoujemnych za
pomocą próby na koagulazę
Koagulaza jest enzymem uwalnianym do otoczenia przez niektóre szczepy gronkowców, np.:
gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus). Działa ona podobnie jak protrombina i
zawarty w osoczu fibrynogen przekształca w fibrynę. W wyniku tej reakcji osocze ulega
wykrzepianiu.
Wykonanie:
1. Próbę na koagulazę wykonuje się w małych, wąskich probówkach.
2. Używa się świeżego lub liofilizowanego osocza króliczego rozcieńczonego w
stosunku 1:5 roztworem 0,9% NaCl (zgodnie z instrukcją dołączoną przez
producenta).
3. Do 0,5 ml osocza króliczego dodaje się 1 pełne oczko ezy 18-24 godzinnej hodowli
bakteryjnej.
4. Próbę inkubuje się przez 4 godziny w temperaturze 370C.
5. O dodatniej próbie świadczy powstanie skrzepu.
6. W przypadku próbek ujemnych (osocze pozostaje płynne) inkubację przedłuża się do
18 godzin i ponownie odczytuje wynik.
Należy pamiętać, że szczepy gronkowców koagulazododatnich mogą wytwarzać
fibrynolizynę, która upłynnia powstały skrzep (wynik fałszywie ujemny).
Badany szczep
……………………………
wynik
……………………………..
Wnioski ......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………………
………………………………………………………………………………………………….
Ćwiczenie 6. Identyfikacja szczepu Staphylococcus aureus z wykorzystaniem testu
Staphytect plus.
Zasada metody: STAPHYTECT PLUS firmy Oxoid – lateksowy test oparty na reakcji
aglutynacji, umożliwia detekcję S. aureus, na podstawie wykrycia trzech antygenów: białka
A, czynnika CF, polisacharydu wykrytego u szczepów MRSA.
Wykonanie:
1. Doprowadzić odczynniki lateksowe do temperatury pokojowej. Zawartość
opakowania dokładnie wymieszać, poprzez energiczne wstrząśnięcie.
2. Wycisnąć po 1 kropli odczynnika lateksowego na jednym z okręgów znajdujących się
na karcie reakcji.
3. Jałową ezą pobrać ok. 5 kolonii gronkowcowych, pochodzących z 24 godzinnej
hodowli na agarze krwawym. Bakterie przenieść i kolistymi ruchami ezy
rozprowadzić w odczynniku lateksowym.
4. Poruszając kartą reakcyjną do 20 sekund obserwować aglutynację w normalnych
warunkach oświetleniowych. Nie używać szkła powiększającego.
5. W taki sam sposób postępować z pozostałymi do badań koloniami gronkowców.
6. Po zakończeniu testu karty reakcji bezpiecznie przenieść i umieścić w pojemnikach/
workach przeznaczonych do utylizacji.
Kontrolę dodatnią i ujemną przeprowadzić w analogiczny sposób używając odpowiednio
szczepów:
Staphylococcus aureus ATCC 25923 i Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
Wyniki:
Badany szczep
……………………………..
………………………………
Wynik
Wnioski ......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………………
………………………………………………………………………………………………….
Ćwiczenie 7. Różnicowanie gronkowców koagulazoujemnych (CNS) za pomocą testu z
nowobiocyną
Zasada metody: Gronkowce koagulazo-ujemne różnicuje się na dwie grupy w zależności od
wrażliwości na nowobiocynę. Do grupy nowobiocynoopornych należy grupa Staphylococcus
saprophyticus, do grupy nowobiocynowrazliwych grupa Staphylococcus epidermidis.
Wykonanie oznaczenia:
1. Czystą hodowlę (pojedynczą kolonię) badanego szczepu, zidentyfikowanego jako
gronkowiec koagulazo-ujemny, o gęstości około 0,5 McFarlanda posiać na podłoże
Mullera-Hintona a następnie nałożyć krążek bibułowy nasycony 2 µg nowobiocyny
(można wykonać identyfikację kilku szczepów równocześnie, posiewając badane
szczepy promieniście i nakładając krążek centralnie na płytkę).
2. Płytki z nałożonymi krążkami należy preinkubować przez 15 minut w temperaturze
pokojowej, następnie hodowlę inkubować 18-24 godzin, w temperaturze 35° C, w
atmosferze tlenowej.
3. Odczytać wielkość strefy zahamowania wzrostu wokół krążka z nowobiocyną.
Staphylococcus epidermidis
nowobiocyna 2µg
Staphylococcus saprophyticus
Wnioski ......................................................................................................................................
………………………………………………………………………………….………………
………………………………………………………………………………………………….
Ćwiczenie 8. Interpretacja wyniku badania lekowrażliwości szczepu Staphylococcus spp.
a. opisz krążki
b. Dokonaj pomiaru stref zahamowania wzrostu wokół krążków.
Antybiotyk
symbol/dawka Strefa
na krążku
zahamowania
wzrostu w
mm
Interpretacja wyniku
c. Uzupełnij tabelkę o informacje dotyczące szczepów Staphylococcus spp.
Antybiogram podstawowy
Antybiogram rozszerzony
Oznaczane mechanizmy
oporności
Ćwiczenie 9. Interpretacja wyniku oznaczania mechanizmu oporności MLSB
Wykonanie oznaczenia wg ćwiczenia IX. Antybiotyki i chemioterapeutyki
Odczyt i interpretacja wyników:
W przypadku oporności na erytromycynę należy zwracać uwagę na spłaszczenie strefy
zahamowania wzrostu dookoła krążka z klindamycyną od strony krążka z erytromycyną
(kształt litery D) świadczące o indukcyjnym mechanizmie oporności MLSB.
Interpretacja wyników:
W przypadku stwierdzenia mechanizmu MLSB zarówno konstytutywnego, jak i
indukcyjnego, ze względu na ryzyko niepowodzenia terapeutycznego, w leczeniu nie
powinno się stosować: makrolidów, linkosamidów, streptogramin B.
……………………………….…………………….………………………………………………..……………………………..…………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….………………………………………………..…………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………………………..………